BMSCs视网膜下移植对大鼠视网膜光感受器细胞凋亡的影响及机制研究

目的研究骨髓间充质干细胞(BMSCs)视网膜下移植对大鼠视网膜光感受器细胞凋亡的影响及机制。方法取32只6周龄的SPF级SD雄性大鼠,随机分为A组(未进行任何处理)、B组(于视网膜下注入无菌生理盐水)、C组(以BMSCs为溶质,于视网膜下注入磷酸盐溶液)、D组(于视网膜下移植BMSCs2×10~5/g个),每组各8只。其中,C、D组采用光照射1 d,于7 d后进行手术,术后2周摘除眼球。大鼠BMSCs原代和传代培养,切片并行苏木精-伊红染色,观察BMSCs细胞形态学情况,并对视网膜外核层的层数进行计算。根据免疫荧光法,对大鼠眼内BMSCs中的睫状神经营养因子(CNIF)、碱性成纤维细胞生长因子(b FGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)的表达水平进行检测,并根据Tunel细胞凋亡检测试剂盒对细胞凋亡情况进行检测。结果 BMSCs细胞刚接种时呈圆形,大小均匀,胞体透亮,胞膜清晰;混有红细胞且呈扁平状、大小不均。BMSCs细胞接种1 d后,贴壁细胞出现,且呈多角形、椭圆形或梭形,而在定期换液中未贴壁的细胞逐渐被清除。BMSCs细胞接种1周后迅速增长,2周后80%以上的贴壁细胞融合,并呈现漩涡状。D组视网膜外核层的层数明显少于A组,而明显多于B、C组(P 0. 01)。D组细胞凋亡率明显高于A组,而明显低于B、C组(P 0. 01)。DAPI阳性的BMSCs于视网膜下腔并不表达CNIF与BDNF,但其表达b FGF。结论于视网膜下移植BMSCs具有抑制视网膜光感受器细胞凋亡的作用,作用机制可能与其于视网膜下腔分泌b FGF有关。     

碱性成纤维生长因子在脂肪干细胞治疗心肌梗死中的作用

目的探讨碱性成纤维生长因子(b FGF)在脂肪干细胞(ADSC)治疗心肌梗死中的作用。方法从65只SD大鼠中提取、分离、培养、鉴定ADSC后,用细胞分化诱导液培养评价ADSC分化能力。将成功建立心肌梗死模型的60只大鼠随机分4组:磷酸盐缓冲液(PBS)组(n=15)、b FGF组(n=15)、ADSC组(n=15)及ADSC+b FGF组(n=15)。建立心肌梗死1周后分别注射PBS、b FGF、ADSC及ADSC+b FGF。移植4周后用心脏超声测量心肌梗死大鼠的LVEF,取大鼠心脏检测左心室梗死面积、微血管数量及ADSC分化情况。结果成功分离ADSC,流式细胞分析显示大多数ADSC表达CD29和CD90,不表达CD34和CD45。ADSC能被诱导分化成成脂、成骨细胞。ADSC+b FGF组及ADSC组的LVEF高于PBS组和b FGF组(P<0.01),ADSC+b FGF组的LVEF高于ADSC组(P<0.01),PBS组和b FGF组的LVEF比较差异无统计学意义(P=0.33)。ADSC+b FGF组及ADSC组的梗死面积小于PBS组和b FGF组(P<0.01),ADSC+b FGF组的梗死面积小于ADSC组(P<0.01),PBS组和b FGF组的梗死面积比较差异无统计学意义(P=0.28)。ADSC+b FGF组的微血管数量最多(P<0.01)。ADSC可分化为c Tn T阳性细胞、SMA阳性细胞及v WAg阳性细胞。结论 b FGF可促进ADSC分化成心肌细胞和新生微血管,改善心脏功能。     

