白细胞介素17促进主动脉瓣膜间质细胞向成骨样细胞转化

目的研究白细胞介素17(IL-17)是否促进主动脉瓣膜钙化形成及其可能机制。方法利用体外主动脉瓣膜间质细胞培养技术,瓣膜间质细胞培养传代3⁵次后,采用简单随机抽样法分为两组:(1)对照组,细胞培养基中添加2 ml RPMI-1640完全培养液;(2)实验组,细胞培养基中添加2 ml RPMI-1640完全培养液和IL-17(50 ng/ml)。继续孵育48 h后,用细胞茜素红钙染色检测两组瓣膜间质细胞钙化情况,用Western blot和RT-PCR检测两组瓣膜间质细胞碱性磷酸酶(ALP)及骨形态蛋白2(BMP-2)的表达情况。结果实验组细胞中明显钙结节形成,对照组细胞中少量钙结节形成;与对照组比较,实验组细胞ALP和BMP-2蛋白(0.741±0.063比0.184±0.032;0.900±0.060比0.396±0.030,均为P<0.01)与基因(0.236±0.004比0.106±0.003;0.523±0.052比0.194±0.047,均为P<0.01)表达量均明显升高。结论 IL-17可促进主动脉瓣膜间质细胞向成骨样细胞转化。     

有机磷酸盐-与无机磷酸盐-钙化诱导培养基诱导主动脉瓣膜间质细胞钙化效果的对比研究

目的比较有机磷酸盐(OP)-与无机磷酸盐(IP)-钙化诱导培养基(OIM)诱导主动脉瓣膜间质细胞(AVICs)钙化的效果。方法主动脉瓣膜来源于2017年1—10月在第二军医大学附属长海医院行心脏移植的患者,取外观正常的主动脉瓣膜备用,采用改良的二次胶原酶消化法分离AVICs并随机分为A组和B组,A组采用普通培养基+OP-OIM进行培养,B组采用普通培养基+IP-OIM进行培养。采用茜素红染色检测钙化结节,采用邻甲酚酞络合酮比色法检测钙含量,采用实时荧光定量聚合酶链反应检测Runt相关转录因子2(RUNΧ2)、碱性磷酸酶(ALP)mRNA相对表达量,采用蛋白质免疫印迹法检测RUNΧ2蛋白相对表达量,采用对硝基苯酚比色法检测ALP活性。结果 (1)细胞免疫荧光检测结果显示,分离得到的细胞Vimentin阳性率接近100%。流式细胞术检测结果显示,分离得到的细胞CD31阳性率为1.17%。(2)A组细胞培养21 d可见大量橘红色钙化结节,B组细胞培养7 d可见大量橘红色钙化结节。A组细胞培养21 d和B组细胞培养7 d钙含量比较,差异无统计学意义(P0.05)。(3)以细胞培养0 d作为对照,A组细胞培养21 d与B组细胞培养7 d RUNΧ2 mRNA相对表达量比较,差异无统计学意义(P0.05);但A组细胞培养21 d与B组细胞培养7 d ALP mRNA相对表达量比较,差异有统计学意义(P0.05)。(4)两组细胞培养0 d RUNΧ2蛋白相对表达量比较,差异无统计学意义(P0.05);A组细胞培养21 d与B组细胞培养7 d RUNΧ2蛋白相对表达量比较,差异无统计学意义(P0.05)。(5)两组细胞培养0 d ALP活性比较,差异无统计学意义(P0.05);A组细胞培养21 d与B组细胞培养7 d ALP活性比较,差异无统计学意义(P0.05)。结论IP-OIM培养7 d与OP-OIM培养21 d诱导的AVICs钙化效果相当,IP-OIM诱导AVICs钙化较OP-OIM缩短14 d,可替代OP-OIM快速有效地建立体外AVICs钙化模型。     

