miR-422a通过ATG12调控骨肉瘤细胞自噬及凋亡的研究

目的探讨miR-422a调控骨肉瘤细胞自噬及凋亡的作用和机制及其与靶基因ATG12的关系。方法采用瞬时转染miR-422a模拟物和抑制物分别上调或下调骨肉瘤细胞的miR-422a表达水平,采用MTT法检测各时间点骨肉瘤细胞的增殖能力,瞬时转染miR-422a后采用流式细胞术检测骨肉瘤细胞凋亡情况,采用实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)检测转染miR-422a对靶基因mRNA的影响。结果RT-qPCR结果显示,miR-422a在肿瘤组织及细胞中均高表达,ATG12在肿瘤组织及细胞中均低表达。MTT法结果显示,miR-422a-mimic组吸光度值明显升高,miR-422a-inhibitor组吸光度值明显降低(P<0.05)。流式细胞术检测结果显示,miR-422a-inhibitor组细胞凋亡率高于空白组与NC组(P<0.0001)。Western blot检测结果显示,miR-422a-mimic组细胞中ATG12、LC3-Ⅱ和LC3-Ⅰ蛋白量明显低于空白组与NC组(P<0.05);miR-422a-inhibitor组细胞中ATG12、LC3-Ⅱ蛋白量明显高于空白组与NC组,LC3-Ⅰ蛋白量明显低于空白组与NC组(P<0.05);miR-422a-inhibitor组细胞中LC3-Ⅱ/Ⅰ明显高于空白组与NC组(P<0.05)。结论miR-422a/ATG12信号轴可能调控骨肉瘤细胞的自噬及凋亡。     

丁苯酞对1-甲基-4-苯基吡啶离子诱导细胞自噬的影响

目的研究丁苯酞对1-甲基-4-苯基吡啶离子(MPP+)诱导的SH-SY5Y细胞自噬相关因子的影响,探讨丁苯酞对帕金森病细胞模型的神经保护作用机制。方法将SH-SY5Y细胞分为空白对照组(A组)、MPP+组(B组)、雷帕霉素预处理+MPP+组(C组)和丁苯酞预处理+MPP+组(D组)。采用噻唑蓝(MTT)比色法测定细胞相对存活率,倒置相差显微镜观察细胞形态的变化,Western blotting检测微管相关蛋白1轻链3(LC3)-Ⅱ/Ⅰ、Beclin 1蛋白表达,RT-PCR检测LC3-Ⅱ/Ⅰ和Beclin 1 m RNA表达。结果 B组SH-SY5Y细胞存活率显著低于A组(t=20.270,P0.001),C组和D组显著高于B组(t8.770,P0.001),且C组和D组间无显著性差异(t=2.270,P=0.064)。与A组相比,B组LC3-Ⅱ/Ⅰ、Beclin 1蛋白和m RNA表达明显增加(t6.647,P0.01);C组和D组明显高于B组(t3.630,P0.01),C组与D组间无显著性差异(t2.238,P≥0.05)。结论丁苯酞可以提高MPP+诱导的SH-SY5Y损伤细胞存活率,其可能通过诱导帕金森病模型细胞自噬,发挥治疗作用。     

miR-92a靶向PTEN促进宫颈癌细胞增殖

目的 探讨微小RNA-92a(miR-92a)对宫颈癌细胞增殖及凋亡的影响,并对其相关的分子机制进行初步探索。方法 采用脂质体瞬转法向宫颈癌细胞SiHa和HeLa分别转染miR-92a inhibitor(inhibitor组)及其阴性对照(NC组),设未处理的宫颈癌细胞为空白对照组。转染48 h后,采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测各组细胞miR-92a和第10号染色体同源丢失性磷酸酶张力蛋白基因(PTEN) mRNA的相对表达量,CCK-8试验和流式细胞术分别检测各组细胞活率和凋亡率,Western blotting检测细胞通路蛋白PTEN和磷酸化的蛋白激酶B(p-AKT)表达情况。结果 与空白对照组比较,inhibitor组miR-92a相对表达量明显降低(P<0.001),PTEN mRNA相对表达量明显升高(P<0.01);与空白对照组和NC组比较,inhibitor组在各时间点细胞活率明显下降(P<0.05),细胞凋亡率明显升高(P<0.01);与空白对照组和NC组比较,inhibitor组PTEN蛋白表达增加,p-AKT蛋白表达降低。结论...     