hBDNF-GFP基因转染神经干细胞对视神经损伤大鼠视网膜BDNF表达的影响

目的 探讨移植hBDNF-GFP基因转染神经干细胞后对视神经损伤大鼠视网膜BDNF表达的影响.方法 ①78只SD大鼠随机分为正常对照组(n=6)、视神经夹伤组(n=72).视神经夹伤组动物行右侧视神经夹伤后随机平均分为三个亚组:分别于玻璃体腔内注射0.01 mol/L PBS(PBS组),GFP基因转染神经干细胞(GFP-NSCs组)和hBDNF-GFP基因转染神经干细胞(hBDNF-GFP-NSCs组).各组动物单纯暴露左侧视神经作为假损伤组.分别于移植后3 d,7 d,14 d和28 d处死动物取视网膜,ELISA法检测各组视网膜中BDNF含量.②另取6只视神经损伤大鼠移植hBDNF-GFP-NSCs,分别于2周、4周和8周各处死2只大鼠,取眼球做冰冻切片观察移植细胞存活、迁移情况.③35只sD大鼠随机分为4组:正常对照组(n=5)、右眼视神经损伤NSCs治疗组(n=10)、GFP-NSCs治疗组(n=10)及hBDNF-GFP-NSCs治疗组(n=10).④各组于术后4周和8周分别处死5只大鼠,West-era-blot法检测视网膜组织中BDNF表达.结果 ①ELISA结果显示,正常对照组BDNF含量与假损伤组间比较差异无统计学意义(P>0.05),移植手术后第3天时,三个损伤亚组视网膜匀浆上清中hBDNF含量明显增加(与假损伤组比较P<0.05),而三组间差异无统计学意义(P>0.05);7 d时,GFP-NSCs组与假损伤组比较差异具有统计学意义(P<0.05),而PBS组、hBDNF-GFP-NSCs组与假损伤组比较差异无统计学意义(P>0.05),PBS组与GFP-NSCs组间及hBDNF-GFP-NSCs组与GFP-NSCs组间差异具有统计学意义(P<0.05);移植第14天和28天时,PBS组和GFP-NSCs组中视网膜BDNF含量降低,而hBDNF-GFP-NSCs组中BDNF含量与其他三组比较明显升高,差异有统计学意义(P<0.05).②冰冻切片示移植后,hBDNF-GFP-NSCs可在宿主视网膜内存活,并逐渐迁移至视网膜各层.③Western-blot检测显示,各组内第4周和第8周BDNF表达差异无统计学意义,移植hBDNF-GFP-NSCs组视网膜组织中BDNF表达明显高于于其他各组.结论 hBDNF-GFP基因转染神经干细胞移植后可在宿主视网膜长期存活,且可以稳定高表达BDNF.     

骨髓间充质干细胞对制动大鼠骨骼肌细胞Bcl-2、Bax蛋白表达的影响

目的 观察早期注射骨髓间充质干细胞(BMSCs)对制动大鼠骨骼肌细胞Bcl-2、Bax蛋白表达的影响。 方法 取幼龄大鼠(80～100g)胫骨和股骨，分离培养大鼠BMSCs。用可塑性石膏制备右下肢管型固定肌萎缩模型，根据随机数字表法将24只大鼠分成假手术组、干细胞组、磷酸缓冲液（PBS）组，干细胞组大鼠下肢制动48h后于比目鱼肌局部多点注射1×106个BMSCs；PBS组大鼠下肢制动48h后注射等量PBS；假手术组大鼠下肢包裹相同重量石膏且不限制关节活动，48h后注射等量PBS，14d后各组大鼠拆除石膏取标本分析。 结果 培养中的大鼠BMSCs以梭形细胞为主，呈放射状排列的细胞集落，细胞生长旺盛，可连续稳定传代10代以上。实验中第4代BMSCs表面标志CD44、CD90均呈阳性表达，阳性率分别为95.84%、96.00%，而CD34、CD45阳性率极低。与假手术组大鼠比目鱼肌中Bax和Bcl-2蛋白表达量［(0.14±0.11）、(0.81±0.06)］比较，干细胞组和PBS组Bax蛋白表达量［(0.41±0.08)、(0.63±0.10)］明显升高，两组Bcl-2蛋白表达量［(0.47±0.14)、(0.22±0.13)］明显降低；干细胞组中Bax蛋白的表达水平较PBS组低，Bcl-2蛋白的表达水平显著增高，差异有明显统计学意义(P<0.05)。 结论 制动大鼠骨骼肌早期注射BMSCs，可引起抗凋亡蛋白Bcl-2表达水平上调、促凋亡蛋白Bax表达水平下调。     

