大鼠树突状细胞的体外分离、纯化、扩增及鉴定

目的 探讨诱导及纯化大鼠树突状细胞（Dendritic cells,DC）的方法，为进一步研究树突状细胞的功能、特性及临床应用提供技术方法。方法 应用重组大鼠rGM-CSF、IL－4在体外培养大鼠骨髓前体细胞获得大量DCs，经标抗大鼠OX62单抗免疫磁株分离纯化后的DCs经形态学观察、表型检测、功能学实验鉴定。结果 大鼠骨髓来源的DC在体外培养12－14d后完全成熟，99．36％培养纯化后DC表达大鼠特异性表面标志OX62；典型的成熟大鼠DC形态上类似于小鼠和人类的DC，表型为MHCⅡ＋＋，OX62＋＋，FcγR（CD32）＋／－，CD80＋／－，CD86＋＋，体外功能分析显示该DC能够强烈刺激MLR并有效递呈可溶性抗原OVA刺激初始型T细胞的增殖。结论 成功地建立了体外大量扩增大鼠骨髓DC的方法，为研究其在异种移植及诱导免疫耐受的作用打下基础。     

大鼠肝脏非实质细胞分离及鉴定

目的 肝脏非实质细胞(NPLC),包括胆管上皮细胞(BEC)、肝星状细胞(HSC)、肝窦内皮细胞(LSEC)以及枯否细胞(KC)在肝胆道疾病发病中起着重要作用,成功分离高纯度、高活性的该类细胞将有助于研究该类细胞特征及其在肝胆道疾病发病中的作用.方法 ①采用梯度离心技术及荧光激活细胞分离技术(FACS),分别自正常大鼠及胆总管结扎大鼠中分离四种肝脏非实质细胞.②采用免疫荧光染色、流式细胞技术及荧光显微镜下观察以鉴定分离所得细胞的纯度.③以台盼蓝染色分别检测分离所得细胞的存活率.结果 ①从大鼠肝脏分离出的四种主要的NPLC,BEC、HSC、KC及LSEC,其纯度分别为:(94.0±9.2)%、(90±8.5)%、(93.5±7.2)%及(95.7±6.7)%.②自正常大鼠肝脏中分离的NPLC、BEC、HSC、KC及LSEC数量均显著多于自正常大鼠肝脏中分离所得的细胞数(P<0.01).③从大鼠肝脏分离出的四种主要的NPLC、BEC、HSC、KC及LSEC,其存活率均在93%以上.结论 ①本研究采用方便可行的方法,成功分离出高纯度、高活性的肝脏非实质细胞.②胆总管结扎术后大鼠肝脏中各种非实质细胞数均较正常大鼠肝脏显著增多.     

大鼠骨髓来源树突状细胞的体外培养与鉴定

目的建立体外培养、诱导和扩增大鼠骨髓来源的树突状细胞的方法。方法实验通过运用大鼠淋巴细胞分离液和培养过程的手法筛选相结合,培养、诱导和扩增大鼠骨髓来源的树突状细胞,通过形态学和免疫表型进行鉴定。结果成功建立了体外大量培养、诱导及扩增大鼠骨髓来源树突状细胞的方法;经倒置相差显微镜、透射电镜及流式细胞仪鉴定,证实所培养细胞为树突状细胞。结论通过运用大鼠淋巴细胞分离液和培养过程的手法筛选相结合能培养、诱导、扩增大量的树突状细胞。     

未成熟树突状细胞与肝脏移植免疫耐受

肝脏移植免疫耐受具有其独特性,诱导免疫耐受是延长肝移植患者的生存期以及提高生存质量的重要手段。目前,人们通过多种方法诱导肝移植免疫耐受,其中未成熟树突状细胞诱导免疫耐受被普遍认为是一种有效的方法。但供体来源的未成熟树突状细胞在受者体内受刺激因子作用,不可避免的会发育成熟,同时会被宿主体内的同种异体反应被清除,使已经产生的免疫耐受作用消失,而使用受体来源的未成熟树突状细胞则可避免以上不利因素。     

大鼠肝星状细胞的分离培养及鉴定

目的　研究肝损伤后细胞基质的沉积及纤维化形成机制 ,建立一套经济、简便、可靠的分离大鼠肝星状细胞的方法。方法　采用胶原酶、链霉蛋白酶循环灌流法分离大鼠的肝星状细胞 ,18%Nycodenz密度梯度离心纯化肝星状细胞 ,采用免疫组织化学方法鉴定Desmin阳性细胞的纯度。结果　每只鼠肝约获取 3 .6× 10 7个星状细胞 ,活率、纯度平均为 95 .4%、95 %。结论　本方法建立了有效的大鼠肝星状细胞的分离和培养方法。     