高糖诱导大鼠心脏瓣膜间质细胞钙化的初步研究

目的初步探讨高糖诱导大鼠主动脉瓣膜间质细胞钙化的现象。方法采用细胞培养,免疫荧光(IF)鉴定,von-kossa钙化测定,western blot,real-time PCR等方法对高糖诱导大鼠主动脉瓣间质细胞钙化的现象进行初步研究。结果在高糖刺激下,随着培养时间的延长,主动脉瓣膜间质细胞中碱性磷酸酶(ALP)的表达增加,骨形态生成蛋白2(BMP2)、BMP4呈现上升趋势,钙化结节形成的数目增多(P<0.05),0 d组结节数目为(0.30±0.05),7 d组为(1.10±0.12),而14 d组结节数目为(2.70±0.30),明显增多。而在低糖条件下,培养相同时间,没有观察到钙化结节的形成。结论高糖能够诱导主动脉瓣膜间质细胞发生钙化,可能与骨化相关因子ALP、BMP2,BMP4的表达增加有关。     

BMP信号通路在华法林诱导的大鼠血管平滑肌细胞钙化中的作用

目的探讨骨形态发生蛋白(BMP)信号通路在华法林诱导的大鼠血管平滑肌细胞(VSMC)钙化中的作用。方法体外分离培养大鼠胸主动脉VSMC,将其随机分为正常对照组、高磷组、华法林(10μmol/L)干预组及华法林(10μmol/L)+维生素K(10μmol/L)干预组。对细胞进行钙含量和碱性磷酸酶(ALP)活性检测,茜素红染色检测钙结节,Western blot检测细胞中Runx2蛋白的表达变化,RT-PCR检测细胞中骨形态发生蛋白2(BMP-2)、Smad1及Runx2的表达变化。结果茜素红染色结果显示,与正常对照组和高磷组相比,华法林干预组钙化结节明显增多;钙含量测定结果与茜素红染色结果基本一致。与正常对照组和高磷组相比,华法林干预组ALP活性明显增加(P0.05),Runx2 mRNA和蛋白表达水平及BMP-2、Smad1 mRNA表达明显增高(P0.05);与华法林干预组相比,华法林+维生素K干预组细胞钙含量、ALP活性及BMP-2、Smad1、Runx2的表达均明显降低(P0.05)。结论BMP信号通路参与了华法林促进的大鼠VSMC钙化,其可能的作用机制是介导了VSMC的表型转化。     

姜黄素对维生素D3和尼古丁诱导血管钙化大鼠血管中组织蛋白酶D表达的影响

目的研究组织蛋白酶D(CTSD)在大鼠动脉钙化模型中的表达以及姜黄素对其表达的影响。方法将30只雄性SD大鼠随机分成3组,每组10只,即对照组、钙化组和干预组。对照组大鼠给予等量生理盐水处理,钙化组大鼠用维生素D3和尼古丁处理,干预组大鼠在钙化组处理的基础上加用姜黄素干预。用von Kossa染色检测血管钙化,试剂盒检测血管钙含量和碱性磷酸酶活性,Western blot检测骨形态发生蛋白2(BMP-2)、Runx2和CTSD的蛋白表达,用免疫组织化学染色观察CTSD在血管中的表达及分布。结果维生素D3和尼古丁能够诱导经典大鼠钙化模型,von Kossa染色结果显示钙化组大鼠胸主动脉有大量黑色颗粒沉积,血管钙含量和碱性磷酸酶活性升高,Western blot检测结果显示BMP-2和Runx2表达显著上调;使用姜黄素干预后,与钙化组相比,大鼠胸主动脉钙化程度明显减轻,血管钙含量和碱性磷酸酶活性下降,BMP-2和Runx2表达下调。免疫组织化学染色结果显示钙化组CTSD表达上调且大量分布在细胞外基质中,姜黄素能够显著下调CTSD的表达并减少其在细胞外基质中的分布。结论姜黄素具有抑制血管钙化的作用,可能与其能够减少CTSD在细胞外基质中的表达有关。     