高压氧对脑外伤外源性骨髓间充质干细胞归巢的影响

目的探讨高压氧治疗对脑外伤大鼠外源性骨髓间充质干细胞(BMSCs)归巢的影响。方法采用Ficoll密度梯度离心法分离、培养BMSCs,应用流式细胞仪对第三代BMSCs表面标志CD_(29)、CD_(90)、CD_(45)、CD_(11b)进行鉴定,细胞膜荧光探针CM-DiI对BMSCs进行示踪处理。36只Sprague-Dawley大鼠分为假手术组(A组,n=6)、模型组(B组,n=6)、BMSCs移植组(C组,n=12)、高压氧+BMSCs组(D组,n=12),分别于移植后1 d、3 d取脑组织标本,冰冻切片,荧光显微镜下观察示踪后BMSCs归巢的数量和部位;Western blotting检测基质细胞衍生因子1(SDF-1)及其受体CXCR4的蛋白表达。结果受伤侧大脑半球,尤其是受损脑组织周围,荧光标记BMSCs更为集中;同一时间点D组BMSCs归巢数量明显高于C组(P0.01);C、D组3 d时BMSCs归巢数量均明显高于1 d时(P0.01)。D组SDF-1、CXCR4的蛋白表达水平高于C组(P0.05)。结论高压氧治疗可以促进外源性BMSCs归巢至大鼠受损脑组织,其作用与SDF-1/CXCR4信号轴的表达增强相关。     

慢病毒介导EPhrinB2基因转染骨髓间充质干细胞对脑瘫大鼠脑损伤的保护作用

目的 观察慢病毒介导EPhrinB2基因转染骨髓间充质干细胞（BMSCs）对脑瘫大鼠脑损伤的保护作用及相关机制。 方法 从大鼠中分离、培养BMSCs,以慢病毒为载体介导EPhrinB2转染BMSCs。采用随机数字表法将96只大鼠分为假手术组、溶剂对照组（简称PBS组）、空载慢病毒组（简称EGFP/BMSCs组）及EPhrinB2重组慢病毒组（简称EPhrinB2/BMSCs组）。选用改良缺氧缺血脑病（HIE）造模方法将PBS组、EGFP/BMSCs组及EPhrinB2/BMSCs组大鼠制成脑瘫模型,于术后7 d时分别将PBS溶液、BMSCs或慢病毒介导EPhrinB2基因转染BMSCs注射到PBS组、EGFP/BMSCs组、EPhrinB2/BMSCs组大鼠侧脑室内。于脑损伤28 d后采用免疫组织化学法检测各组大鼠海马组织EPhrinB2蛋白表达;采用HE染色方法观察细胞移植后大鼠海马CA1区神经元密度;采用TUNEL法检测大鼠海马神经元凋亡情况;采用免疫荧光法检测大鼠海马区Nestin及CD31表达水平。于脑损伤28 d后采用Morris水迷宫检测各组大鼠学习、记忆能力变化。 结果 脑损伤28 d后,发现EPhrinB2/BMSCs组海马组织EPhrinB2蛋白表达均显著高于假手术组、PBS 组及EGFP/BMSCs组,组间差异均具有统计学意义（P<0.05）;另外EPhrinB2/BMSCs组海马CAl区病理改变明显轻于PBS 组及EGFP/BMSCs组;EPhrinB2/BMSCs组海马区神经元凋亡率明显低于其它各组(P<0.05)。另外免疫荧光检查显示EPhrinB2/BMSCs组海马Nestin及CD31阳性率均显著高于其它各组。远期行为学测试结果显示EPhrinB2/BMSCs组Morris水迷宫实验平均潜伏期明显优于PBS 组及EGFP/BMSCs组(P<0.05)。 结论 慢病毒介导EPhrinB2转染BMSCs移植到脑瘫大鼠侧脑室海马区能高效表达EPhrinB2基因,有助于神经元细胞分化及血管新生,抑制细胞凋亡,加速受损神经功能恢复。     

蛛网膜下腔移植SPIO标记的MSCs在大鼠脊髓损伤模型的MR活体示踪研究

目的 将超顺磁性氧化铁纳米粒子(SPIO)标记的骨髓间充质干细胞BMSCs通过蛛网膜下腔置管移植到脊髓损伤大鼠模型,以磁共振成像(MRI)观察其迁移和分布.方法 用携带绿色荧光蛋白的腺病毒(AD5/F35-EGFP)和SPIO标记分离纯化后的BMSCs,免疫荧光和普鲁士蓝染色显示标记效果.制作大鼠脊髓损伤模型,并将蛛网膜下腔置管成功的10只SD大鼠随机分为2组,将标记细胞(实验组,n＝5)和未标记细胞(对照组,n＝5)经蛛网膜下腔移植到模型鼠.在移植前、移植后3、7、14天用3T MRI对移植细胞进行活体示踪,并与损伤脊髓组织切片GFP表达进行对照.结果 AD5/F35-EGFP和SPIO可以高效地标记BMSCs,标记细胞表达绿色荧光,普鲁士蓝染色显示BMSCs胞质内出现蓝色铁颗粒,标记对细胞增殖活力没有明显的影响.蛛网膜下腔移植标记细胞到大鼠脊髓损伤模型,MRI显示损伤区域逐渐增强的T2低信号,组织切片荧光检查与MRI结果一致,未标记细胞组MRI无明显低信号改变.结论 SPIO纳米颗粒可有效标记BMSCs.蛛网膜下腔移植的BMSCs可迁移到脊髓损伤区域;利用MRI可对移植细胞进行活体示踪.     