过表达DcR3对肝癌细胞自噬功能的影响

目的 初步探讨过表达肝癌诱骗受体3(DcR3)对肝癌细胞自噬功能的影响.方法 构建慢病毒载体DcR3稳定转染HepG2细胞株,转染72 h后收集细胞,做进一步处理.以感染空载慢病毒作为对照组(LV-NC组),以感染DcR3过表达慢病毒作为实验组(LV-DcR3组),采用免疫印迹试验(Western blot)检测自噬相关蛋白[微管相关蛋白轻链3B(LC3B)Ⅱ/LC3BⅠ比例、程序性死亡受体1(Beclin1)]的相对表达水平,采用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测LC3B和Beclin1 mRNA相对表达水平.结果 与LV-NC组相比,LV-DcR3组LC3B和Beclin1 mRNA相对表达水平明显降低(P<0.05),进一步研究发现LV-DcR3组LC3BⅡ/LC3BⅠ比例和Beclin1蛋白的相对表达水平显著下降(P<0.05).结论 DcR3可抑制肝癌细胞发生自噬.     

miR-21在前列腺癌中的表达及抑制其表达对前列腺癌细胞增殖凋亡的影响

目的探讨抑制前列腺癌细胞中miR-21基因表达对癌细胞增殖和凋亡的影响及机制。方法 RTPCR检测前列腺癌及癌旁组织中miR-21基因的mRNA表达;空白对照组(Control)、阴性对照组(NC)和miR-21 inhibitor组转染人前列腺癌PC-3细胞,48 h后RT-PCR检测各组细胞中miR-21基因的mRNA表达;CCK8实验检测细胞增殖;流式细胞仪检测细胞凋亡;Western blot检测ki67、Cleaved caspase3、β-catenin、Cyclin D1蛋白表达。结果前列腺癌组织中miR-21的mRNA表达显著高于癌旁组织(P0.01);转染miR-21 inhibitor后miR-21的表达显著降低;NC组细胞存活率、细胞凋亡率及ki67、Cleaved caspase3、β-catenin、Cyclin D1蛋白表达与对照组,差异无统计学意义(P0.05),miR-21 inhibitor组细胞存活率及ki67、β-catenin、Cyclin D1蛋白表达显著低于对照组,细胞凋亡率及Cleaved caspase3蛋白表达显著高于对照组(P0.01)。结论抑制前列腺癌细胞中miR-21基因的表达可降低癌细胞的增殖及诱导细胞凋亡,其机制与抑制Wnt/β-catenin信号通路有关。     

miR-22靶向NLRP3基因对冠心病大鼠内皮细胞炎症损伤的影响研究

目的研究miR-22靶向NLRP3基因对冠心病大鼠内皮细胞炎症损伤的影响。方法选取22只健康SD大鼠进行研究,随机分成研究组和对照组,对照组大鼠不进行特殊处理,研究组构建大鼠动脉粥样硬化(AS)模型,对比两组大鼠血钙和血脂水平、大鼠心肌组织的miR-22和NLRP3、caspase-1mRNA表达水平,以及心肌组织NLRP3、caspase-1蛋白表达水平;在经过细胞转染分组后,分成空白组(未转染)、阴性组、miR-22mimic组、miR-22inhibitor组和miR-22inhibitor+si NLRP3组,对比几组的miR-22和NLRP3、caspase-1mRNA表达水平,NLRP3、caspase-1蛋白表达水平,以及炎症因子表达水平。结果研究组的TC、TG、LDLC和Ca2+水平均明显高于对照组(P0.05);研究组的miR-22水平明显低于对照组,NLRP3、caspase-1mRNA表达水平以及NLRP3、caspase-1蛋白表达水平均明显高于对照组(P0.05);miR-22mimic组的miR-22明显高于空白组,NLRP3、caspase-1mRNA表达显著低于空白组(P0.05),miR-22inhibitor组和空白组的对比结果与之相反(P0.05);miR-22mimic组的NLRP3、caspase-1蛋白表达均明显低于空白组(P0.05),miR-22inhibitor组明显高于空白组(P0.05);miR-22mimic组的IL-1β、IL-6和IL-18水平明显低于空白组和阴性组,IL-10明显高于空白组与阴性组(P0.05),miR-22inhibitor组与空白组及阴性组的炎症因子水平对比结果与之相反(P0.05)。结论 miR-22能够利用显著的NLRP3基因靶向抑制效果,改善冠心病大鼠的内皮细胞凋亡状况,且能够促进炎症因子水平的下降,具有显著的内皮细胞保护作用。     

