RNA干扰HMGA1基因表达对神经胶质瘤细胞增殖凋亡的影响及机制

目的 探讨RNA干扰HMGA1基因表达对神经胶质瘤细胞增殖凋亡的影响及机制。 方法 RT-PCR及Western blot检测神经胶质瘤组织中HMGA1的mRNA及蛋白表达;siRNA-NC、HMGA1-siRNA1、HMGA1-siRNA2转染人神经胶质瘤U251细胞,未转染任何siRNA作为空白对照组,48 h后检测各组细胞中HMGA1的蛋白表达;CCK8实验检测细胞增殖;流式细胞仪检测细胞凋亡;Western blot检测Ki67、PCNA、cleaved caspase-3、β-catenin、cyclin D1蛋白表达。 结果 神经胶质瘤组织中HMGA1基因的mRNA及蛋白表达均显著高于瘤旁组织(P<0.01);RNA干扰HMGA1基因能显著抑制其表达,HMGA1-siRNA2组的抑制效果更明显,选择作为后续研究;与对照组及siRNA-NC组比较,HMGA1-siRNA组细胞存活率及Ki67、PCNA、β-catenin、cyclin D1蛋白表达显著降低,细胞凋亡率及cleaved caspase-3蛋白表达显著升高(P<0.01)。 结论 HMGA1基因在神经胶质瘤组织中高表达,抑制其表达可通过下调Wnt/β-catenin信号通路抑制人神经胶质瘤U251细胞的增殖及促进凋亡。     

嗜中性活性肽-2(73)在人肝癌细胞株表达验证及分析

[目的]研究NAP-2(73)蛋白在人肝癌细胞株SMCC-7721和人肝正常细胞株HL-7702的表达差异,并初步探讨NAP-2(73)对肝癌作用的相关机制.[方法]运用蛋白免疫印迹(WB)对NAP-2(73)在人肝癌细胞株SMCC一7721和人肝正常细胞株HL-7702中的表达情况进行再验证,RT-PCR法检测NAP-2(73)mRNA水平的表达.[结果]验证结果证实,在肝癌细胞株中NAP-2(73)呈阳性表达,而在正常肝细胞株中无表达.Real-time PER结果显示肝癌细胞株中NAP-2(73)mRNA表达比正常肝细胞株增加了7倍.[结论]实验结果验证了初筛结果的可信性和生物信息学的分析和推测,提示NAP-2(73)可能是肝癌相关标志物.     

血管生成素-1对人绒毛膜外滋养细胞基质金属蛋白酶-2和基质金属蛋白酶-9表达的调控作用

目的分析血管生成素-1(Ang-1)对人绒毛膜外滋养细胞基质金属蛋白酶-2(MMP-2)和基质金属蛋白酶-9(MMP-9)表达的调控作用。方法将体外培养的人绒毛膜外滋养细胞株HTR8/SVneo分为空白对照组(未转染)、NC-siRNA组(转染阴性对照siRNA)及Ang-1-siRNA组(转染Ang-1 siRNA)。采用实时定量PCR法检测3组细胞中Ang-1 mRNA的表达,采用Western blot法检测Ang-1、MMP-2及MMP-9蛋白的表达,采用Transwell小室法检测细胞侵袭能力。结果转染48 h后,空白对照组Ang-1 mRNA表达水平为(1.36±0.04),NC-siRNA组Ang-1 mRNA表达水平为(0.98±0.07),Ang-1-siRNA组Ang-1 mRNA表达水平为(0.24±0.02),3组比较差异有统计学意义(F=257.128,P<0.001)。空白对照组Ang-1蛋白水平为(0.54±0.03),NC-siRNA组Ang-1蛋白水平为(0.49±0.07),Ang-1-siRNA组Ang-1蛋白水平为(0.12±0.06),3...     