RCS大鼠与SD大鼠的视网膜结构和光感受器形态观察

目的：比较遗传性视网膜色素变性动物模型RCS大鼠与SD大鼠视网膜及光感受器细胞形态学差异。方法：取变性中期（日龄30 d）RCS（RCS-p＋rats）大鼠及SD大鼠各8只,断颈处死后取新鲜眼球,于80%乙醇、40%甲醛和95%冰醋酸混合固定液（85∶10∶5）中固定24 h,垂直切开眼球,常规乙醇脱水,石蜡包埋,作经线方向4μm的垂直切片,苏木素-伊红染色,光镜下观察两组大鼠视网膜形态和结构,显微镜测微器测定两组光感受器细胞外核层厚度,记录外核层细胞层数,并进行比较。结果：RCS大鼠和SD大鼠视网膜形态学有明显差异,主要表现为光感受器细胞层菲薄（P〈0.05）,细胞核数目减少。结论：视网膜色素变性动物模型RCS大鼠视网膜厚度、外核层变薄,光感受器细胞减少,这可能与视网膜色素变性光感受器细胞的凋亡有着直接的因果关系。     

不同途径移植骨髓单个核细胞治疗大鼠后肢缺血

目的:探讨局部肌肉注射和动脉腔内注射两种途径进行骨髓单个核细胞移植治疗大鼠后肢缺血的效果。方法:实验于2004-02/06在首都医科大学宣武医院动物室完成。通过切除股浅动脉及其分支血管制作Lewis大鼠单侧后肢缺血模型,7d后进行骨髓单个核细胞移植。骨髓单个核细胞取自同系健康大鼠的四肢长骨,用密度梯度离心法获得。26只Lewis大鼠随机分成局部肌肉注射细胞移植组(实验组Ⅰ,n=8)和局部肌肉注射无血清IMDM培养基组(对照组Ⅰ,n=5);动脉腔内注射细胞移植组(实验组Ⅱ,n=8)和腔内注射无血清IMDM培养基组(对照组Ⅱ,n=5)。实验组每只大鼠移植5×106骨髓单个核细胞。在移植后4周测定双侧后肢皮肤温度差、激光多普勒血流仪测定皮肤灌注量,免疫组化染色计数毛细血管数量,数字减影血管造影(digitalsubtractionangiography,DSA)观察血管新生情况作为评价指标,研究两种移植途径对下肢缺血的不同治疗作用。结果:所有大鼠未出现后肢坏疽。移植后4周双侧后肢皮肤温度差实验组Ⅰ为0.90±0.17,对照组Ⅰ为2.54±0.14;实验组Ⅱ为1.01±0.22,对照组Ⅱ为2.84±0.25,实验组较对照组明显低(P<0.05)。激光多普勒血流测定显示双侧后肢皮肤灌注量之差实验组Ⅰ为18.0±5.6,对照组Ⅰ为32.1±9.4;实验组II为21.8±7.1,对照组Ⅱ为28.6     