大鼠脾脏来源树突状细胞的分离培养及生物学特性

目的建立从大鼠脾脏中分离单个核细胞并诱导及纯化树突状细胞(DC)的方法,并分析其生物学特性。方法采用胶原酶消化并裂解红细胞获得脾细胞悬液,密度梯度离心获得单个核细胞,单次贴壁法去除淋巴细胞。在含有粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、白介素-4的培养基中培养诱导DC,获得贴壁细胞群和悬浮细胞群。应用流式细胞仪测定OX62、CD80、CD86和MHC-Ⅱ的表达。结果大鼠脾脏来源DC在体外培养7~8 d后OX62表达率达到高峰。在贴壁细胞中出现OX62的高表达,而CD80、CD86和MHC-II的表达与悬浮细胞无统计学差异(P>0.05)。结论脾脏来源的单个核细胞经过7~8 d的培养,在贴壁细胞群中可收获大量DC,且贴壁DC更为幼稚。     

大鼠髓系来源的树突状细胞的体外诱导及功能鉴定

目的探讨建立合适的大鼠骨髓源性未成熟树突状细胞(imDC)的培养方法,并对其生物学特性进行评价。方法分别以不同剂量的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白介素(IL)-4诱导分化获得大鼠骨髓源性树突状细胞(DC),比较收获率及特异性标记蛋白(OX62)阳性的DC数量,获得最佳细胞因子浓度。并用流式细胞仪分析DC表型,混合淋巴细胞反应(MLR)检测其刺激同种T细胞增殖能力,ELISA法测定MLR上清IL-12、γ-免疫反应性纤维结合素(IFN-γ)水平。结果 GM-CSF 5 ng/ml可诱导出更高的收获率及OX62的阳性率。GM-CSF 5 ng/ml培养7 d的DC,表达中等水平的主要组织相容性(抗原)复合物Ⅱ类(MHC II)和低水平的CD86;其分泌少量IL-12;刺激同种T细胞增殖能力极低。脂多糖(LPS)刺激后MHCⅡ、CD86表达明显增加;分泌IL-12和IFN-γ增加;刺激同种T细胞增殖能力增强。结论 GM-CSF 5 ng/ml为诱导大鼠骨髓源性imDC的最佳剂量,培养7～9 d可以获得足够数量和纯度的imDC。     

大鼠脾脏来源树突状细胞的分离培养及生物学特性

目的 建立从大鼠脾脏中分离单个核细胞并诱导及纯化树突状细胞(DC)的方法,并分析其生物学特性. 方法 采用胶原酶消化并裂解红细胞获得脾细胞悬液,密度梯度离心获得单个核细胞,单次贴壁法去除淋巴细胞.在含有粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、白介素-4的培养基中培养诱导DC,获得贴壁细胞群和悬浮细胞群.应用流式细胞仪测定OX62、CD80、CD86和MHC-Ⅱ的表达. 结果 大鼠脾脏来源DC在体外培养7～8 d后OX62表达率达到高峰.在贴壁细胞中出现OX62的高表达,而CD80、CD86和MHC-Ⅱ的表达与悬浮细胞无统计学差异(P＞0.05). 结论 脾脏来源的单个核细胞经过7～8 d的培养,在贴壁细胞群中可收获大量DC,且贴壁DC更为幼稚.     

大鼠骨髓来源树突状细胞的分离、培养及鉴定

目的 探讨大鼠树突状细胞(dendritic cells, DC)分享、培养、鉴定的方法.方法 重组大鼠rGM-CSF、 rIL-4在体外培养大鼠骨髓前体细胞获得大量DCs, DCs经形态学观察、表型检测、功能学鉴定.结果 大鼠骨髓来源的DC在体外9d后完全成熟,90%以上培养纯化后DC表达大鼠特异性表面标志OX62,高表达MHCII、 CD80、 CD86成熟的DC具有明显刺激同种异体T细胞增殖的能力.结论 成功地建立了体外大鼠骨髓DC扩增的方法.     

Wistar大鼠树突状细胞的体外培养、扩增与鉴定

目的：探讨体外分离、培养和扩增大鼠骨髓来源树突状细胞（DC）的有效方法。方法：采用改良的Chen－WoanDC培养方法，梯度离心提取骨髓单核细胞中的非粘附细胞，加入GM CSF 5?ng/ml、IL 4 5?ng/ml进行诱导扩增，对培养的目的细胞进行形态学、OX62－FITC免疫荧光检查以及功能学鉴定。结果：DC前体细胞培养10?d呈典型树突状结构，表面标志物染色阳性，流式细胞学检查OX62单抗阳性率86％，不同培养时段的DC诱发混合淋巴细胞反应以培养10?d的DC最强，培养10?d的DC诱发混合淋巴细胞反应对同源淋巴细胞有更好的活性。结论：改良的Chen－Woan法为体外诱导扩增大鼠骨髓来源DC的有效方法。     

