MTDH基因沉默对B淋巴瘤细胞增殖及侵袭的影响

目的探讨异黏蛋白(MTDH)基因沉默对B淋巴瘤细胞增殖及侵袭能力的影响。方法在B淋巴瘤细胞Raji中转染MTDH siRNA和siRNA对照,分别命名为MTDH siRNA组和siRNA对照组,将没有转染的细胞作为对照组。qRT-PCR和Western blot方法检测细胞中MTDH表达水平,MTT方法检测细胞增殖和黏附能力,流式细胞术检测细胞凋亡,Transwell小室检测细胞侵袭及迁移能力,Western blot检测细胞中波形蛋白(Vimentin)、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、活化的Caspase-3(Cleaved Caspase-3)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)蛋白水平。结果MTDH siRNA细胞中MTDH mRNA和蛋白水平均明显低于对照组和siRNA对照组(P<0.05)。与对照组和siRNA对照组比较,MTDH siRNA细胞增殖和黏附能力降低,细胞凋亡率升高,细胞侵袭和迁移能力也降低,细胞中Vimentin、MMP-2、MMP-9蛋白水平降低,Cleaved Caspase-3蛋白水平升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论MTDH基因沉默下调B淋巴瘤细胞增殖能力,抑制B淋巴瘤细胞侵袭和迁移。     

慢病毒介导的ROBO1沉默抑制乳腺癌细胞生长克隆及ATP合成

目的研究沉默ROBO1对乳腺癌细胞生长、克隆及三磷酸腺苷(ATP)合成的影响。方法乳腺癌细胞MDA-MB-231感染ROBO1 siRNA重组病毒和siRNA control重组病毒记为干扰组和阴性组,以不做处理的细胞作为对照组。qRT-PCR和Western blot检测细胞中ROBO1 mRNA和蛋白水平,以MTT法检测细胞增殖情况,克隆形成实验检测细胞克隆形成能力,荧光素酶法检测细胞合成的ATP水平,流式细胞术检测细胞周期,Western blot检测细胞中周期蛋白D1(Cyclin D1)、p21蛋白水平。结果阴性组细胞中ROBO1 mRNA和蛋白水平、细胞OD值、克隆形成率、ATP水平、细胞周期比率及cyclin D1、p21蛋白水平与对照组比较,差异均无统计学意义(P0.05)。干扰组细胞中ROBO1mRNA和蛋白水平降低,细胞OD值也降低,克隆形成率及ATP水平下降,G_0/G_1期细胞比率升高,细胞中cyclin D1蛋白水平降低,p21蛋白水平升高,与对照组比较,差异有统计学意义(P0.05)。结论沉默ROBO1抑制乳腺癌细胞的生长、克隆及ATP合成能力,并且能将细胞周期阻滞在G_0/G_1期。     

HMGB1对膀胱癌细胞增殖和凋亡的影响及机制

目的研究高迁移率蛋白1(HMGB1)对膀胱癌细胞增殖、凋亡的影响及机制。方法膀胱癌细胞BIU-87分成对照组、siRNA control组、HMGB1 siRNA组共3组,siRNA control组、HMGB1 siRNA组细胞为感染siRNA control慢病毒和HMGB1 siRNA慢病毒的BIU-87细胞,对照组为不感染慢病毒的BIU-87细胞。用Realtime PCR和Western blot检测细胞中HMGB1表达水平。MTT检测膀胱癌细胞增殖活性,流式细胞术检测膀胱癌细胞凋亡,Western blot检测膀胱癌细胞中CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白(CHOP)、活化型Caspase-3(Cleaved Caspase-3)、活化型Caspase-12(Cleaved Caspase-12)、活化转录因子4(ATF4)蛋白水平。结果 HMGB1 siRNA可以下调膀胱癌细胞中HMGB1的表达和转录,siRNA control对膀胱癌细胞中HMGB1表达没有影响。沉默HMGB1后膀胱癌细胞增殖能力下降,细胞凋亡率升高,细胞中凋亡蛋白Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-12表达水平升高,内质网应激蛋白CHOP、ATF4表达水平也升高。结论 HMGB1沉默可以通过内质网途径诱导膀胱癌细胞凋亡,抑制膀胱癌细胞增殖。     