酸性环境对慢性肾功能衰竭大鼠血管中膜钙化的影响及其机制

目的探讨酸性环境对慢性肾功能衰竭大鼠血管中膜钙化的影响及可能的作用机制。方法体内实验:将雄性SD大鼠随机分为对照组、肾功能衰竭组、血管钙化组和酸干预组,造模成功后采用von Kossa染色和邻甲酚酞络合酮比色法测定大鼠胸主动脉血管钙化情况。体外实验:分离培养SD大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞(VSMC),随机分为正常对照组、高磷组、酸干预组和抑制剂组(BMP信号通路抑制剂Noggin),采用茜素红染色和邻甲酚酞络合酮比色法检测细胞钙化情况,酶联免疫吸附法检测细胞碱性磷酸酶(ALP)活性,RT-PCR和Western blot检测细胞BMP-2、Smad1、Runx2的表达情况。结果体内实验:成功制备了慢性肾功能衰竭大鼠血管钙化模型;与血管钙化组相比,酸干预组大鼠血管钙盐沉积明显减轻(P0.05)。体外实验:与正常对照组相比,高磷组细胞钙盐沉积明显增加(P0.05),ALP活性和Runx2表达均增高(P0.05);与高磷组相比,酸干预组细胞钙盐沉积减少(P0.05),ALP活性、Runx2、BMP-2和Smad1表达均降低(P0.05);与高磷组相比,抑制剂组细胞钙盐沉积和Runx2表达均降低(P0.05)。结论酸性环境可以抑制慢性肾功能衰竭大鼠血管中膜钙化的发生,其可能的机制之一是通过BMP-2信号通路抑制了VSMC成骨/成软骨样表型转化来实现的。     

主动脉瓣体外钙化模型的建立

目的:探讨一种体外分离、扩增瓣膜间质细胞并诱导钙化的方法,建立体外瓣膜细胞钙化模型。方法:采用胶原酶消化法从新鲜猪主动脉瓣膜上分离并体外扩增瓣膜间质细胞,免疫荧光染色行细胞鉴定。4～8代间质细胞以含β-甘油磷酸的钙化培养基钙化诱导培养2周。钙化结节计数,茜素红S染色观察并检测钙沉积。实时定量逆转录聚合酶链反应(Real Time rt-PCR)检测α-平滑肌波动蛋白(α-SMA)及钙化相关因子骨钙素、骨桥蛋白、核心结合因子a1(Cbfa1)表达。结果:胶原酶消化法可从猪主动脉瓣膜上成功分离并体外扩增瓣膜间质细胞,α-SMA和波形蛋白(Vimentin)免疫荧光染色阳性,血管性血友病因子(vWF)染色阴性。钙化培养基体外钙化诱导培养1～2周可成功诱导钙化,间质细胞自发形成钙化结节,茜素红S染色阳性,钙沉积明显增加(P0.05)。实时定量逆转录PCR提示钙化间质细胞α-SMA表达上调,并相对高表达钙化相关因子(P0.05)。结论:胶原酶法联合钙化培养基可成功体外构建主动脉瓣膜细胞钙化模型。     