NOD样受体介导炎症反应在不同胎龄及出生体重早产儿抗感染免疫中的作用和意义

目的 比较不同胎龄及出生体重早产儿NOD样受体(NOD1和NOD2)和炎症因子IL-6、TNF-α表达的差异,分析早产儿胎龄及出生体重与免疫功能的关系。方法 收集2016年4月-2017年11月苏州大学附属儿童医院新生儿科收治的早产儿外周血标本,分离早产儿外周血单个核细胞,分别加入NOD1激动剂Tri-DAP、NOD2激动剂MDP刺激细胞24 h,测定细胞中NOD1、NOD2的基因水平以及上清液中IL-6、TNF-α的表达水平。结果 胎龄<32周的早产儿NOD1 mRNA及IL-6的表达量明显低于34~36周早产儿(P<0.05);出生体重<1.5 kg的早产儿NOD1 mRNA的表达量明显低于1.5 kg以上的早产儿、NOD2 mRNA以及IL-6的表达明显低于2.0~2.5 kg的早产儿(P<0.05);NOD1 mRNA、NOD2 mRNA的表达量与出生体重呈正相关(r=0.352、0.306,P<0.05),但与胎龄无明显相关性;TNF-α的表达与胎龄和出生体重均呈正相关(r=0.380、0.289,P<0.05)。结论 出生体重越低,早产儿NOD样受体水平越低,介导抗感染免疫也越弱。相比于胎龄,出生体重对早产儿免疫功能影响较大。     

二氯乙腈诱导HepG2细胞凋亡及机制研究

目的 研究二氯乙腈(DCAN)对人肝肿瘤HepG2细胞凋亡的作用及其机制。 方法 用二甲基亚砜(DMSO)溶解DCAN,以DMSO处理的HepG2细胞作为对照组, 50和800 μmol/L 的DCAN处理的HepG2细胞作为处理组,采用Cell Counting Kit-8(CCK-8)试剂盒检测细胞活力,流式细胞术(FCM)检测细胞周期分布情况,Annexin V-FITC/PI双标记法测定细胞凋亡率;荧光测定法检测HepG2细胞内天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)活性。 结果 DCAN处理浓度和处理时间存在交互效应(P<0.001),与对照组比较,DCAN可明显抑制HepG2增殖,呈现时间和剂量效应(P<0.05);与对照组比较,800 μmol/L DCAN处理组G₀/G₁期比例明显减少,G₂/M期细胞比例明显增加;DCAN诱导的HepG2细胞凋亡随着浓度的增加而增加,呈剂量-效应关系,回归方程为=0.031x+5[决定系数(R²)=0.915,F=64.782,P<0.001];DCAN诱导的HepG2细胞内caspase-3酶活性随着处理浓度的增加而增加,呈剂量-效应关系,回归方程为=0.001 6x+1(R²=1.000,F=21 266.064,P<0.001)。 结论 DCAN可抑制HepG2细胞增殖并诱导细胞凋亡,其机制可能与G₂/M期细胞阻滞、抑制RNA和蛋白质的合成并激活细胞内caspase-3凋亡途径有关。     

潜在转化生长因子结合蛋白2在镉致人支气管上皮细胞氧化损伤中的作用

目的 研究潜在转化生长因子结合蛋白2基因(latent transforming growth factor-β binding protein 2,LTBP2)在氯化镉致人支气管上皮细胞(the human bronchial epithelial cells,16HBE)氧化损伤中的作用。 方法 分别用10、20、30、40 μmol/L氯化镉处理16HBE细胞24 h,用30 μmol/L 氯化镉处理16HBE细胞12、24、48 h,利用qRT-PCR法检测细胞LTBP2基因表达变化。针对目的基因设计特异性shRNA序列,退火并组装到慢病毒载体pCDH上,构建16HBE稳定LTBP2低表达细胞株。分别用硫代巴比妥酸比色法测定丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量、总超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活力。 结果 30、40 μmol/L处理组细胞LTBP2 mRNA相对表达与氯化镉浓度为0 μmol/L对照组比较有统计学意义(P<0.05),且随着氯化镉染毒剂量的增加,LTBP2mRNA表达逐渐升高(P<0.01)。30 μmol/L氯化镉分别处理16HBE细胞24、48 h,细胞LTBP2 mRNA基因相对表达与氯化镉未染毒细胞比较差异有统计学意义(P<0.01)。不同浓度氯化镉处理16HBE及LTBP2低表达细胞株16HBE-shLTBP2不同时间,与16HBE相比,氯化镉处理的16HBE-shLTBP2 SOD含量显著升高(P<0.05),而MDA含量显著降低(P<0.05)。 结论 LTBP2低表达细胞减弱镉致细胞氧化损伤毒性,提示LTBP2基因可能在镉致细胞氧化损伤过程中发挥促氧化作用。     