MMP-2基因对前列腺癌细胞恶性表型的影响及其机制研究

目的探讨基质金属蛋白酶2(MMP-2)基因对前列腺癌细胞恶性表型的影响及其机制。方法 Western blot和RT-PCR检测人正常前列腺上皮RWPE-1细胞和前列腺癌PC3细胞中MMP-2的表达情况;以脂质体Lipfectamine 2000将MMP-2 siRNA和MMP-2 control质粒分别转染至siRNA MMP-2组和siRNA control组细胞中,以不做处理的细胞为对照组。Western blot和RT-PCR检测其转染效果;CCK-8法检测细胞增殖;Transwell法检测细胞的侵袭和迁移;FCM检测细胞凋亡;Western blot检测细胞中血管内皮生长因子(VEGF)和Cleaved Caspase-8蛋白的表达。结果与RWPE-1细胞相比,PC3细胞中MMP-2蛋白和mRNA的表达水平显著升高(P0.05)。MMP-2在siRNA MMP-2组细胞中的蛋白和mRNA表达显著低于对照组(P0.05),而siRNA control组与对照组间MMP-2的蛋白和mRNA表达水平差异无显著性(P0.05)。siRNA MMP-2组细胞的OD值、侵袭细胞数、迁移细胞数和VEGF蛋白的表达水平显著下降,而细胞凋亡率和Cleaved Caspase-8蛋白水平显著升高,差异均显著性(P0.05);对照组和siRNA control组间OD值、侵袭细胞数、迁移细胞数、细胞凋亡率、VEGF和Cleaved Caspase-8蛋白表达均未见显著差异(P0.05)。结论 MMP-2在前列腺癌PC3细胞中高表达,干扰其表达可抑制细胞的增殖、侵袭和迁移,并促进细胞凋亡,其作用机制可能与下调VEGF蛋白和上调Cleaved Caspase-8蛋白的表达有关。     

PDCD4对高糖诱导的胰岛β细胞损伤的影响及机制研究

目的研究程序性细胞死亡4 (PDCD4)对高糖诱导的胰岛β细胞损伤的影响及机制。方法胰岛β细胞感染PDCD4 siRNA重组慢病毒,给予高糖处理,Realtime PCR和Western blot检测PDCD4表达水平。CCK8检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡,Western blot方法检测细胞中活化型Caspase-3(Cleaved Caspase-3)蛋白水平,用黄嘌呤氧化法检测细胞中超氧化物歧化酶(SOD)活性,硫代巴比妥酸法检测细胞中丙二醛(MDA)含量,ELISA法检测细胞分泌胰岛素水平。结果PDCD4 siRNA重组慢病毒能够有效下调高糖条件下胰岛β细胞中PDCD4的表达水平。高糖处理后的胰岛β细胞的增殖能力降低,细胞凋亡率升高,细胞中Cleaved Caspase-3蛋白水平升高,SOD活性降低,MDA含量升高,细胞分泌的胰岛素水平下调。敲低PDCD4可以明显提高高糖环境下胰岛β细胞增殖能力,减少细胞凋亡和细胞中Cleaved Caspase-3蛋白水平,提高细胞中SOD活性,降低细胞中MDA水平,促进细胞分泌胰岛素。结论敲低PDCD4能够通过减轻高糖诱导的胰岛β细胞氧化损伤减少细胞凋亡,促进胰岛β细胞分泌胰岛素。     