间充质干细胞移植减轻大鼠盐酸吸入性肺损伤

目的 研究骨髓间充质干细胞(BMSCs)移植对大鼠盐酸吸入性肺损伤的作用与机制.方法 本实验于复旦大学附属中山医院实验研究中心进行.改良贴壁法分离培养Sprague-Dawley (SD)大鼠BMSCs.24只SD大鼠随机(随机数字法)分为3组(n=8):对照组,损伤组和移植组.损伤组和移植组气道内滴注盐酸(1.2 ml/kg,pH=1.5),对照组则滴入等量磷酸缓冲盐溶液(PBS),用动脉血气、肺组织湿干比和病理改变评价模型是否成功建立.移植组于颈外静脉注射5×106个BMSCs,其他2组注入0.5 ml的PBS.移植6h后行动脉血气分析,酶联免疫吸附法(ELISA)测定血清和支气管肺泡灌洗液(BALF)的肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)和白介素-10 (IL-10)质量浓度,观察肺组织病理改变和测定肺组织湿干比.体外实验中,BMSCs与损伤肺细胞或正常肺细胞于Transwell体系共培养36 h,观察损伤肺影响BMSCs迁移情况;另取BMSCs与损伤肺细胞昆合培养或于Transwell中培养,正常肺细胞或损伤肺细胞单独培养作对照,6h后检测上清液中TNF-α、IL-6和IL-10质量浓度.用方差分析比较多组间的差异,独立样本t检验比较两组间差异.结果 BMSCs移植改善了肺损伤大鼠的低氧血症(P＜0.01)和肺组织损伤,降低了肺组织湿干比(P＜0.01),降低了血清和BALF的TNF-α水平(P＜0.05;P＜0.01),升高了血清和BALF的IL-10质量浓度(P＜0.01),对IL-6水平无明显影响(P＞0.05).体外实验中,BMSCs向损伤肺迁移明显多于向正常肺迁移(P＜0.01),BMSCs与肺细胞接触或不接触的共培养均降低了上清液TNF-α质量浓度(P＜0.01),升高了IL-10质量浓度(P＜0.01),对IL-6质量浓度无影响(P＞0.05).结论 BMSCs移植可以减轻大鼠盐酸吸入性肺损伤,可能机制为干细胞通过旁分泌途径下调炎症反应.     

bFGF抗体抑制人卵巢癌裸鼠移植瘤细胞转移及血管新生的实验研究

目的 研究碱性成纤维细胞生长因子(b FGF)抗体对卵巢癌裸鼠移植瘤癌细胞转移和移植瘤组织血管新生的影响。方法 60只BALB/c裸鼠通过腹腔注射卵巢癌细胞建立人卵巢癌裸鼠移植瘤模型。1周后,60只卵巢癌移植瘤模型小鼠按照随机数字表法均分为3组,即模型组、溶剂组和b FGF抗体组。模型组不进行治疗,溶剂组腹腔注射b FGF抗体溶剂治疗,b FGF抗体组腹腔注射b FGF抗体治疗,共治疗7周。每组取10只小鼠让其自然死亡,记录并比较生存时间。实验第8周,每组安乐死10只小鼠。比较各组小鼠体重,卵巢癌移植瘤体积和重量,卵巢癌细胞转移结节数、转移器官数和转移病灶总数,以及卵巢癌移植瘤组织血管内皮生长因子(VEGF)表达水平、微血管数目以及凋亡细胞率。结果 b FGF抗体组小鼠各时间点体重和最终生存时间均显著高于模型组和溶剂组,差异均有统计学意义(P <0.05)。b FGF抗体组小鼠腹水体积、卵巢移植瘤体积和重量、癌细胞转移结节数、转移器官数和转移病灶总数均显著低于模型组和溶剂组,差异均有统计学意义(P <0.05); b FGF抗体组小鼠卵巢癌抑瘤率高于溶剂组,差异有统计学意义...     

移植神经干细胞的存活与迁移:电刺激小脑顶核可提高移植效率吗?

背景:缺血早期半暗带中神经元和内皮细胞的坏死和凋亡无法得到缓解,加之移植后的存活率低,向功能细胞的分化率低,是单纯神经干细胞移植的缺陷.课题组提出整体干预理念,期望给移植细胞提供优化的整体环境.目的:观察神经干细胞移植与电刺激小脑顶核相结合整体干预对移植神经干细胞存活与迁移的影响.方法:体外分离、培养新生Wistar大鼠海马表皮生长因子反应性神经干细胞,Brdu标记,并用胎牛血清诱导,观察其多向分化潜能;80只Wistar大鼠分为4组:顶核刺激+神经干细胞移植组(n=32):左侧小脑顶核刺激24 h后行右侧大脑中动脉梗死,再24 h后将神经干细胞立体定向注入右侧侧脑室内;顶核刺激组(n=8):PBS代替神经干细胞,其余同顶核刺激+神经干细胞移植组;单纯神经干细胞移植组(n=32):同心圆电极插入小脑顶核,不通电其余同顶核刺激+神经干细胞移植组;对照组(n=8):同心圆电极插入小脑顶核后不通电,其余同顶核刺激组.记录梗死后6,24 h,3,7,14,28 d大鼠的神经功能;分别在移植后3,7,14,28 d处死大鼠,以梗死灶为中心切片,Brdu免疫组织化学染色,观察移植神经干细胞的存活与迁移.结果与结论:分离培养的表皮生长因子反应性细胞表达nestin抗原,并有自我更新及多向分化潜能,在胎牛血清诱导下可分化为神经胶质细胞和神经元.经Brdu标记后,85%以上神经干细胞表达Brdu抗原.移植28 d内顶核刺激+神经干细胞移植组功能评分明显优于与其他3组(P < 0.05～0.01).顶核刺激+神经干细胞移植组在移植14,28 d存活细胞数明显多于单纯神经干细胞移植组;提示电刺激小脑顶核可显著提高移植神经干细胞的存活率及大脑中动脉梗死大鼠的神经功能评分;优化的整体环境可提高移植神经干细胞对局灶性脑缺血损伤细胞的替代作用.     