甲基化寡核苷酸灭活DKK3基因对肝癌细胞增殖的影响

目的 研究甲基化寡核苷酸灭活Dickkopf相关蛋白3(Dickkopf-related protein 3,DKK3)基因对HepG2肝癌细胞增殖的影响。 方法 采用甲基化特异性PCR法检测肝癌细胞DKK3基因启动子甲基化状态。将寡核苷酸(分别为MON组、UMON组、CON1组和CON2组)转染HepG2肝癌细胞,比较转染后DKK3基因启动子甲基化状态、细胞增殖和凋亡的差异。 结果 HepG2肝癌细胞DKK3基因启动子未检测到甲基化,Hep3B、SMMC-7721和HuH-7肝癌细胞DKK3基因启动子处于甲基化状态。MON可成功诱导其互补序列CG位点产生甲基化,而UMON、CON1和CON2寡核苷酸无法诱导甲基化。UMON组、CON1组和CON2组HepG2肝癌细胞在D0-D6吸光度、G₀/G₁期、S期、G₂/M期、增殖指数(proliferation index,PI)和凋亡率方面差异均无统计学意义(均P>0.05);MON组HepG2肝癌细胞G₀/G₁期比例和凋亡率均显著低于UMON组、CON1组和CON2组(均P<0.05),而D1-D6吸光度、S期、G₂/M期和PI均显著高于UMON组、CON1组和CON2组。 结论 甲基化寡核苷酸可成功诱导DKK3基因甲基化,导致HepG2肝癌细胞细胞增殖增加而凋亡下降。     

Notch信号通路在低剂量铅暴露对卵巢癌干细胞样细胞体外致瘤功能中的作用

目的 探讨Notch信号通路改变在低剂量铅暴露对卵巢癌干细胞样细胞体外致瘤功能中的作用。 方法 对SKOV3细胞进行悬浮培养,对其进行低剂量(2 μM)的铅暴露。分别观察铅暴露组、对照组SKOV3、细胞球形成率和集落形成率的差异;通过Western blot检测铅暴露组与未处理组SKOV3细胞Notch信号通路的改变;通过Notch信号通路的抑制剂作用SKOV3细胞,检测铅暴露对SKOV3细胞球形成率和集落形成率的改变。 结果 与对照组相比,铅暴露组SKOV3源性卵巢癌干细胞样细胞球形成率降低,细胞集落形成率显著降低,差异有统计学意义(P<0.05)。Notch1和Hes1蛋白表达显著增加。当Notch信号通路被抑制后,铅诱导的卵巢癌干细胞样细胞球形成率和集落形成率降低的趋势被逆转(P<0.05)。 结论 低剂量的铅暴露能够抑制SKOV3细胞球形成率和集落形成率,并且在此过程中Notch信号通路发挥了关键作用,抑制Notch信号通路能够降低铅暴露对SKOV3细胞球形成率和集落形成率。     

二氧化硅扰乱P2X7离子通道介导NLRP3炎性小体依赖的巨噬细胞焦亡在矽肺发病中的作用

目的 利用稳定表达凋亡相关斑点样蛋白(ASC)的小鼠巨噬细胞系(RAW-ASC)构建巨噬细胞焦亡体外模型,深入探讨不同粒径二氧化硅(SiO₂)粉尘诱导核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)炎性小体依赖的巨噬细胞焦亡机制及其在矽肺发病中的潜在作用。方法 以脂多糖(LPS,1 μg/ml)预处理RAW-ASC巨噬细胞6 h,纳米(100 μg/ml)或微米(750 μg/ml)SiO₂粉尘暴露4 h,构建巨噬细胞焦亡体外模型,同时匹配空白对照组、LPS预处理组和焦亡阳性对照组(1 μg/ml LPS预处理6 h后,3 mmol/L ATP处理4 h),检测各组细胞活性、增殖能力、破裂状况和焦亡相关蛋白表达情况。针对离子通道和焦亡通路相关靶点,分别加入NLRP3抑制剂和嘌呤能P2X7受体(P2X7)拮抗剂,评估SiO₂诱发焦亡改变。结果 与对照组相比,纳米和微米SiO₂粉尘均可减弱巨噬细胞活力并抑制细胞增殖,还可促进细胞裂解,使细胞外乳酸脱氢酶(LDH)(纳米组:t=78.906,P<0.001; 微米组:t=8.123,P<0.001)、细胞内活性氧(ROS)(纳米组:t=5.662,P<0.001; 微米组:t=11.761,P<0.001)和钙离子(Ca²⁺)(纳米组:t=13.224,P<0.001; 微米组:t =40.733,P<0.001)水平升高,加速ATP耗竭(纳米组:t =4.898,P<0.001; 微米组:t =6.029,P<0.001),上调焦亡相关蛋白NLRP3、ASC、半胱天冬氨酸蛋白酶-1(Caspase-1)、Gasdermin D(GSDMD)和白介素-1β(IL-1β)表达(纳米SiO₂组:t=5.476,P =0.008; t=5.846,P=0.017; t=8.078,P=0.006; t=8.420,P=0.004; t=5.361,P=0.003; 微米SiO₂组:t=4.411,P=0.013; t=6.154,P=0.015; t=7.188,P=0.002; t=14.265,P<0.001; t=8.574,P<0.001)。加入NLRP3抑制剂或P2X7拮抗剂后,NLRP3蛋白表达水平下调(纳米组:t=3.894,P=0.007; t=13.954,P<0.001; 微米组:t=2.470,P=0.034; t=13.263,P<0.001)。结论 纳米和微米级SiO₂粉尘暴露均可抑制巨噬细胞活性和增殖能力,扰乱P2X7离子通道对ATP的传递能力,诱发NLRP3依赖巨噬细胞焦亡,相关过程可能是矽肺发病的重要环节。     