树突状细胞与肝癌的免疫治疗

树突状细胞(DC)是体内最强的抗原递呈细胞(APC),具有激活T细胞和诱导免疫反应的特殊功能。大量研究显示,DC在抗肿瘤的免疫反应、肿瘤监视等过程中均起到重要作用。DC免疫治疗应用于临床的问题已经引起广泛关注,并取得一定的进展。本文就DC的生物学特征、抗肝癌免疫治疗研究现状等方面作一综述。     

大鼠OX-62+树突状细胞的体外诱导及生物学特性

目的 :从大鼠骨髓中有效地诱导、培养OX 6 2 + 树突状细胞 (dendriticcells,DC) ,观察其表型及功能特征。方法 :大鼠骨髓细胞培养 3h ,贴壁细胞加入含重组大鼠GM CSF和IL 4 ,继续培养 6～ 12d ,淘洗法去非粘附细胞中的Fc受体阳性细胞 ,流式细胞仪分析细胞表型及抗原摄取能力 ,混合淋巴细胞反应检测其刺激同种T细胞增殖能力 ,ELISA测定分泌IL 12水平。结果 :培养DC90 %以上表达OX 6 2。培养 6d的OX 6 2 + DCs具有不成熟表型 ,表达中等水平的MHCII抗原和低水平的CD80、CD86、ICAM 1;分泌少量IL 12 ;具有较强的摄取抗原能力 ,但刺激同种T细胞增殖能力极低。培养 12d的OX 6 2 + DC已经成熟 ,MHCII、CD8、CD86、ICAM 1表达明显增加 ;分泌IL 12增加 ;摄取抗原能力下降 ;刺激同种T细胞增殖能力明显增强。结论 :成功建立了体外大量扩增大鼠骨髓OX 6 2 + DC的新方法。     

大鼠肝星状细胞简便分离法及鉴定

目的：介绍一种简便、经济、稳定的大鼠肝星状细胞（hepatic stellate cell,HSC）分离方法,为肝纤维化的研究提供细胞模型。方法：取符合标准的雄性SD大鼠,体重约400-450g,行肝脏门静脉插管,灌洗肝脏后,先后采用链酶蛋白酶、Ⅳ型胶原酶、DNA酶I灌注,消化肝脏制成细胞悬液,20％Nycodenz密度梯度离心分离得到原代HSC。Desmin及α—SMA抗体免疫组化鉴定纯度。结果：HSC得率2×10^7／每肝,细胞存活率及纯度达95％以上。结论：该法简便、经济,细胞得率和纯度稳定,是一种实用的大鼠HSC分离方法。     

人外周血树突细胞的分离与提纯

目的 从人外周血中分离、培养及鉴定树突细胞（ＤＣ）。方法 从正常人外周血分离获得单个核细胞,培养２小时后,取会细胞,在无血清培养基中加入不同的细胞在子,于２的第１,６,８天对形态,表型和功能分擀行测定,并在光镜、电镜下观察ＤＣ的纯度与得率。结果 体外培养６～８天可获得高纯度大量的ＤＣ,较高表达ＨＬＡ ＤＲ、ＣＤ４０、ＣＤ８３和ＣＤ８６,能强烈激发同种慢体Ｔ淋巴细胞增殖。结论 上述方法可以从人外周血     

外周血来源树突状细胞的体外诱导及鉴定

目的 建立人外周血树突状细胞(dendritic cell,DC)的分离方法,观察其形态学和免疫组织化学的特点,为下一步研究提供DC来源.方法 用重组人GM-CSF、IL-4从人外周血单个核细胞诱导分离DC,流式细胞仪检测所得细胞的纯度,光镜、电镜观察其形态,SP免疫细胞化学方法检测DC的分子表达.结果 此纯化方法所得细胞纯度可达到80%以上,形态学观察可见纯化细胞具有典型的DC特征,该细胞高表达HLA-DR和S-100分子.结论 此种方法可获得较高纯度典型的DC,为进一步研究及临床应用提供了可能.     