骨髓基质细胞治疗脑缺血过程中血管内皮生长因子对其趋化性作用的实验研究

目的:探讨骨髓基质细胞(BMSCs)枕大池注射治疗大鼠大脑中动脉闭塞(MCAO)过程中血管内皮生长因子(VEGF)对其趋化性作用。方法:从2月龄大鼠的后肢骨骨髓中取原代BMSCs,经体外扩增培养、鉴定,5-溴脱氧尿苷(BrdU)体外标记细胞。线栓法制作大鼠MCAO模型24 h后,造模成功大鼠随机分为对照组(n=10),枕大池注射生理盐水;BMSCs治疗组(n=10),枕大池注射BMSCs(1×106个);BMSCs+VEGF治疗组(n=10),枕大池注射BMSCs(1×106个)后48 h、72 h、96 h,分3次枕大池注射VEGF 20 ng。各组分别在治疗1周和4周时各处死5只大鼠,HE染色和BrdU免疫组织化学染色。结果:各组大鼠HE染色后均能在左侧大脑半球发现梗死灶。对照组各时间点未见明显BrdU阳性细胞;2个治疗组在治疗1周时梗死灶周围的BrdU阳性细胞数目均显著多于4周时(P0.01);治疗1周和4周时,BMSCs+VEGF治疗组梗死灶周围的BrdU阳性细胞数目均显著多于BMSCs治疗组(P0.01)。结论:BMSCs枕大池注射治疗大鼠MCAO时,移植细胞向缺血部位迁移,加用外源性VEGF对BMSCs向梗死灶周围迁移有趋化性作用。     

荧光定量聚合酶链反应法检测光感受器细胞凋亡大鼠视网膜中半胱氨酸蛋白酶3 mRNA的表达

目的:检测半胱氨酸蛋白酶3mRNA在光感受器凋亡大鼠视网膜中的表达,探讨其在光感受器细胞凋亡的发生、发展中的意义。方法:实验于2004-03/12在中山眼科中心眼科学教育部重点实验室完成。选择雌性SD大鼠36只,随机数字表法分为正常对照组6只,N-甲基-N-亚硝脲组30只,后者又分为造模后12h,1,2,3,5d5个时相点,每个时相点6只。正常对照组大鼠经腹腔注射生理盐水;N-甲基-N-亚硝脲组大鼠按体质量一次性腹腔注射N-甲基-N-亚硝脲40mg/kg,分别于造模后12h,1,2,3,5d处死动物,摘除右眼球,立即分离视网膜,提取总RNA,用荧光定量聚合酶链反应法检测视网膜中半胱氨酸蛋白酶3mRNA的含量。结果:纳入动物36只,均进入结果分析。正常对照组、N-甲基-N-亚硝脲组造模后12h,1,2,3,5d5个时相点视网膜中半胱氨酸蛋白酶3mRNA表达量分别为1.52×105,18.35×105,25.14×105,29.25×105,13.72×105,12.24×105。N-甲基-N-亚硝脲腹腔注射后12h视网膜中半胱氨酸蛋白酶3mRNA表达量上升,第2天时最高,达正常对照组表达量的19倍,此后渐下降,第5天表达量仍为正常对照组的8倍。结论:视网膜中半胱氨酸蛋白酶3mRNA表达与光感受器细胞的存亡有关,可作为光感受器细胞凋亡发生、发展的预测指标之一。     