叶酸对缺氧大鼠神经干细胞Notch信号通路相关基因mRNA表达的影响

目的研究叶酸对缺氧大鼠神经干细胞(NSCs)增殖及Notch信号通路相关基因mRNA表达的影响。方法无血清培养基原代培养新生大鼠NSCs,细胞分为对照组(Control),缺氧组(Hypoxia),叶酸组(Folate)和叶酸缺乏组(Folate-D)。除Control组外,其余3组缺氧6h。增殖第7日收集细胞,MTT法检测细胞活力,实时荧光定量PCR检测Notch1、Hes1/5、Mash1和Ngn1/2基因mRNA表达。结果 Folate组细胞活力高于Hypoxia组,Folate-D组细胞活力低于其他3组(P<0.05);Folate组Notch1、Hes1/5mRNA表达高于Hypoxia组,Folate-D组该3个基因mRNA表达低于其他3组(P<0.05);Folate组Ngn1/2mRNA表达低于Hypoxia组(P<0.05);Mash1mRNA表达在各组间差别无统计学意义(P>0.05)。结论叶酸能促进缺氧损伤NSCs增殖,上调Notch信号通路中Notch1和Hes1/5基因表达。     

二氧化硒诱导的正常肝细胞株及肝癌细胞株的凋亡

目的 :　研究中毒剂量二氧化硒 ( Se O2 )对正常肝细胞 HL- 770 2及肝癌细胞 SMMC-772 1的影响。方法 :　用流式细胞术观察不同浓度硒对两种细胞的损伤作用及对两种细胞 Bcl- 2 ,P5 3蛋白表达的影响。结果 :　 30 μmol/L的硒作用 48h可以明显抑制正常肝细胞株 HL- 770 2及肝癌细胞株 SMMC- 772 1的增生与活力 ,诱导两种细胞的凋亡 ,且两种细胞伴随着不同程度的 Bcl-2蛋白的下调及 P5 3蛋白的上调。结论 :　中毒剂量的 Se O2 诱导正常肝细胞 HL- 770 2和肝癌细胞 SMMC- 772 1的凋亡 ,且这种诱导凋亡作用是无选择性的 ,但两种细胞调亡的机制有一定区别。     

HBV基因瞬时和稳定转染HepG2细胞的TLR4表达

目的观察HBV基因瞬时和稳定转染HepG2细胞后表达TLR4的变化。方法采用免疫荧光流式细胞术检测TLR4在肝癌细胞株HepG2和HepG2．2．15上表达的平均荧光强度（MFI）及阳性细胞率,将前期试验获得的HBV全基因组,采用脂质体瞬时转染肝癌细胞株HepG2,采用免疫荧光流式细胞术检测TLR4在细胞上表达的MFI及阳性细胞率,台盼蓝计数检测细胞增殖活性,并分析其与细胞表达TLR4的关系。结果HepG2．2．15细胞上TLR4表达的MFI及阳性细胞率均明显高于HepG2（均为P’〈0．01）,HepG2细胞于转染HBVDNA各剂量组48h后TLR4表达的MFI和阳性细胞率与无HBVDNA脂质体转染对照组相比均显著升高（均P’〈0．01）,并且MFI和阳性细胞率与转染剂量均呈正相关（均P〈0．01）,与细胞存活数均呈负相关（均尸〈0．01）。结论瞬时和稳定转染HBV的HepG2细胞,都存在细胞TLR4的上调,这种上调伴随着细胞存活的减少,并可能参与了急慢性乙型肝炎的免疫损伤。     