钙磷诱导大鼠血管平滑肌细胞钙化的机制研究

目的：探讨氧化应激损伤在钙磷诱导的血管平滑肌细胞（VSMCs）钙化过程中的作用机制。
　　方法：采用氯化钙（CaCl2）联合β-甘油磷酸钠（β-GP）建立大鼠VSMCs钙化模型。实验分为4组,对照组、钙化组、钙化+过氧化氢（H2O2）组和钙化+过氧化氢酶组。8天后分别通过茜素红S染色法和邻甲酚肽络合酮比色法检测各组细胞钙结节形成及钙含量;活性氧检测试剂盒（DCFH-DA探针）检测各组细胞活性氧阳性细胞数;蛋白免疫印迹法检测各组细胞中成骨转录因子Runx2的蛋白表达量。
　　结果：钙化组活性氧的产生、钙结节、钙含量及Runx2蛋白表达量均显著高于对照组,钙化+过氧化氢组与钙化组相比,各项指标进一步升高,差异有统计学意义（P<0.05）。钙化+过氧化氢酶组活性氧产生量、钙结节、钙含量及Runx2蛋白表达量均低于钙化组和钙化+过氧化氢组,仍高于对照组,差异有统计学意义（P<0.05）,但其中Runx2蛋白表达量与对照组相比则差异无统计学意义（P>0.05）。
　　结论：氯化钙联合β-GP通过激活ROS-Runx2信号通路诱导大鼠VSMCs钙化形成。     

Notch1蛋白在人心脏瓣膜间质细胞凋亡与钙化关系中的作用

目的用人心脏瓣膜间质细胞(hVICs)在体外培养并用钙化诱导液建立瓣膜钙化模型,观察hVICs钙化过程中Notch1蛋白表达及细胞凋亡情况,探讨Notch1蛋白在hVICs凋亡与钙化关系中的作用。方法将体外培养的hVICs随机分为两组,钙化组用含钙化诱导液的培养基培养,以建立钙化模型,并按1~7天分别诱导细胞,观察钙化的动态过程;空白组用正常培养基(I-GRO PLUS)培养。所有hVICs均培养7天。检测两组细胞钙化结节数目、BMP-4蛋白、Notch1蛋白的表达及hVICs凋亡率。然后将钙化组中诱导钙化细胞再随机分脂多糖组(LPS)、Notch1抑制剂组(γ分泌酶抑制剂,DAPT)、对照组(只加钙化诱导液)体外培养3天,检测BMP-4、Notch1、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspase3)的表达。结果与空白组细胞比较,钙化组细胞钙化及Notch1蛋白的表达均高于空白组,且随着诱导天数的增加而增加;细胞凋亡率在钙化诱导3天时最高,随后逐渐下降。LPS组与对照组比较,细胞凋亡和钙化均随着Notch1蛋白的表达增加而增加;DAPT组与对照组比较,细胞凋亡和钙化均减少。结论hVICs钙化与细胞凋亡有着密切的关系,且Notch1蛋白在hVICs凋亡与钙化关系中起着重要的作用。     

过氧化体增殖物激活型受体γ抑制转化生长因子β1诱导的血管平滑肌细胞钙化

目的探讨过氧化体增殖物激活型受体γ(PPARγ)对转化生长因子β1(TGF-β1)诱导的大鼠主动脉血管平滑肌细胞(VSMC)钙化的作用。方法体外培养大鼠主动脉VSMC,先分为正常对照组、不同浓度TGF-β1组(1、2、4、8μg/L),观察TGF-β1对VSMC的影响;再分为正常对照组、钙化组(TGF-β1 4μg/L)、罗格列酮(RSG,20μmol/L)组、钙化+罗格列酮(RSG,20μmol/L)组,观察PPARγ激动剂罗格列酮对VSMC钙化后的作用,对细胞进行钙含量和碱性磷酸酶(ALP)活性检测,茜素红S染色检测钙化结节的形成情况,Western blot检测VSMC标志物α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、PPARγ、成骨样细胞标志物Runt相关转录因子2(Runx2)的蛋白表达情况。结果与正常对照组相比,TGF-β1处理后的VSMC钙盐沉积和ALP活性明显升高(P0.05),且TGF-β1浓度为4μg/L时作用最明显,成骨样细胞标志物Runx2表达明显升高(P0.05),同时平滑肌细胞标志物α-SMA表达减少(P0.05)。而加入罗格列酮后,VSMC的钙盐沉积和ALP活性明显降低(P0.05),α-SMA、PPARγ表达明显上升(P0.05),相反,Runx2的表达则明显受到抑制(P0.05)。结论 TGF-β1可以诱导VSMC向成骨样细胞分化和钙化,而PPARγ激动剂罗格列酮可以抑制TGF-β1诱导下VSMC钙化的发生。     