黑色素纳米颗粒联合骨髓间充质干细胞移植对缺血性脑卒中大鼠的治疗作用

目的 观察缺血性脑卒中大鼠采用黑色素纳米颗粒(MNPs)联合骨髓间充质干细胞(BMSCs)移植后神经功能、脑梗死体积及炎性因子水平变化,探讨其对缺血性脑卒中大鼠的治疗作用。方法 取SD乳鼠20只,处死后分离股骨和胫骨,采用全骨髓贴壁法分离BMSCs。取第3代BMSCs,显微镜下观察细胞形态,应用流式细胞仪检测细胞表面CD90、CD29、CD45、CD44表达情况。采用化学合成法制备MNPs,将MNPs悬液加入制备的BMSCs处理24 h,制备MNPs-BMSCs细胞悬液。取72只SD大鼠随机分为假手术组、模型组、BMSCs组和MNPs-BMSCs组各18只,模型组、BMSCs组和MNPs-BMSCs组大鼠采用Longa改良线栓法制备右侧大脑中动脉栓塞模型,假手术组大鼠不剪开颈总动脉和插入线栓,其他操作同模型组。BMSCs组和MNPs-BMSCs组大鼠于造模后24 h尾静脉分别注射1 mL BMSCs、MNPs-BMSCs细胞悬液,假手术组和模型组大鼠分别注射1 mL无菌1×PBS缓冲液。模型组、BMSCs组和MNPs-BMSCs组大鼠均于移植第1、3、7天行改良神经功能缺损评分(mNS...     

黄芪对N-甲基-N-亚硝脲诱导大鼠光感受器细胞凋亡的预防途径

背景:视网膜色素变性是非炎症性、双侧进行性的视网膜变性,其特征是光感受器细胞因发生凋亡而丢失,最终导致失明。中药黄芪在阻止该病的进程上显示出了良好的前景。目的:观察黄芪对N-甲基-N-亚硝脲致SD大鼠视网膜损伤的保护作用。设计:随机对照动物实验。单位:新乡医学院药学院。材料:实验于2004-03/12在中山大学中山眼科中心药理实验室完成。雌性SD大鼠114只,由中山大学中山医学院动物中心提供,N-甲基-N-亚硝脲为美国Sigma公司产品,黄芪注射液为成都地奥九泓制药厂生产(生产批号:国药准字Z99060535,2mL/支,主要成分为黄芪)。方法:选用雌性SD大鼠114只,30只用于视网膜层形态学分析;30只用于细胞凋亡检测;54只用于胞核内核因子κBp65活性的检测。采用抽签法随机分组,每组6只。于大鼠生后47d,分别经腹腔注射不同剂量的黄芪(2.5,5和10g/kg),1次/d,除对照组外,其余组的大鼠同时于生后50d腹腔注射N-甲基-N-亚硝脲60mg/kg。在N-甲基-N-亚硝脲处理不同时间后处死动物,取眼球,视网膜形态学分析测量周边视网膜的总厚度,TUNEL试剂盒检测光感受器细胞凋亡,转录因子试剂盒分析核因子κBp65的活性。主要观察指标:各组视网膜厚度、凋亡指数和胞核内核因子κBp65的活性比较。结果:黄芪可剂量依赖性地显著增加周边视网膜总厚度和降低N-甲基-N-亚硝脲引起的光感受器细胞凋亡指数。黄芪注射液10g/kg还可时间依赖性地上调视网膜细胞胞核内核因子κBp65的活性。但其对N-甲基-N-亚硝脲引起的中心视网膜损伤无明显的保护作用。结论:黄芪通过上调视网膜细胞胞核内核因子κBp65的活性,抑制光感受器细胞凋亡,从而部分地保护N-甲基-N-亚硝脲引起的视网膜损伤。     

骨髓间充质干细胞在大鼠缺血-再灌注损伤眼的视网膜下移植

目的 观察骨髓间充质干细胞移植于大鼠缺血再灌注损伤眼的视网膜下后生长、分化和迁移的情况。方法 体外培养大鼠骨髓间充质干细胞并传至第四代，建立大鼠眼缺血-再灌注损伤模型。将Brdu标记的BMSCs移植于大鼠缺血再灌注眼内的视网膜下，应用荧光免疫组织化学方法示踪移植后10、20、30天视网膜中Brdu标记的BMSCs的分布情况。结果 移植后10d荧光显微镜下见大部分Brdu标记的BMSCs在移植区城周围成簇聚集。移植后20d观察发现BMSCs分布较多的位置为外核层。移植后30d可见BMSCs部分出现在节细胞层并且连接成片。在移植后整合于视网膜的BMSCs中，部分细胞显示NSE、GFAP、NF200阳性。结论 移植于缺血再灌注损伤眼视网膜下的BM—SCs具有向损伤部位迁移和分化为神经样细胞的能力。     