肝细胞生长因子激活剂的抑制剂-1基因对宫颈癌细胞自噬及凋亡调控的影响

目的探讨肝细胞生长因子激活剂的抑制剂-1(hepatocyte growth factor activator inhibitor-1, HAI-1)基因对宫颈癌细胞自噬及凋亡调控的机制。方法对数生长期HeLa细胞分为转染组和对照组,转染组转染HAI-1质粒,对照组细胞正常培养。采用实时荧光定量PCR法检测2组细胞HAI-1 mRNA表达情况,采用AO染色和流式细胞术检测2组细胞自噬情况,采用ELISA检测2组细胞自噬相关因子LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ和Beclin-1蛋白水平,应用流式细胞仪检测2组细胞凋亡率,采用Western blot法检测细胞Bax和Bcl-2蛋白相对表达量。结果转染组细胞HAI-1 mRNA相对表达量(1.57±0.26)、AO细胞荧光强度(52.14±3.88)、LC3-Ⅱ蛋白[(3.42±0.85)μg/L]、Beclin-1蛋白[(14.69±1.96)μg/L]水平、细胞凋亡率[(86.75±6.42)%]、Bax蛋白相对表达量(1.24±0.13)和Bax/Bcl-2(7.75±0.83)高于对照组[0.48±0.09、5.47±0.32、(1.10±0.22)μg/L、(10.12±0.53)μg/L、(12.64±1.33)%、0.25±0.06、0.17±0.05)](P0.05),LC3-Ⅰ蛋白水平[(0.59±0.11)μg/L]、Bcl-2蛋白相对表达量(0.16±0.04)低于对照组[(3.26±0.82)μg/L、1.47±0.15](P0.05)。结论 HAI-1转染通过增加HeLa细胞中LC3-Ⅱ和Beclin-1蛋白表达,降低LC3-Ⅰ蛋白表达,提高Bax/Bcl-2来调节宫颈癌细胞的自噬和凋亡。     

虾青素对幽门螺杆菌感染AGS细胞自噬及凋亡的抑制作用

目的探讨虾青素对幽门螺杆菌(Hp)感染AGS细胞自噬和凋亡的影响。方法选取胃上皮细胞株AGS细胞进行Hp感染,根据虾青素的浓度分为对照组[二甲基亚砜(DMSO)处理]、10μmol/L组、20μmol/L组、50μmol/L组。分组处理96 h后,采用免疫荧光标记检测细胞Hp外膜蛋白(OMP)表达,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测相关基因微管相关蛋白1轻链3-Ⅱ(LC3-Ⅱ)、LC3-Ⅰ、Beclin1、B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax) mRNA表达,Western blot法检测细胞自噬和凋亡相关蛋白的表达,TUNEL法检测细胞凋亡情况。结果 Hp在AGS细胞质中弥散分布,Hp感染AGS细胞成功。虾青素可抑制Hp的增殖,10、20、50μmol/L组细胞凋亡率均低于对照组,差异有统计学意义(P 0.05)。Beclin1、LC3-Ⅱ与LC3-Ⅰ比值(LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ)、Bax蛋白及mRNA的表达随着虾青素浓度的增高而逐渐降低,Bcl-2蛋白及mRNA表达随着虾青素浓度的增高而逐渐升高,与对照组相比,差异有统计学意义(P 0.01)。虾青素10、20、50μmol/L组白细胞介素-17(IL-17)含量均低于对照组,差异有统计学意义(P 0.05),且随着虾青素浓度的增高,IL-17含量逐渐下降。结论随着虾青素浓度的增高,Hp感染的AGS细胞的自噬及凋亡能力减弱。     