血清BMP-2、BMP-4检测在慢性肾脏病大鼠主动脉钙化中的意义

目的建立慢性肾脏病(CKD)大鼠主动脉钙化模型,探讨血清骨形态发生蛋白2(BMP-2)、骨形态发生蛋白4(BMP-4)与主动脉钙化程度的相关性。方法 55只SD大鼠随机分为对照组(20只)和CKD组(35只,由于预实验中CKD组大鼠后期存在死亡现象,为保证实验过程每个时间的实验样本量充足,因此CKD组样本量较对照组多),分别于第2、4、6、8周收集血液、尿液、主动脉、肾脏;肾脏HE染色评估肾脏病理改变;茜素红染色法、钙含量测定评估主动脉钙化程度; ELISA测定大鼠血清BMP-2、BMP-4水平;免疫组织化学检测主动脉BMP-2、BMP-4蛋白表达。结果与对照组各时间点相比,CKD组大鼠24 h尿蛋白定量、血清尿素氮、肌酐、胱抑素C水平明显增加(P0.05)。肾脏HE染色显示,自第2周起,肾小管出现扩张,小管内棕黄色物质沉积,随时间进展,逐渐出现间质纤维化,肾小球部分萎缩,血管减少,炎性细胞浸润。茜素红染色随时间进展,第8周出现大量橘红色颗粒物沉积伴钙结节形成。CKD组钙含量明显增加且与血清BMP-2 (r=0.929,P0.01)及BMP-4 (r=0.702,P0.01)明显正相关。同时,自模型成功建立第4周,主动脉BMP-2、BMP-4蛋白表达即明显增加。结论血清BMP-2、BMP-4表达增加可作为CKD血管钙化的血清标志物。     

高表达碳酸酐酶1参与骨化过程的研究

目的 碳酸酐酶1不仅可以催化二氧化碳水化反应,还可以加速碳酸钙的形成,而钙沉淀是新骨形成的重要步骤.本研究以培养细胞为模型探索碳酸酐酶1在骨形成过程中的作用.方法 用成骨诱导培养基(OM)诱导骨肉瘤细胞Saos-2钙化,然后用茜素红染色法观察细胞矿化结节的形成,用荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测细胞骨化标志蛋白核心结合蛋白因子2(Runx2)、成骨细胞特异性转录因子(OSX)、碱性磷酸酶(ALP)、骨钙素和骨涎蛋白(BSP)的表达.用蛋白印迹法和荧光定量PCR检测细胞钙化前后碳酸酐酶1的表达量的变化.用碳酸酐酶抑制剂乙酰唑胺处理Saos-2细胞,观察细胞钙化过程是否被抑制.2组间比较采用t检验,不同时间点的统计学分析采用重复测量的方差分析.结果 Saos-2 细胞在OM诱导后形成大量矿化结节(0.68±0.03与2.76±0.13,P＜0.01),Runx2、ALP、骨钙素、OSX和BSP 转录水平明显升高,显示OM可诱导Saos-2细胞钙化和骨化.Saos-2细胞钙化后碳酸酐酶1表达明显增高(0.25±0.03与0.94±0.06,P＜0.01).Saos-2细胞经乙酰唑胺处理后,碳酸酐酶1的表达量减少(1.09±0.05与0.55±0.07,P＜0.05),矿化结节形成明显减少(2.76±0.13与2.19±0.07,P＜0.01),骨化标志蛋白的表达也明显下降,说明抑制碳酸酐酶1表达可以抑制Saos-2细胞矿化和骨化过程.结论 碳酸酐酶1在新骨形成过程中起着重要作用.     