骨髓间充质干细胞细胞周期同步化的方法及对向神经细胞分化的影响

目的分析不同处理条件下细胞同步化于G0/G1时期的效果以得到最佳的同步化条件,并研究同步化对骨髓间充质干细胞(BMSCs)在碱性成纤维细胞因子(b FGF)的作用下分化为神经细胞的影响。方法分离培养成年大鼠BMSCs,5%、1%、0.5%、0.1%、0胎牛血清(FBS)分别处理24 h、48 h。PI染色后经流式细胞仪检测细胞周期各时相细胞所占比例,与正常培养条件(10%FBS)处理下对比。得到最佳处理条件后,b FGF处理3 d、7 d,免疫荧光细胞化学方法检测Nestin和Tuj-1的表达。结果成年大鼠BMSCs原代提取,经传代后,细胞形态为长梭形。不同处理条件下G1/G0期细胞比例均高于正常培养条件,1%FBS处理48 h时G1/G0期细胞比例为(94.274±0.468)%,达最高峰(F=39.91,P0.001)。b FGF诱导3 d后,细胞周期同步化后的Nestin+细胞数显著高于未同步化的细胞数[(80.3±2.4)%vs.(12.1±1.5)%](F=28.25,P0.001);b FGF诱导7 d后,同步化后的Tuj-1+细胞数显著高于未同步化的细胞数[(74.8±3.2)%vs.(19.3±2.5)%](F=17.95,P0.001)。结论 1%FBS处理48 h是将BMSCs同步化于G0/G1期的最佳条件。细胞周期同步化于G0/G1期能够提高BMSCs向神经细胞分化的比例。     

川芎嗪注射剂对N-甲基-N-亚硝脲引起大鼠视网膜损伤的拯救效应

目的:观察川芎嗪注射剂对N-甲基-N-亚硝脲诱导SD大鼠光感受器细胞凋亡的保护作用。方法:2003-03/09在中山大学中山医学院实验动物中心,于雌性SD大鼠生后47d,分别经腹腔注射小、中及大剂量的川芎嗪注射剂,1次/d,并于生后50d腹腔注射N-甲基-N-亚硝脲60mg/kg。在N-甲基-N-亚硝脲处理不同时间后处死动物,取眼球。通过dUTP缺口末端标记试剂盒检测光感受器细胞凋亡;视网膜形态学分析测量周边视网膜的总厚度;反转录聚合酶链反应法检测基因c-fos的表达。结果:N-甲基-N-亚硝脲作用24h后,模型组周边视网膜的光感受器细胞凋亡指数为38.0%;川芎嗪注射剂组分别为30.0%,15.6%和8.4%。作用7d后,模型组周边视网膜的总厚度为37μm;川芎嗪注射剂组分别为41,66和85μm。川芎嗪注射剂可抑制N-甲基-N-亚硝脲诱导的即早基因c-fos的表达。结论:川芎嗪注射剂通过下调基因c-fos的表达,抑制光感受器细胞凋亡,从而部分地保护N-甲基-N-亚硝脲引起的视网膜损伤。     

电针三阴交、阴陵泉对腓肠肌损伤大鼠损伤后修复及生长因子表达的影响

目的探讨电针治疗腓肠肌损伤的可能机制。方法 30只雄性Sprague-Dawley大鼠随机分为空白组(n=10)、模型组(n=10)和电针组(n=10)。模型组和电针组采用腓肠肌钝挫伤的方法制备模型,电针组电针三阴交、阴陵泉穴14 d。治疗结束后取腓肠肌组织行HE染色,免疫组化法检测大鼠腓肠肌组织、ELISA法检测大鼠血清碱性成纤维细胞生长因子(b FGF)和胰岛素样生长因子-1(IGF-1)的表达。结果与模型组相比,电针组损伤程度较轻,腓肠肌组织b FGF、IGF-1表达明显升高(P0.01),血清含量升高(P0.05)。结论电针可以促进腓肠肌损伤大鼠损伤后修复,其机制可能与上调修复因子b FGF和IGF-1的表达水平有关。