Fascin shRNA通过Notch1信号通路调控结直肠癌细胞的生长

目的:研究聚束蛋白(Fascin)shRNA对结直肠癌细胞生长的影响。方法:结直肠癌细胞HT29感染FascinshRNA和shRNAcontrol慢病毒,real-timePCR和Western印迹法分别测定细胞中FascinmRNA和蛋白的表达水平,同时用Western印迹法检测细胞中的Notch1蛋白水平。用Notch1信号通路抑制剂DAPT处理下调Fascin后的HT29细胞,MTT测定细胞增殖,流式细胞术检测细胞周期,Western印迹法检测周期蛋白p27、细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)表达水平。结果:Fascin shRNA慢病毒感染后的细胞中Fascin转录和表达水平均降低,而shRNA control慢病毒感染对细胞中的Fascin表达水平没有影响。沉默Fascin的细胞增殖能力降低,细胞G0/G1比例升高,细胞中Cyclin D1蛋白水平降低,p27蛋白水平升高。沉默Fascin能够降低细胞中Notch1蛋白水平,并且Notch1信号通路抑制剂DAPT可以协同沉默Fascin,进一步抑制结直肠癌细胞增殖,阻滞结直肠癌细胞周期,减少CyclinD1蛋白表达,促进p27蛋白表达。结论:FascinshRNA通过抑制Notch1信号通路阻碍结直肠癌细胞增殖,将细胞周期阻滞在G0/G1期。     

HDAC1对喉癌细胞侵袭、迁移及血管内皮生长因子水平影响

目的研究组蛋白去乙酰化酶1(HDAC1)对喉癌细胞侵袭、迁移及血管内皮生长因子(VEGF)水平影响。方法喉癌细胞Hep2中转染HDAC1 siRNA和siRNA对照记为HDAC1 siRNA组和siRNA-NC组,同时以不做转染的细胞为对照组。qRT-PCR测定细胞中HDAC1 mRNA水平,Western blot检测细胞中HDAC1蛋白水平,Transwell小室检测细胞侵袭,细胞划痕实验检测细胞迁移,ELISA检测培养液上清中VEGF和碱性成纤维细胞生长因子(b FGF)水平,Western blot检测细胞中信号转导与转录因子3(STAT3)、磷酸化的STAT3(p-STAT3)、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)水平。结果 HDAC1 siRNA组细胞中HDAC1 mRNA和蛋白水平均明显低于对照组(P0.05)。siRNA-NC组细胞中HDAC1 mRNA和蛋白水平与对照组相比无显著差异(P0.05)。siRNA-NC组细胞迁移率、侵袭数目及培养液上清中VEGF、b FGF含量均明显降低,细胞中MMP-2、p-STAT3/STAT3水平也下降,与对照组相比差异有显著性(P0.05)。siRNA-NC组细胞迁移率、侵袭数目、MMP-2水平、p-STAT3/STAT3水平及培养液上清中VEGF、b FGF含量与对照组相比无显著差异(P0.05)。结论下调HDAC1表达可降低喉癌细胞侵袭和迁移能力,降低细胞分泌VEGF、b FGF水平,作用机制可能与抑制STAT3信号通路有关。     

FBXO22对乳腺癌细胞侵袭迁移能力的影响

目的探究FBXO22基因沉默后对乳腺癌MDA-MB-231细胞侵袭迁移能力的影响,并初步研究其相关分子机制。方法利用小干扰RNA(siRNA)技术制备FBXO22小片段干扰RNA转染乳腺癌MDAMB-231细胞,下调FBXO22基因表达,通过蛋白质印迹(Western blot)法检测细胞转染效率,细胞划痕实验检测干扰FBXO22基因表达水平对乳腺癌细胞侵袭能力的影响,Transwell小室迁移实验检测下调FBXO22基因表达水平对乳腺癌细胞迁移能力的影响,Western blot法检测下调FBXO22基因表达水平对乳腺癌细胞侵袭迁移相关蛋白表达的影响。结果 FBXO22-siRNA转染后乳腺癌MDA-MB-231细胞中FBXO22蛋白表达明显下降,迁移侵袭能力降低,E-cadherin蛋白水平升高,而波形蛋白的蛋白水平降低,基质金属蛋白酶(MMP)-2和MMP-9水平下降。结论下调FBXO22基因水平能抑制乳腺癌细胞的迁移侵袭能力。其潜在的机制可能为FBXO22基因表达下调抑制了MDA-MB-231上皮细胞-间充质转化进程,并使细胞转移相关重要蛋白--MMP-2和MMP-9表达减少。     