间歇性碱刺激对高磷诱导的大鼠血管环钙化的影响及可能机制

目的探讨间歇性碱刺激对高磷诱导的大鼠胸主动脉血管环钙化的影响及可能机制。方法体外分离大鼠胸主动脉血管环,将其随机分为正常对照组、高磷组(含10 mmol/Lβ-甘油磷酸的培养基)和间歇性碱刺激组(在高磷培养基的基础上调整pH值为7.7)。干预14天后,采用免疫组织化学方法检测L型钙通道(LTCC)β3亚基、Runt相关转录因子2(Runx2)和平滑肌蛋白22α(SM22α)的表达情况;采用硝酸银染色法和钙含量测定法检测血管环钙化程度。结果与正常对照组相比,高磷组的钙含量、Runx2和LTCCβ3亚基表达水平均增加(P0.001);与高磷组相比,间歇性碱刺激组的钙含量、Runx2和LTCCβ3亚基表达水平均有显著增加(P0.001)。同时,高磷组棕黑色钙化结节较正常对照组增多,间歇性碱刺激组棕黑色钙化结节较高磷组增多。与正常对照组相比,高磷组的SM22α表达水平下降(P0.001);与高磷组相比,间歇性碱刺激组的SM22α表达水平显著下降(P0.001)。相关性分析显示,LTCCβ3亚基与Runx2蛋白表达呈正相关(r=0.740,P=0.002),与SM22α蛋白表达呈负相关(r=-0.670,P=0.006)。结论间歇性碱刺激可以促进高磷诱导的大鼠胸主动脉血管环钙化,其可能通过上调LTCCβ3亚基表达,促进血管平滑肌细胞向成骨/成软骨表型转化,进而促进血管环钙化的发生。     

自噬在高磷诱导的大鼠血管平滑肌细胞钙化过程中的作用研究

目的:探讨自噬在高磷诱导的大鼠血管平滑肌细胞(VSMC)钙化过程中的作用。方法:采用磷酸盐(3.2 mmol/L Pi,即高磷状态)建立大鼠VSMC钙化模型。实验分为三组:对照组、钙化组(分为3个亚组:3.2 mmol/L Pi 4d组、3.2 mmol/L Pi 6d组、3.2 mmol/L Pi 8d组);钙化+3-甲基腺嘌呤(3-MA)组(3.2mmol/L Pi 8 d+5 mmol/L 3-MA)。分别通过茜素红S染色法和邻甲酚肽络合酮比色法检测各组细胞钙结节形成及钙含量;蛋白免疫印迹法检测各组细胞转录因子蛋白(Runx2)、α-肌动蛋白(α-SMA)和自噬相关蛋白—膜型微管蛋白1轻链3β(LC3Ⅱ)蛋白表达量。透射电子显微镜观察VSMC内自噬小体形成情况。免疫荧光显微镜下观察VSMC中LC3和Runx2定位表达。结果:与对照组相比,3.2 mmol/L Pi 8 d组钙结节、钙含量、Runx2和LC3Ⅱ蛋白表达量及自噬小体均显著增高,α-SMA蛋白表达量降低,差异具有统计学意义(P0.05)。与3.2 mmol/L Pi 8 d组相比,钙化+3-MA组细胞钙含量增多,LC3荧光分布量降低,Runx2阳性细胞数增多,差异具有统计学意义(P0.05)。结论:自噬在磷酸盐诱导的VSMC钙化过程中具有保护作用。     