β-榄香烯注射液联合甲磺酸阿帕替尼 对乳腺癌细胞生长抑制作用的研究

目的探究β-榄香烯注射液(ELE)联合甲磺酸阿帕替尼(APA)对乳腺癌细胞生长的抑制作用。方法正常培养乳腺癌细胞MB-468作空白对照组,用0. 05 mg/ml ELE单独或联合1μmol/L APA处理MB-468细胞,分别作ELE组、APA组和ELE+APA组。采用MTT法检测各组细胞生长情况,流式细胞仪检测细胞凋亡情况,Western blot检测Ki67、PCNA、Caspase-3、Bax、Bcl-2、Beclin1、p62、LC3的表达;用自噬抑制剂3-MA处理MB-468细胞,并进行ELE单独或联合APA干预,细胞分组为:对照组,3-MA组,ELE+APA组和3-MA+ELE+APA组,采用Western blot检测LC3的表达。结果与对照组相比,ELE组、APA组和ELE+APA组细胞增殖活性、Ki67、PCNA、p62的表达显著下调,凋亡率、Caspase-3、Bax/Bcl-2、Beclin1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的表达显著上调;加入自噬抑制剂3-MA后,3-MA+ELE+APA组Beclin1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的表达显著下调,p62的表达显著上调。结论 ELE联合APA对乳腺癌细胞MB-468生长有明显的抑制作用,可能与降低MB-468细胞增殖活性、促进其凋亡和自噬有关。     

miR-21对人髓母细胞瘤DAOY细胞增殖和凋亡的影响

目的探讨miR-21对人髓母细胞瘤DAOY细胞增殖和凋亡的影响。方法人髓母细胞瘤DAOY细胞分为实验组、对照组和空白组。空白组不进行转染,加入等量DMEM培养基;对照组加入无义序列/脂质体复合物;实验组加入miR-21 inhibitor脂质体复合物。3组细胞采用实时荧光定量PCR法检测miR-21和PRDX3 mRNA表达水平,采用Western blot法检测miR-21和PRDX3蛋白相对表达量,采用CCK-8法检测细胞增殖率,采用AnnexinV-FITC法检测细胞凋亡率,应用流式细胞仪检测细胞内活性氧水平。结果转染24、48 h后,实验组细胞miR-21、PRDX3 mRNA和蛋白表达水平明显低于对照组和空白组(P0.05),对照组与空白组比较差异无统计学意义(P0.05);转染24、48 h后,实验组细胞增殖率[(4.20±0.29)%、(8.20±4.39)%]明显低于空白组[(48.19±0.42)%、(80.09±0.55)%]和对照组[(45.22±1.02)%、(78.28±1.04)%](P0.05),细胞凋亡率[(7.17±0.21)%、(11.40±0.26)%]、细胞平均荧光强度(189.33±45.39、192.40±50.88)明显高于空白组[((3.20±0.26)%、(3.07±0.31)%,168.09±39.42、160.87±41.44)]和对照组[(3.47±0.32)%、(4.20±0.44)%,172.49±44.92、165.20±40.61](P0.05),空白组细胞增殖率、细胞凋亡率及细胞平均荧光强度与对照组比较差异均无统计学意义(P0.05)。结论抑制miR-21的表达可降低人髓母细胞瘤PRDX3的表达水平,促使细胞内活性氧水平增加,从而抑制细胞增殖与促进细胞凋亡。     

亚低温对氧糖剥夺神经元细胞自噬的影响

目的:观察亚低温治疗对氧糖剥夺神经细胞凋亡和自噬的影响。方法:提取SPF级SD大鼠新生鼠(1d内)大脑皮层神经元细胞,建立氧糖剥夺/复糖复氧(OGD/R)模型。OGD 3 h后从细胞培养盒中取出细胞培养板,分别置于37℃或34℃恒温培养箱中复氧6 h、12 h。western-blot检测凋亡蛋白P53蛋白和自噬相关蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin1、Atg5和Rab7的表达。Tunel法检测神经元细胞凋亡。结果:新生鼠原代神经元分离、培养、接种4h后贴壁良好。常温组,原代神经元OGD3h,复氧后6h和12h,western-blot Rab7表达逐渐减少;Beclin1表达减少;LC3Ⅱ/Ⅰ比值减少;Atg5表达也有所减少;而P53蛋白表达明显增加,P均0.05。相对于常温组,OGD3h,复氧后12 h,亚低温组Rab7,Beclin1,Atg5蛋白表达均高于常温组,P0.05;而P53蛋白表达低于常温组,P0.05。Control组、R6h常温组、R6h低温组神经元凋亡率分别为10.2%±3.6%、56.8%±7.6%、20%±6.7%,P0.05。结论 :原代神经元细胞氧糖剥夺/复氧后,神经元自噬明显减少,凋亡增加;亚低温治疗可促进自噬,减少凋亡。     