Galectin-3调控Wnt信号通路影响骨肉瘤细胞增殖侵袭的实验研究

目的探讨沉默骨肉瘤细胞中半乳凝集素-3(Galectin-3)的表达对细胞增殖及侵袭的影响及机制。方法从骨肉瘤组织及相应的瘤旁组织中提取总蛋白,Western blot检测Galectin-3的蛋白表达;阴性对照组(NC-siRNA)和RNA干扰组(Galectin-3-siRNA)转染至人骨肉瘤MG63细胞,不经任何处理的细胞作为空白对照组,转染48 h后,提取细胞中的蛋白,Western blot检测各组细胞中Galectin-3的蛋白表达;CCK8实验和Transwell小室分别检测细胞增殖和侵袭能力;Western blot检测ki67、MMP-2、MMP-9、β-catenin、Cyclin D1蛋白表达。结果转染Galectin-3-siRNA能显著降低MG63细胞中Galectin-3的蛋白表达;与对照组及NC-siRNA组比较,Galectin-3-siRNA组细胞存活率及细胞侵袭数显著降低,ki67、MMP-2、MMP-9、β-catenin、Cyclin D1蛋白表达显著下调(P0.05)。结论 Galectin-3在骨肉瘤组织中的表达显著高于瘤旁组织,RNA干扰沉默Galectin-3的表达可显著降低细胞的增殖及侵袭能力,其机制与抑制wnt信号通路有关。     

RNAi抑制IKK/NF-κB信号通路对子宫内膜异位症腺上皮细胞中MMP-9的表达及细胞侵袭性的影响

目的探讨小干扰RNA(siRNA)沉默IκB激酶(IKK)/核因子κB(NF-κB)信号通路对子宫内膜异位症在位内膜腺上皮细胞中基质金属蛋白酶-9(MMP-9)的表达及细胞侵袭性的影响。方法根据基因数据库IKKα的c DNA序列,设计构建合成IKKαsiRNA转染10例EMs患者在位内膜原代腺上皮细胞,设立空白对照组(不加任何siRNA的等比例转染试剂)、阴性对照组(与IKKα同源性极低的无意义链siRNA)及实验组(IKKαsiRNA)。采用Realtime PCR、Western blot、Transwell等方法分别检测IKKαsiRNA转染前后NF-κB、MMP-9 mRNA和蛋白表达及腺上皮细胞侵袭性的变化。结果与空白对照组和阴性对照组比较,实验组EMs腺上皮细胞中NF-кB、MMP-9蛋白及mRNA表达降低,差异有统计学意义(P0.05);IKKαsiRNA转染后EMs腺上皮细胞的细胞侵袭性明显降低,差异有统计学意义(P0.05)。结论 RNA干扰可抑制IKK/NF-κB信号通路进而显著降低细胞的侵袭,这种抑制作用可能是通过下调MMP-9的表达进而改变其侵袭作用诱导EMs的发生。     

YB-1对卵巢癌细胞EMT标志蛋白表达及黏附能力的影响研究

目的研究Y-box结合蛋白(YB-1)对卵巢癌细胞上皮间质转化(EMT)标志蛋白表达及细胞黏附能力的影响。方法在卵巢癌细胞中转染p Genesil-1.1/YB-1 shRNA和p Genesil-1.1/shRNA control,筛选稳定转染的细胞记为YB-1 shRNA组和shRNA-NC组,把没有转染的细胞作为对照组。以Realtime PCR和Western blot方法检测细胞中YB-1表达水平。用四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)方法分别检测细胞增殖和黏附能力,用Western blot检测EMT标志蛋白上皮钙黏附素(E-cadherin)、神经型钙粘素(N-cadherin)和迁移侵袭相关蛋白基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)水平,Transwell小室测定细胞侵袭和迁移情况。结果 YB-1 shRNA组细胞中的YB-1表达水平明显低于对照组和shRNA-NC组(P0.05)。YB-1 shRNA组细胞增殖率和黏附率低于对照组和shRNA-NC组(P0.05)。YB-1 shRNA组细胞中E-cadherin蛋白水平高于对照组和shRNA-NC组,N-cadherin、MMP-2、MMP-9蛋白水平低于对照组和shRNA-NC组,差异具有统计学意义(P0.05)。YB-1 shRNA组细胞侵袭和迁移数目低于对照组和shRNA-NC组(P0.05)。结论下调YB-1促进卵巢癌细胞E-cadherin表达,抑制N-cadherin表达,抑制细胞EMT,降低细胞黏附、侵袭、迁移能力。     