猪心肌缺血后处理对心肌细胞凋亡及Bcl-2、BaX蛋白表达的影响

目的探讨猪心肌缺血后处理对细胞凋亡及Bcl-2、Bax蛋白表达的影响。方法24只小型约克猪被随机分为4组,建立体外循环全心缺血再灌注模型。A组未行心肌缺血处理,B组于升主动脉阻断前进行心肌缺血预处理,C组再灌注开始前行缺血后处理,D组升主动脉阻断前行心肌缺血预处理及再灌注开始前行心脏缺血后处理,观察各组心肌细胞凋亡率及Bcl-2、Bax蛋白表达。结果心肌细胞凋亡率B组(10.46±0.91)%、C组(9.68±0.59)%和D组(11.35±1.37)%显著低于A组(19.75±1.81)%,差异有统计学意义(P<0.05);C组与B组或D组比较无统计学意义(P>0.05)。Bcl-2蛋白表达B组、C组和D组明显高于A组(P<0.05),Bax蛋白表达B组、C组和D组)明显低于A组(P<0.05)。B组、C组和D组间Bcl-2、Bax蛋白表达无统计学意义(P>0.05)。心肌细胞凋亡率与Bax/Bcl-2比值呈正相关(r=0.926,P<0.01)。结论缺血后处理可上调Bcl-2蛋白表达,下调Bax蛋白的表达,抑制心肌细胞凋亡,减轻缺血再灌注损伤。     

高磷对大鼠胸主动脉血管环中骨形成蛋白2表达的影响

目的:探讨骨形成蛋白-2(Bone morphogenetic protein 2,BMP-2)在高磷诱导的大鼠胸主动脉血管环钙化中的作用。方法:选取8~10周龄健康雄性SD大鼠,体外培养大鼠胸主动脉血管环,血管环按随机数字表法随机分为2组:正常对照组和高磷组。血管环培养7d和14d后,采用von Kossa染色及邻甲酚酞络合酮比色法检测大鼠胸主动脉血管环钙化情况;免疫组织化学方法检测血管环BMP-2的表达。体外采用组织块贴壁法培养原代大鼠胸主动脉平滑肌细胞,利用10mmol/Lβ-甘油磷酸制备血管平滑肌细胞钙化模型,细胞随机分为2组:正常对照组、高磷组(10mmol/Lβ-甘油磷酸)。采用茜素红染色及邻甲酚酞络合酮比色法检测细胞钙化情况,RT-PCR和Western blot方法检测细胞培养7d和14d的BMP-2mRNA及蛋白表达,并观察短时间内不同时间点BMP-2蛋白表达情况。结果:体外血管环培养7d、14d后,与正常对照组相比,高磷组钙含量明显增加(P0.05);与7d高磷组血管环钙含量相比,14d高磷组血管环钙含量明显增加(P0.05)。免疫组织化学结果显示,与正常对照组相比,高磷组BMP-2表达增加(P0.05);与7d高磷组相比,14d高磷组血管环钙含量明显增加(P0.05)。细胞培养7d、14d后,与正常对照组相比,高磷组钙盐沉积及钙含量明显增高(P0.05);RTPCR和Western Blot显示,与正常对照组相比,高磷组BMP-2mRNA及蛋白表达增加。进一步动态观察BMP-2蛋白的表达变化,结果显示正常对照组及高磷组BMP-2蛋白表达随时间延长呈增强趋势(P0.05)。结论:BMP-2可能参与了高磷诱导的血管钙化的发生发展。     

Notch2高表达可使人主动脉平滑肌细胞骨形态发生蛋白4表达增加促进钙化

目的观察并验证人主动脉平滑肌细胞(HASMC)Notch2蛋白表达的变化对其细胞钙化的影响,并探讨其机制。方法体外培养HASMC,将其分为两组,分别为正常对照组与诱导钙化组。前者常规培养,后者在常规培养的基础上加用钙化诱导剂β-甘油磷酸(5 mmol/L)、抗坏血酸(50μg/mL)和地塞米松(100 nmol/L),两组细胞均培养7 d。另取上述方法诱导钙化的HASMC为钙化对照组,再设钙化抑制组,即在钙化对照组的基础上加入Notch特异性抑制剂γ-内分泌酶抑制剂(50μmol/L),两组细胞均培养7 d。四组均用白介素-6诱导细胞的炎症反应。采用免疫印迹法检测各组细胞内Notch2、磷酸化核转录因子STAT3(p-STAT3)和骨形态发生蛋白4(BMP-4)的蛋白表达水平;酶联免疫法测定各组细胞培养上清液中BMP-4蛋白的含量;逆转录-聚合酶链反应检测诱导钙化组和正常对照组中HASMC Notch2 mRNA的表达;免疫荧光染色法观察钙化对照组与钙化抑制组中HASMC BMP-4蛋白的表达。结果 (1)诱导钙化组中HASMC Notch2、p-STAT3和BMP-4蛋白表达水平明显...     