肝移植受体术后外周血来源树突状细胞乙肝表面抗原提呈功能检测

目的 了解处于乙肝病毒临床清除状态的肝移植受体术后外周血来源树突状细胞提呈乙肝病毒表面抗原的能力及其影响因素.方法 选取18例术后肝移植受体为病例组,6例健康成人为对照组,以细胞因子诱导法从外周血获得树突状细胞,经乙肝病毒表面抗原处理后进行混合淋巴细胞培养,检测并比较两组树突状细胞刺激淋巴细胞增殖的能力,并进行多因素分析.结果 肝移植受体术后外周血来源的树突状细胞刺激淋巴细胞增殖的能力弱于健康对照组(cpm值4310.8±1820.3 vs 19002.5±3357.8,P＜0.001),提呈乙肝病毒表面抗原的能力弱于健康对照组(cpm值4974.9±2414.7 vs 39258.4±5554.9,P＜0.001).结论 肝移植受体术后外周血来源树突状细胞提呈乙肝表面抗原的能力低下,此种功能缺陷可能是导致受体针对乙肝病毒的主动免疫反应性低的重要原因,并且其提呈作用受术前乙肝病毒复制状态、术后时间、术后预防方案及术后外周血单个核细胞乙肝病毒含量影响.     

大鼠肾组织干细胞的分离培养与鉴定

目的 分离培养及稳定扩增大鼠肾组织干细胞（kidney stem cell,KSC）,并鉴定其生物学特征及干细胞特性。方法 从4周龄雄性SD大鼠双肾肾乳头处分离培养KSC,倒置显微镜下观察细胞形态特征,通过流式细胞、免疫荧光技术鉴定KSC的表型特征,通过成骨、成脂诱导分化鉴定其分化能力,并通过实时定量荧光PCR（quantitative real time polymerase chain reaction, qRT-PCR）比较KSC与大鼠肾小管上皮细胞（renal tubular epithelial cell, RTEC）基因表达的差异。结果 KSC呈纺锤形或树枝状生长;免疫荧光结果显示KSC可表达平滑肌肌动蛋白（alpha-sooth muscle actin,α-SMA）、波形蛋白（Vimentin）、神经钙粘蛋白（N-Cadherin）、神经巢蛋白（Nestin）、CD133,不表达钙粘蛋白-E（E-Cadherin）、细胞角蛋白(cytokeratin-18,CK-18)、紧密连接蛋白（zona occludens protein-1,ZO-1）;细胞流式结果显示,CD29、CD90、CD73表达比率分别为99.0%、95.8%和99.9%,CD45阳性率为3.4%;干细胞标记CD133和Nestin阳性率分别为33.2%和70.2%,双阳性率为31.4%;成脂诱导后油红O染色呈红色,成骨诱导后早期成骨细胞分化标志茜素红染色呈橙红色;qRT-PCR结果显示,与RTEC相比,原始胚胎干细胞标记物Nanog、Oct4/pou5f1、Sox2/sry-box-2的mRNA表达量在KSC中增高（ P<0.01）,间质标记物α-SMA、Vimentin mRNA表达量在KSC中增高（ P<0.01）,而成熟的上皮细胞标记物E-Cadherin、CK18mRNA表达量在KSG中降低（ P<0.01）。结论 肾乳头部位可以分离培养并稳定扩增出具有间充质干细胞特性的KSC。     

大鼠肝实质及非实质细胞VLDL和HDL受体的研究

作者以~(125)I-标记的人VLDL和不含apo E的HDL_3为配体,研究了大鼠肝实质细胞(PC)及非肝实质细胞(NPC)的VLDL和HDL受体的生物学特性。结果显示:VLDL受体和HDL受体均可介导肝PC和NPC结合、摄取及降解相应的脂蛋白;肝NPC上该二受体的活性分别为PC的10倍和4倍;肝NPC上VLDL受体HDL受体的解离常数分别为15.0～34.2μg/ml和10.1～17.7μg/ml,最大结合容量分别为2170～2607ng/mg和1004～2738ng/mg细胞蛋白;VLDL受体活性受EDTA抑制及胆固醇的下降调节,HDL受体不受EDTA抑制但受胆固醇的上升调节。发现apoCⅢ对VLDL受体结合功能有明显抑制作用。     

非小细胞肺癌EMPE来源树突状细胞的分离培养

目的：建立非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）渗出性恶性胸腔积液（exudativemalignantpleuraleffusions,EMPE）来源树突状细胞（dendritic cells,DCs）的分离培养方法,观察DCs的形态学及对其进行表型鉴定。方法：用密度梯度离心的方法,从非小细胞肺癌EMPE中分离获得胸腔积液中的单个核细胞,用白细胞介素-4（IL-4）、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte macrophage colony-stimulating factor,GM-CSF）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）培养,应用倒置显微镜、光镜观察细胞形态;用流式细胞仪对DCs进行表型鉴定。结果：建立了PEDCs的分离培养方法。培养9d的DCs高表达人类白细胞抗原-DR（human leucocyte antigen,HLA-DR）、CD83、CD86、CD80。结论：从EMPE中分离的PEDCs体外培养后不仅在形态上成熟,而且高表达特异性表面分子。