激活Wnt信号通路阻滞沉默ZEB2对结直肠癌细胞增殖抑制和凋亡促进作用

目的研究下调结直肠癌细胞中E盒结合锌指蛋白2(ZEB2)的表达对细胞增殖的影响。方法 ZEB2 shRNA组、ZEB2 shRNA+氯化锂(LiCl)组细胞用感染ZEB2 shRNA慢病毒之后的SW48细胞,shRNA-NC组细胞用感染shRNA-control慢病毒之后的SW48细胞,ZEB2 shRNA+Li Cl组细胞在实验开始时在细胞培养液中添加20 mmol/L的Wnt/β-catenin通路激活剂LiCl。对照组细胞不作任何处理。以实时荧光PCR和Western blot检测结肠细胞中ZEB2的表达水平。用Western blot法测定下调ZEB2后的结直肠癌细胞中Wnt信号通路蛋白β-连环蛋白(β-catenin)、c-Myc表达水平。用Wnt信号通路激活剂处理下调ZEB2后的结直肠癌细胞,CCK8检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡,Western blot检测细胞中凋亡相关蛋白剪切型Caspase-9(c-caspase-9)、剪切型Caspase-3(ccaspase-3)水平。结果 ZEB2在结直肠癌细胞中的表达水平高于正常结肠细胞。ZEB2 shRNA慢病毒感染可以下调结直肠癌细胞中ZEB2的表达。沉默ZEB2后的结直肠癌细胞的增殖能力降低,细胞凋亡增多,细胞中c-caspase-9、c-caspase-3蛋白水平升高,β-catenin、c-Myc蛋白水平降低。Wnt信号通路激活剂可以逆转沉默ZEB2后结直肠癌细胞增殖抑制和凋亡促进作用。结论沉默ZEB2诱导结直肠癌细胞凋亡并抑制细胞增殖,而Wnt信号通路激活剂可以逆转沉默ZEB2的这种作用。     

ERCC1 siRNA对鼻咽癌细胞HNE-1/DDP顺铂耐药的影响及机制

目的:研究切除修复交叉互补基因1(excision repair cross complement 1,ERCC1)siRNA对鼻咽癌细胞HNE-1/顺铂(cisplatin,DDP)耐药的影响及机制。方法:以qRT-PCR和Western印迹法测定人鼻咽癌细胞HNE-1/DDP和HNE-1细胞中ERCC1表达水平。人鼻咽癌细胞HNE-1/DDP转染ERCC1siRNA重组慢病毒载体和阴性对照载体,以qRT-PCR和Western印迹法测定干扰效果。用DDP处理转染ERCC1 siRNA的HNE-1/DDP细胞,MTT检测细胞增殖变化,克隆形成实验检测细胞克隆形成能力,流式细胞术检测细胞凋亡变化,Western印迹法检测细胞中激活型caspase-3(C-caspase-3)、激活型caspase-9(C-caspase-9)蛋白水平,同时用Western印迹法检测细胞质和线粒体中细胞色素C(cy tochromeC)蛋白水平。结果:HNE-1/DDP细胞中ERCC1表达水平高于HNE-1细胞。ERCC1siRNA可明显下调HNE-1/DDP细胞中ERCC1的表达和转录。DDP和ERCC1siRNA可以降低HNE-1/DDP细胞增殖能力和克隆形成能力,提高细胞凋亡率,促进细胞中C-caspase-3,C-caspase-9蛋白表达,提高细胞质中cytochrome C蛋白水平,降低线粒体中cytochrome C蛋白水平。DDP处理转染ERCC1 siRNA的HNE-1/DDP细胞,细胞的增殖和克隆能力下降更多,细胞凋亡率升高更多,细胞中C-caspase-3,C-caspase-9蛋白水平更高,细胞质中cytochrome C蛋白水平也更高,线粒体中cytochromeC蛋白水平下降更多。结论:ERCC1siRNA能够逆转鼻咽癌细胞HNE-1/DDP对DDP耐药,作用机制可能与激活线粒体凋亡途径有关。     