过表达及沉默细胞黏附分子1基因膀胱癌细胞株的构建

目的构建过表达及沉默细胞黏附分子1(CADM1)基因的膀胱癌细胞株。方法培养并收集膀胱癌细胞株T24。1过表达CADM1基因T24细胞构建:将T24细胞分为1、2、3组,real-time PCR扩增CADM1基因全长,与慢病毒载体p HBLV-IRES-Zs Green-PGK-puro进行连接(1组),并设载体对照组(2组)和空白对照(3组);经酶切及测序鉴定正确后在293T细胞中包装病毒,病毒浓缩后感染T24细胞。2沉默CADM1基因T24细胞构建:将T24细胞分为A、B、C、D、E组,设计3条针对CADM1基因的干扰序列(siRNA1/2/3)分别与载体p HBLV-U6-shRNA-ZsGreen-Puro进行连接(A、B、C组),D组与p HBLV-U6-Zs Green-Puro进行连接,E组为空白对照;经双酶切、PCR及测序鉴定连接载体,在293T细胞中包装病毒,病毒浓缩后感染T24细胞。采用real-time PCR检测T24细胞中的CADM1 mRNA,Western blotting法检测CADM1蛋白。结果过表达和沉默CADM1基因的慢病毒载体及细胞株均正确构建。1、2、3组CADM1 mRNA相对表达量分别为4.84±0.02、1.12±0.03、1.00±0.00,CADM1蛋白相对表达量分别为4.53±0.03、1.05±0.04、1.00±0.01,1组CADM1 mRNA及蛋白相对表达量高于2、3组(P均<0.05)。A、B、C、D、E组CADM1 mRNA相对表达量分别为0.28±0.05、0.98±0.02、0.74±0.01、0.99±0.01、1.00±0.00,CADM1蛋白相对表达量分别为0.33±0.04、0.86±0.12、0.67±0.07、1.00±0.04、1.00±0.03,A组CADM1 mRNA及蛋白相对表达量低于B、C、D、E组(P均<0.05)。结论成功构建了过表达及沉默CADM1基因的膀胱癌细胞株T24。     

慢性间歇性低压低氧抑制内质网应激改善大鼠血管钙化

目的证实慢性间歇性低压低氧(CIHH)通过抑制内质网应激(ERS)改善大鼠血管钙化。方法使用维生素D3肌注和尼古丁灌胃(VDN)制备的大鼠在体血管钙化模型,检测主动脉组织Ca2+含量和碱性磷酸酶(ALP)活性以及血浆ALP活性,Western blot检测相关蛋白的表达水平。结果与对照组大鼠相比,VDN大鼠主动脉组织Ca2+含量和ALP活性以及血浆ALP活性均显著升高(P0.05),同时主动脉组织平滑肌细胞收缩表型标志蛋白calponin和SM22α的表达水平显著下调(P0.05),成骨样细胞表型标志蛋白骨形态发生蛋白2(BMP2)和RUNX2的表达水平显著上调(P0.05)。而CIHH能够显著改善VDN大鼠的上述改变。此外,VDN大鼠主动脉组织ERS标志蛋白葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、CHOP(C/EBP homologous protein)和active-caspase12的表达水平较对照组大鼠显著升高(P0.05),而CIHH能够显著抑制上述蛋白表达水平的升高(P0.05)。结论 CIHH可能通过抑制ERS,发挥改善血管钙化和平滑肌细胞表型转化的作用。