黄芪甲苷减少脓毒症大鼠胰腺腺泡细胞自噬的实验研究

目的探讨黄芪甲苷对脓毒症大鼠胰腺Beclin1、p62和LC3自噬相关基因和蛋白以及胰腺自噬情况的影响。方法清洁级雄性Wistar大鼠50只,采用随机数字表法分为5组(每组10只):空白对照组(Blank,未加任何干预,直接处死)、生理盐水尾静脉注射组(NS组)、黄芪甲苷低剂量(1 mg/kg)组、黄芪甲苷中剂量(2.5 mg/kg)组、黄芪甲苷高剂量(5 mg/kg)组。采用盲肠结扎穿孔法制造脓毒症模型。利用RT-PCR技术检测各组小鼠胰腺中Beclin1、p62和LC3的mRNA检测水平,Western blotting技术检测各组小鼠胰腺中Beclin1、p62和LC3的蛋白表达水平。采用透射电子显微镜观察胰腺超微结构及腺泡细胞内自噬小体的形成情况。结果与空白对照组相比,NS组大鼠胰腺中的Beclin1、p62和LC3自噬相关基因及蛋白表达明显升高,黄芪甲苷干预后使其表达明显降低,差异均具有统计学意义(P0.05)。电镜显示脓毒症造模24 h,NS组较Blank组胰腺自噬小体明显增多,而黄芪甲苷给药组胰腺自噬小体的形成较NS组明显减少。结论黄芪甲苷能够减少脓毒症大鼠胰腺中Beclin1、p62和LC3基因及蛋白的表达,减少胰腺局部自噬小体的形成。     

MeCP2、TH蛋白在正常SH-SY5Y细胞和帕金森病细胞模型中的表达及其意义研究

目的探讨MeCP2、TH蛋白在正常SH-SY5Y细胞和帕金森病细胞模型中的表达及其意义。方法实验分为3组:空白对照组,未转染;模型对照组;pEGFP-N1-MeCP2组,转染液加入重组pEGFP-N1-MeCP2质粒。除空白对照组外,其余二组均加入6-羟多巴胺(6-OHDA)50.0μmol/L处理24h。用CCK-8法、流式细胞仪检测正常SH-SY5Y细胞、上调MeCP2表达的SH-SY5Y细胞在6-OHDA诱导下细胞活性及细胞凋亡的变化;免疫荧光技术和Western blot法检测各组SH-SY5Y细胞中MeCP2蛋白、TH蛋白表达的变化。结果 CCK-8法检测及流式细胞仪6-OHDA诱导的SH-SY5Y细胞、上调MeCP2的SH-SY5Y细胞中细胞存活和凋亡情况发现,模型对照组与pEGFP-N1-MeCP2组、空白对照组相比,差异具有统计学意义(P0.05)。双重免疫荧光检测6-OHDA诱导的SH-SY5Y细胞中的MeCP2、TH表达情况发现,模型对照组,6-OHDA(50.0μmol/L)诱导24h,MeCP2和TH的蛋白表达显著下降(P0.05)。Western blot检测上调MeCP2表达后,6-OHDA诱导的SH-SY5Y细胞中的MeCP2、TH表达情况发现,pEGFP-N1-MeCP2组上调组和空白对照组中MeCP2、TH蛋白表达与模型对照组相比,差异具有统计学意义(P0.01)。结论转染pEGFP-N1-MeCP2重组质粒可抑制6-OHDA诱导的SH-SY5Y细胞凋亡,提高TH的表达,提高细胞存活率。     

miR-373对人胃癌SGC7901细胞生物学行为的影响

目的探讨miR-373在人胃癌SGC7901细胞中表达情况及其对胃癌细胞增殖、迁移的影响。方法人胃癌SGC7901细胞和正常胃黏膜上皮GES-1细胞采用反转录PCR法检测miR-373相对表达量。人胃癌SGC7901细胞分为miR-373类似物组、miR-373抑制物组和空白对照组,分别转染miR-373 mimic、miR-373 inhibitor和miR-373 NC。转染后24、36、48、72 h,采用MTT法检测3组细胞增殖率,转染后48 h,采用Transwell小室迁移实验检测迁移细胞数。结果胃癌SGC7901细胞miR-373相对表达量(0.39±0.05)明显高于正常胃黏膜上皮GES-1细胞(0.23±0.04)(P0.05);miR-373类似物组细胞miR-373相对表达量(0.78±0.11)明显高于miR-373抑制物组(0.17±0.02)和空白对照组(0.36±0.06)(P0.05),空白对照组高于miR-373抑制物组(P0.05);转染后24 h,3组细胞增殖率比较差异无统计学意义(P0.05),转染后36、48、72 h,miR-373类似物组细胞增殖率明显高于miR-373抑制物组和空白对照组(P0.05),空白对照组高于miR-373抑制物组(P0.05);转染后48 h,相同面积下miR-373类似物组迁移细胞数[(181.28±11.29)个]明显多于miR-373抑制物组[(61.82±8.29)个]和空白对照组[(109.73±8.22)个](P0.05),空白对照组多于miR-373抑制物组(P0.05)。结论 miR-373可能作为癌基因作用于胃癌组织,且能增强胃癌细胞的增殖和迁移能力。     