PKCα对AngⅡ作用的心肌成纤维细胞增殖活性和NO分泌的影响

目的探讨蛋白激酶Cα(PKCα)对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)作用后的心肌成纤维细胞增殖活性和一氧化氮(NO)分泌的影响。方法分离培养乳鼠心肌成纤维细胞,分为对照组(正常培养)、AngⅡ组(AngⅡ处理)、实验组(PKCα抑制剂D4681和AngⅡ处理)。实时定量PCR和Western blot法测定细胞中的PKCαmRNA和蛋白水平。用PKCα抑制剂和AngⅡ共同处理心肌成纤维细胞,四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)测定细胞增殖活性,硝酸还原法测定细胞分泌的NO水平,酶联免疫吸附(ELISA)法测定培养液中的诱导型一氧化氮合成酶(i NOS)含量,羟脯氨酸法测定细胞合成胶原蛋白水平,Western blot法测定各组细胞表达基质金属蛋白酶-1(MMP-1)、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、Ⅰ型胶原(COLLⅠ)、Ⅱ型胶原(COLLⅡ)水平。结果 AngⅡ组心肌成纤维细胞中的PKCαmRNA和蛋白水平均明显高于对照组(P0.05)。AngⅡ组心肌成纤维细胞增殖活性升高,细胞分泌的NO含量和i NOS活性均下降,细胞合成胶原蛋白水平升高,细胞中的MMP-1、MMP-2蛋白水平下降,COLLⅠ、COLLⅡ蛋白水平升高,与对照组相比差异具有统计学意义(P0.05)。实验组心肌成纤维细胞增殖活性降低,细胞分泌的NO含量和i NOS活性升高,胶原蛋白合成减少,细胞中MMP-1、MMP-2蛋白表达增多,COLLⅠ、COLLⅡ蛋白表达减少,与AngⅡ组相比差异具有统计学意义(P0.05)。结论 PKCα在AngⅡ作用后的心肌成纤维细胞中表达升高,抑制PKCα可以减弱AngⅡ诱导的心肌成纤维细胞增殖作用,促进细胞分泌NO。     

组蛋白去乙酰化酶1对肝癌细胞增殖凋亡的影响

目的探讨组蛋白去乙酰化酶1(HDAC1)对肝癌细胞增殖凋亡的影响。方法肝癌细胞SNU-449转染HDAC1小干扰RNA(HDAC1 siRNA)和小干扰RNA阴性对照(siRNA control),同时设置不转染的细胞为对照。采用RT-PCR检测细胞中HDAC1mRNA的表达水平,Western blot检测细胞中HDAC1、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Cleaved Caspase-3)、信号转导与转录因子3(STAT3)、磷酸化的STAT3(p-STAT3)蛋白表达水平,噻唑蓝(MTT)检测细胞增殖情况,流式细胞术检测细胞凋亡情况。结果肝癌细胞转染siRNA control后,细胞存活率、凋亡率及细胞中HDAC1、Cleaved Caspase-3、STAT3、p-STAT3表达水平与对照细胞相比无显著差异(P0.05)。肝癌细胞转染HDAC1 siRNA后,细胞中HDAC1mRNA和蛋白表达水平与对照细胞相比均受到抑制,并且细胞存活率只有(63.74±8.37)%,而细胞凋亡率升高为(32.84±6.92)%,细胞中Cleaved Caspase-3蛋白水平升高,p-STAT3蛋白水平降低。结论干扰HDAC1表达能够促进肝癌细胞凋亡,抑制肝癌细胞增殖,作用机制可能与STAT3信号通有关。     