两元腺病毒载体系统转移bax基因诱导肝癌细胞凋亡的研究

目的：采用两元腺病毒载体系统，介导bax基因转移至培养的肝癌细胞SMMC－7721，探讨腺病毒介导转移bax基因抗肝癌的活性。方法：常规方法在293细胞中扩增腺病毒Ad/GT-Bax和Ad/PGK-GV16,CsCl密度梯度离心法纯化病毒后测定病毒滴度。结果：（1）Bax蛋白表达情况：感染Ad/GT-Bax和Ad/PGK-GV16的SMMC－7721细胞，其在24、48和72小时的Bax蛋白表达量依次为阴性对照细胞的2．5、3．1和3．9倍；（2）PI染色后，感染Ad/GT-Bax和Ad/PGK-GV16的SMMC－7721细胞出现亚二倍体峰，该峰面积占总面积的值在24、48、72小时时依次为31．65％、50．44％和61．81％。结论：两元腺病毒载体系统介导转移Bax基因可诱导人肝癌SMMC－7721细胞凋亡，可望成为治疗肝癌的有力工具。     

端粒和端粒酶相互作用蛋白在真核细胞中的表达

目的从人肝癌细胞系HepG2中获得PinX1基因,构建真核表达载体,转染Hek293细胞。方法采用RT-PCR技术从HepG2中扩增PinX1,克隆入真核表达载体pcDNA3,重组质粒转染Hek293细胞,免疫组化法检测蛋白的表达。结果RT-PCR方法扩增获得PinX1基因,构建真核表达载体pcDNA3-PinXl-vsv重组质粒转染Hek293细胞,免疫组化检测结果表明在细胞核内有PinX1表达。结论成功获得PinX1基因,构建的重组载体可在Hek293细胞内表达,为探索PinX1在端粒、端粒酶调控中的作用机制奠定基础。     

化疗药物对肝癌细胞株HepG2和HepG2.2.15表达TLR2、TLR4的影响

目的 观察氟尿嘧啶和顺铂对肝癌细胞株HepG2和HepG2.2.15表达Toll样受体2(TLR2)、Toll样受体4(TLR4)的影响.方法 用直接免疫荧光流式细胞术检测加入不同终浓度的氟尿嘧啶和顺铂后24、48和72 h HepG2和HepG2.2.15细胞表达TLR2和TLR4的平均荧光强度(MFI)及阳性细胞率.结果 HepG2.2.15细胞上TLR2和TLR4表达的MFI及阳性细胞率均明显高于HepG2(P＜0.01),但加入不同终浓度的氟尿嘧啶和顺铂后,HepG2和HepG2.2.15细胞表达TLR2和TLR4的MFI及阳性细胞率均基本无变化,仅在100、200 μg/ml的氟尿嘧啶和20μg/ml的顺铂作用72 h后,HepG2.2.15细胞表达TLR2的MFI低于空白对照组(P＜0.05).结论 体外实验显示在肝癌细胞中经典化疗药物氟尿嘧啶和顺铂不能激活TLR2和TLR4信号途径,要通过激活TLR2和TLR4信号途径而达到对抗肝癌细胞的作用,需要寻找其他的方式.     

孤独症大鼠前额叶皮质中Notch相关蛋白的表达

目的 观察孤独症大鼠前额叶皮质中Notch信号通路相关蛋白发状分裂相关增强子(Hes1)和星形胶质细胞标记物胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的变化,探讨Notch信号通路在孤独症发病机制中的作用。方法 健康繁殖期Wistar雌鼠20只,体重250~260 g,随机选取15只在妊娠12.5 d(E12.5)腹腔注射丙戊酸钠(VPA),其子代为孤独症模型组;其余5只则注射等量生理盐水,子代为对照组。通过比较三箱实验、自梳理实验验证模型建立是否成功;Western blot方法对比孤独症模型组与对照组大鼠出生后42 d(P42)前额叶皮质中Hes1以及GFAP表达水平的变化。结果 1)成功建立孤独症动物模型:与正常对照组比较,三箱实验显示模型组大鼠交互能力障碍、缺乏对新鲜事物的偏好性;自梳理实验显示模型组理毛时间显著增加(P<0.05);2)与正常组比较,模型组大鼠P42前额叶皮质Hes1表达显著升高(P<0.05),GFAP表达显著升高(P<0.05)。结论 孤独症大鼠P42前额叶皮质Notch信号通路活化增多,且伴星形胶质细胞增多,提示孤独症的发病机制可能与Notch信号通路的异常活化有关。