miR-326靶向MAPK/MEK信号通路抑制食管鳞状细胞癌恶性生物学行为

目的探讨miR-326靶向MAPK/MEK信号通路对食管鳞状细胞癌细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响。方法 20例食管鳞状细胞癌患者,取手术切除食管癌组织和癌旁正常组织,采用实时荧光定量PCR法检测miR-326mRNA和MAPK mRNA相对表达量,采用免疫组织化学法检测MAPK蛋白表达。3种食管癌细胞系(KYSE150、EC9706、TE-9)和人正常食管上皮细胞系Het-1A,采用实时荧光定量PCR法检测细胞miR-326 mRNA和MAPK mRNA相对表达量,Western blot法检测细胞MAPK蛋白相对表达量。将对数生长期EC9706细胞随机分为miR-326组、转染对照组和空白对照组,miR-326组和转染对照组分别转染miR-326 mimic和mimic NC,空白对照组细胞不作任何处理,采用Western blot法检测细胞MAPK、p-MEK、p-ERK1、p-ERK2和p-C-Jun蛋白相对表达量,克隆形成试验检测细胞克隆形成率,划痕试验检测细胞划痕闭合率,Transwell小室试验检测细胞侵袭,流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡,荧光素酶活性检测试剂盒检测细胞荧光素酶活性。结果食管癌组织miR-326 mRNA相对表达量低于癌旁正常组织(P0.05),MAPK mRNA相对表达量高于癌旁正常组织(P0.05)。KYSE150、EC9706和TE-9细胞miR-326 mRNA相对表达量均低于Het-1A细胞(P0.05),MAPK mRNA和MAPK蛋白相对表达量高于Het-1A细胞(P0.05),且EC9706细胞MAPK蛋白相对表达量最高。miR-326组细胞MAPK 3'UTR WT荧光素酶活性(0.53±0.05)明显低于转染对照组(1.22±0.14)(P0.05),MAPK 3'UTR MUT荧光素酶活性(0.86±0.06)与转染对照组(0.91±0.11)比较差异无统计学意义(P0.05)。miR-326组细胞MAPK蛋白相对表达量(0.32±0.15)低于转染对照组(0.88±0.07)和空白对照组(0.91±0.06)(P0.05),细胞克隆形成率[(21.30±0.55)%]、划痕闭合率[(29.47±4.12)%]和侵袭细胞数[(113.86±3.15)个]低于转染对照组[(75.43±0.81)%、(80.52±2.51)%、(427.27±4.25)个]和空白对照组[(79.13±0.65)%、(83.44±1.87)%、(468.10±3.38)个](P0.05),G_0/G_1期细胞比率[(63.15±1.20)%]和细胞凋亡率[(18.54±0.60)%]高于转染对照组[(41.18±0.60)%、(5.28±1.30)%]和空白对照组[(45.11±0.80)%、(4.13±0.90)%],S期和G_2/M期细胞比率及p-MEK、p-ERK1、p-ERK2和p-C-Jun蛋白相对表达量低于转染对照组和空白对照组(P0.05),转染对照组与空白对照组比较差异均无统计学意义(P0.05)。结论 miR-326靶向抑制MAPK/MEK信号通路的激活,影响食管鳞状细胞癌细胞的增殖、迁移、侵袭和凋亡。     