沉默Bax基因对TNF-α诱导肺泡上皮细胞凋亡的影响

目的探讨沉默Bcl-2相关X蛋白(Bax)对肿瘤坏死因子-α(TNF-α)诱导肺泡上皮细胞凋亡的影响。方法用0 ng/ml、10 ng/ml的TNF-α作用于人A549细胞,RT-PCR和Western blot检测细胞中Bax表达水平。A549细胞转染Bax小干扰RNA(Bax siRNA)、小干扰RNA阴性对照(siRNA control),RT-PCR和Western blot检测细胞中Bax表达水平。细胞分为空白对照组(未转染细胞)、TNF-α组(未转染细胞,培养液中含有10 ng/ml的TNF-α)、阴性对照组(转染siRNA control后的细胞,培养液中含有10 ng/ml的TNF-α)、干扰组(转染Bax siRNA后的细胞,培养液中含有10 ng/ml的TNF-α)。流式细胞术检测各组细胞凋亡情况,Western blot检测细胞中p38、磷酸化的p38(p-p38)、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Cleaved Caspase-3)的表达。结果 10 ng/ml的TNF-α作用后的细胞中Bax mRNA和蛋白表达水平升高。转染Bax siRNA后细胞中Bax mRNA和蛋白水平均降低。空白对照组、TNF-α组、阴性对照组、干扰组细胞凋亡率依次为:(0.92±0.01)%、(7.94±0.19)%、(7.93±0.17)%、(4.62±0.13)%。TNF-α组、阴性对照组、干扰组细胞中p-p38、Cleaved Caspase-3表达水平均明显高于空白对照组(P0.01)。干扰组细胞中p-p38、Cleaved Caspase-3表达水平均明显低于TNF-α组(P0.01)。结论 TNF-α能够诱导肺泡上皮细胞凋亡,而沉默Bax能够部分逆转TNF-α促凋亡作用,作用机制可能与p38信号通路有关。     

fmnl2基因沉默抑制SW620体外侵袭能力的机制

目的研究fmnl2基因沉默抑制SW620体外侵袭能力的机制。方法筛选并建立fmnl2基因沉默的SW620细胞;反转录(RT)-聚合酶链反应(PCR)和蛋白质印迹(Western blot)检测干扰效率;Boyden试验检测fmnl2基因对SW620侵袭能力的影响。利用Active Rho pull-down试验和Western blot检测fmnl2基因沉默后,细胞中RhoA、RhoB、RhoC活性和蛋白水平的变化;利用Western blot检测RhoA/Rock信号转导通路中3种效应蛋白[Phospho-肌球蛋白轻链(MLC)、Phospho-LIM激酶(LIMK)、Phospho-Cofilin]及细胞内肌动蛋白纤维(F-actin)、核内MAL的蛋白变化。检测fmnl2基因沉默前后,磷脂酸(LPA)对细胞体外侵袭能力、RhoA的活性和蛋白水平、Phospho-MLC及MLC的影响。结果 fmnl2基因沉默后明显抑制SW620体外侵袭能力。fmnl2表达沉默后,细胞中RhoA活性降低,但蛋白水平没有明显变化;细胞中Phospho-Cofilin、Phospho-LIMK、Phospho-MLC、F-actin和核内MAL的蛋白水平均减少。fmnl2表达沉默后,LPA对细胞体外侵袭能力,RhoA活性及Phospho-MLC均无影响。结论 fmnl2表达沉默后,通过抑制RhoA/Rock信号转导通路,会影响肿瘤细胞的侵袭运动能力。     

沉默MADD基因诱导甲状腺癌细胞凋亡及机制研究

目的研究沉默有丝分裂原激酶活化死亡结构域蛋白(MADD)基因对甲状腺癌细胞SW579凋亡的影响,并探讨其作用机制。方法体外培养人甲状腺癌细胞SW579,将MADD小干扰RNA(MADD siRNA)转染至甲状腺癌细胞,同时转染阴性对照(siRNA Control)。采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和蛋白质印迹法(Western blot)分别检测细胞中MADD的表达,确定转染效率。当细胞转染后48 h,采用噻唑蓝(MTT)法检测细胞增殖情况,采用流式细胞仪检测细胞凋亡情况,采用Western blot检测细胞中活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Cleaved Caspase-3)和Bcl-2相关X蛋白(Bax)蛋白的表达情况。结果转染后甲状腺癌细胞中MADD的转录和表达水平显著降低,与对照组相比,差异具有统计学意义(P0.05);MTT法检测结果显示沉默MADD能够抑制甲状腺癌细胞增殖;流式细胞术检测结果显示,沉默MADD能够诱导甲状腺癌细胞凋亡;Western blot检测结果显示,沉默MADD能够上调甲状腺癌细胞中Cleaved Caspase-3和Bax蛋白的表达,差异有统计学意义(P0.05)。结论沉默MADD能够在体外抑制甲状腺癌细胞增殖,诱导细胞凋亡,其作用机制可能与活化Caspase-3及上调Bax蛋白的表达相关。     

三氧化二砷抑制NB4细胞增殖机制的探讨

目的 通过检测NB4细胞活化JAK1蛋白水平探讨三氧化二砷(As2O3)对其增殖抑制的分子生物学机制.方法 利用Western blot检测NB4细胞JAK1蛋白表达及磷酸化水平;用小分子RNA(siRNA)干扰NB4细胞JAK1蛋白的表达及转染JAK1质粒使NB4细胞内JAK1过表达;应用MTF法及锥虫蓝拒染法观察在JAK1基因沉默或过表达的状态下,As2O3抑制NB4细胞增殖的变化情况;在此基础上利用Western blot方法进一步检测磷酸化JAK1蛋白(P-JAK1)及细胞周期抑制蛋白P21的变化.结果 NB4细胞内可检测到JAK1蛋白稳定表达,但未检测到其磷酸化;As2O3作用NB4细胞后,JAK1磷酸化水平增强;JAK1 siRNA转染NB4细胞后JAK1蛋白表达水平明显低于非特异性siRNA转染组(即lamin siRNA转染组)及空白对照组;且在JAK1 siRNA转染组As2O3抑制NB4细胞增殖作用减弱,4μmol/L As2O3对JAK1 siRNA转染组NB4细胞增殖抑制率为49.12%,较非特异性siRNA组(74.58%)及空白对照组(72.33%)明显下降;JAK1质粒转染NB4细胞后野生型及突变型JAK1质粒组较空质粒组JAK1蛋白表达水平显著升高,且在野生型JAK1质粒转染组,As2O3抑制NB4细胞增殖作用增强,4 μmol/L As2O3对野生型JAK1质粒转染组NB4细胞增殖抑制率为69.53%,较突变型JAK1质粒组(37.26%)及空质粒组(39.61%)明显升高;As2O3作用NB4细胞后P21蛋白的表达水平上调.结论 JAK1蛋白在NIM细胞内稳定表达但没有活性;As2O3通过激活JAK1蛋白抑制NB4细胞增殖;As2O3激活JAK1蛋白后通过上调P21的表达而抑制NB4细胞增殖.     

ATF4对皮肤癌细胞增殖的影响及相关机制

目的:探讨沉默/过表达ATF4对人皮肤癌细胞增殖的影响及其相关作用机制。方法:Western blot技术检测不同类型皮肤癌细胞中ATF4的蛋白表达水平。构建ATF4沉默/过表达的A431皮肤癌细胞株,采用CCK-8法、克隆形成实验和流式细胞术检测A431细胞增殖能力的变化及细胞周期分布;Western blot技术检测细胞周期调控因子cyclin D1、cyclin E、P21和p-Rb/Rb的蛋白表达水平。结果:ATF4在3种不同类型的皮肤癌细胞中均呈高表达。CCK-8法和克隆形成实验结果显示沉默ATF4的A431细胞存活率和增殖能力均显著降低(P0.05),而过表达ATF4可促进A431细胞的增殖;流式细胞仪检测结果显示沉默ATF4可明显抑制A431细胞从G0/G1期向S期转换,过表达ATF4则促进其G1/S转换。同时Western blot实验结果显示沉默ATF4后,cyclin D1、cyclin E和p-Rb的蛋白水平均显著降低,而P21的蛋白表达显著增加(P0.05),过表达ATF4后则cyclin D1、cyclin E和p-Rb的蛋白水平显著增加,而P21的蛋白表达显著降低(P0.05)。结论:ATF4能够促进人皮肤鳞状细胞癌细胞株A431的增殖,其潜在作用机制可能与促进细胞周期G1/S转换及影响相关周期调控因子的表达有关,提示ATF4可作为治疗皮肤癌的一个潜在作用靶点。