上调及下调MicroRNA-195对人脑胶质瘤影响的初步研究

目的观察上调及下调microRNA-195(miR-195)对裸鼠皮下荷SHG-44人脑胶质瘤生长的影响并探讨其机制。方法使用脂质体瞬时转染法将miR-195 mimics和inhibitor分别转入人脑胶质瘤细胞系SHG-44,同时设立空白对照组和阴性对照组;实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测转染前后miR-195的含量变化;流式细胞法检测各组细胞周期分布;裸鼠成瘤实验观察miR-195对体内胶质瘤增殖的影响;肿瘤组织HE染色观察病理学改变;Western blot、免疫组织化学染色检测肿瘤组织周期相关蛋白P21、Cyclin D1的表达变化。结果 qRT-PCR测得转染mimics后miR-195的表达水平提高19倍左右,而转染inhibitor后miR-195的表达水平降低为空白对照组的42%;与空白对照和阴性对照组相比,miR-195mimics组细胞阻滞于G0/G1期(P<0.05);而miR-195 inhibitor组则相反(P<0.05);裸鼠成瘤实验显示,miR-195 mimics组与空白对照组和阴性对照组相比,肿瘤生长速度减慢,体积减小(P<0.05),而miR-195 inhibitor组则结果相反(P<0.05);HE染色结果显示miR-195mimics组肿瘤组织异型性下降,新生血管数减少,而miR-195 inhibitor组则相反;Western blot检测示与空白对照组和阴性对照组比较,miR-195 mimics组P21表达上调,而Cyclin D1表达下调,miR-195inhibitor组结果相反(P均<0.05);免疫组化染色检测显示,与空白对照组和阴性对照组比较,miR-195mimics组中P21表达阳性率较高,而Cyclin D1的表达阳性率较低(P均<0.05),miR-195 inhibitor组情况则相反(P均<0.05)。结论 MiR-195可使P21表达升高,下调Cyclin D1的表达,阻滞G0/G1期向S期转换,从而抑制人脑胶质瘤细胞SHG-44的增殖能力。     

miRNA-132、miRNA-125b、miRNA-143和miRNA-145表达对多发性骨髓瘤细胞自噬及凋亡的影响

目的:探讨多发性骨髓瘤细胞miRNA-132、miRNA-125b、miRNA-143和miRNA-145表达与自噬和凋亡的关系。方法:选取人骨髓瘤细胞株U266及正常CD138+浆细胞为研究对象,临床研究对象分为骨髓瘤组45例,健康对照组40例。实时定量PCR测定细胞中miRNA-132、miRNA-125b、miRNA-143和miRNA-145表达水平,Western blot测定自噬相关蛋白(LC3-Ⅱ,LC3-Ⅰ、P62、Beclin-1)表达量,凋亡相关分子(cleaved-Caspase3、cleaved-Caspase7、BCL-2、BAX)表达量;流式细胞术测定细胞凋亡率。分析miRNA表达水平与临床相关指标包括M蛋白、血红蛋白、β2-MG、乳酸脱氢酶、白蛋白、肌酐、血清钙的相关性。结果:与正常浆细胞对比,骨髓瘤细胞的miRNA-132和miRNA-125b表达显著增加(P 0.05),miRNA-143,miRNA-145表达显著降低(P 0.05);LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ显著增加(P 0.05),Beclin-1表达显著增加(P 0.05),P62表达显著降低(P 0.05);BAX、cleaved-Caspase3、cleaved-Caspase7表达显著降低(P 0.05),BCL-2表达显著增加(P0.05);细胞凋亡率降低(P 0.05)。阳离子脂质体转染miRNA-125b mimic和miRNA-143 inhibitor后,正常浆细胞LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ显著增高(P 0.05),Beclin-1表达显著增高(P 0.05),P62表达也显著增加(P 0.05),细胞凋亡率降低(P 0.05);上述反应体系加入自噬抑制剂3-MA后,细胞凋亡率则无明显改变(P 0.05)。miRNA-132、miRNA-125b、miRNA-143和miRNA-145表达在不同DS与ISS分期组,染色体核型异常组与正常核型组间均有显著性差异(P 0.05)。miRNA-125b和miRNA-143与β2-MG、白蛋白、血红蛋白水平均有显著相关性(P 0.05)。结论:miRNA-132、 miRNA-125b、 miRNA-143和miRNA-145表达与多发性骨髓瘤患者临床特征密切相关,miRNA-125b过表达和miRNA-143表达下调通过上调自噬水平抑制骨髓瘤细胞凋亡。     

eIF4E对多发性骨髓瘤CD138~+细胞自噬的影响

目的:探讨真核细胞翻译起始因子4E(eIF4E)对多发性骨髓瘤CD138~+浆细胞自噬的影响。方法:eIF4E抑制剂4EGI处理多发性骨髓瘤CD138~+浆细胞,采用荧光定量PCR和Western blot法检测细胞自噬相关因子LC3-Ⅱ和Beclin1的变化,MTT法检测细胞增殖抑制的变化,流式细胞术检测细胞凋亡。结果:荧光定量PCR检测显示,4EGI处理骨髓瘤细胞后,LC3-Ⅱ、Beclin1 mRNA的表达水平具有时间及浓度依赖性,随着4EGI浓度增加和作用时间延长,LC3-Ⅱ、Beclin1 mRNA的表达水平逐渐增加,差异均有统计学意义(48 h:LC3-Ⅱ,r=0. 942,Beclin1,r=0. 952; 80μg/ml:LC3-Ⅱ,r=0. 966,Beclin1,r=0. 998)。Western blot检测显示,随着4EGI浓度增加,LC3-Ⅱ、Beclin1蛋白表达逐渐增加(LC3-Ⅱ,r=0. 923; Beclin1,r=0. 977)。CCK-8检测显示,细胞抑制率逐渐增加(r=0. 996); 4EGI处理各组(20、40、80μg/ml组)细胞凋亡率(23. 23±4. 47、7. 59±1. 67、2. 03±0. 19)均明显高于对照组(0. 03±0. 04)(P 0. 05)。结论:抑制eIF4E对多发性骨髓瘤CD138~+浆细胞的自噬有激活作用,并引起骨髓瘤细胞自噬性死亡。     

miR-375在子宫内膜癌HEC-1-B细胞中的生物学功能

目的:探讨miR-375在Ⅱ型子宫内膜癌中的表达及对HEC-1-B细胞增殖、凋亡的影响.方法:miRNA芯片分析Ⅱ型子宫内膜癌miRNA表达谱.利用lipofectamine2000转染HEC-1-B细胞.实时荧光定量PCR检测转染后miR-375的表达.CCK-8检测转染后细胞增殖能力的改变.流式细胞仪检测细胞转染效率及转染后细胞凋亡情况.结果:miR-375在Ⅱ型子宫内膜癌组织中低表达.转染效率达73.43％.转染后实验组miR-375表达量较NC组和对照组明显增加(P＜0.05).实验组较NC组生长明显受抑(P＜0.05).实验组较NC组、对照组凋亡明显增加(P＜0.05).结论:初步证明miR-375抑制Ⅱ型子宫内膜癌细胞增殖并促进凋亡,可能成为Ⅱ型子宫内膜癌基因治疗的靶点.     

siRNA沉默Drp1对鱼藤酮诱导的帕金森病模型细胞自噬和凋亡的影响

目的探究siRNA沉默动力相关蛋白1(Drp1)后对鱼藤酮诱导的帕金森病模型细胞自噬以及细胞凋亡的影响。方法体外培养人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y,用1μm、5μm、10μm、20μm鱼藤酮进行处理24 h、48 h,MTT法检测细胞抑制情况。将细胞分为鱼藤酮最佳浓度处理组(20μm鱼藤酮处理,损伤组)、阴性转染组(损伤组基础上转染Drp1阴性序列)、Drp1siRNA处理组(损伤组基础上转染Drp1 siRNA)、Drp1抑制剂组(损伤组基础上添加Mdivi-1试剂)、自噬促进剂组(损伤组基础上添加雷帕霉素)。观察各组线粒体自噬情况、细胞线粒体功能相关蛋白(Mfn2、Drp1、NRF1)、自噬相关蛋白(Beclin-1、LC3、P62)、凋亡蛋白(Bcl-2、Bax)表达情况和细胞凋亡情况。结果与对照组相比,鱼藤酮处理组细胞抑制率均升高,随着浓度以及培养时间的增加,细胞抑制率逐渐增加(P0.05)。损伤组、阴性转染组、自噬促进剂组LC3II定位在细胞线粒体,且细胞线粒体结构受损,外周出现自噬双层膜。与Drp1 siRNA转染组、Drp1抑制剂组相比,损伤组、阴性转染组、自噬促进剂组Drp1、LC3II、Beclin-1、Bax蛋白表达和细胞凋亡率升高,Mfn2、NRF1、P62、Bcl-2蛋白表达降低(P0.05)。结论 Drp1参与鱼藤酮诱导帕金森病细胞线粒体自噬,沉默Drp1后可降低鱼藤酮诱导帕金森病细胞线粒体自噬以及细胞凋亡,具有保护作用。