无镁诱导培养大鼠海马神经元癫痫放电模型中延迟整流钾电流的变化

 摘要：目的 利用无镁细胞外液诱导原代培养大鼠海马神经元癫痫放电模型来检测延迟整流钾电流的变化。方法 采用新生24h内Wistar大鼠,分离海马神经元进行原代培养。体外培养至12-16d时,无镁细胞外液处理神经元3h并恢复正常细胞外液,应用全细胞膜片钳技术记录神经元的放电情况及延迟整流钾电流。结果 无镁处理后的神经元存在自发的“癫痫样”放电;无镁诱导可使神经元延迟整流钾电流增大。结论 延迟整流钾电流增大可能与无镁诱导体外培养大鼠海马神经元自发异常放电的基础病理机制相关。     

新生大鼠海马神经元癫痫样放电模型的初步研究

目的:研究"无镁细胞外液"诱导海马神经元产生癫痫样放电形式,建立离体癫痫模型.方法:采用24h新生Wistar大鼠,取海马神经元原代培养,神经元特异性烯醇化酶Neuron specific enolase,NSE)免疫荧光鉴定神经元.体外培养至第9d时,用"无镁细胞外液"处理3h,使用全细胞膜片钳技术记录神经元在相应时间点的放电情况.结果:通过鉴定可见,所培养的海马神经元纯度接近100%.在"无镁细胞外液"处理3h后致恢复正常细胞培养液培养24h,神经元仍存在自发的"癫痫样放电".结论:采用本方法体外培养的海马神经元在"无镁细胞外液"的作用下可形成稳定的癫痫样放电,为今后进行癫痫发病机制的研究提供了一种的理想模型.     

灵芝酸A对癫痫样放电海马神经元的影响

目的：旨在验证灵芝酸A对海马神经元异常放电的影响。方法分离24h新生Wistar大鼠原代海马神经元。正常对照组：将培养9d的海马神经元全液换成正常细胞外液处理3h,然后恢复正常培养24h;无Mg2＋诱导组、灵芝酸A组、紫杉醇组、γ－氨基丁酸组、丙戊酸钠组分别将培养9d的海马神经元全液换成无镁细胞外液或添加相应的50μg／mL的灵芝酸A、50μmol／L的紫杉醇、100μmol／L的γ－氨基丁酸、100mg／L的丙戊酸钠混悬液处理3h,然后恢复正常培养,MTT法检测细胞存活率;分光光度计检测超氧化物歧化酶活性;流式细胞仪检测细胞线粒体膜电位的变化。结果50μg／mL灵芝酸A可提高海马神经元细胞存活率;能升高癫痫样海马神经元细胞SOD活性、升高线粒体膜电位。结论灵芝酸A可通过抑制细胞氧化损伤、抑制凋亡而保护异常放电的海马神经元。     

无镁诱导培养的大鼠皮层神经元癫痫样放电

目的：观察无镁细胞外液短暂处理培养的胚胎鼠大脑皮层神经元能否诱导自发、反复的惊厥样放电。以期提供一种较好的研究发育中脑癫痫活动的细胞模型。方法：采用全细胞电流钳记录技术，记录体外培养12－18d的大脑皮层神经元在正常细胞外液、无镁细胞外液、无镁细胞外液处理3h继而恢复正常细胞外液后1－2h、24h、72h神经元电活动的变化。结果：（1）神经元在正常细胞外液中自发放电形式表现为兴奋性突触后电位（EPSP）及约16次／min左右的动作电位（n=29)。（2）无镁细胞外液孵育3h，孵育期间100％的细胞（n=25)放电形式发生改变，表现为两种形式：持续强直的高频爆发及“楔形”去极化。（3）经无镁细胞外液孵育3h恢复正常细胞外液后2h 100%的细胞发生异常放电（n=12),72h仍有近80％的细胞发生异常放电，主要表现为阵发性持续棘波样爆发、“楔形”去极化及PDSs样发作（paroxysmal depolarizing shifts)。结论：培养的胚胎鼠皮层神经元予短暂的无镁处理后可诱导自发、反复的惊厥样活动，且惊厥样活动可持续72h，为进一步研究发育中惊厥性脑损伤及保护提供了较好的癫痫细胞模型。     

发育中大鼠皮层神经元惊厥样放电中PSD-95 mRNA表达改变

目的探讨早期无镁细胞外液处理后惊厥样放电对发育中大鼠皮层神经元PSD-95 mRNA表达的影响。方法以原代培养的大鼠大脑皮层神经元无镁诱导的反复惊厥样放电为模型,根据对培养6d皮层神经元的不同处理分为三组：正常Neurobasal/B27培养液组（CONT组）、正常细胞外液组（PS组）和无镁细胞外液组（MGF组）。神经元分别在上述三种液体中孵育3h,然后换为正常Neurobasal/B27培养液继续培养,在处理后6,24,72h及处理后第6天时应用实时定量PCR测定PSD-95 mRNA的表达。结果与CONT组和PS组相比,MGF组PSD-95 mRNA表达在处理后24h明显增高（P〈0.05）。处理后6h,72h及第6天的皮层神经元PSD-95 mRNA表达三组中两两比较差异无统计学意义（P〉0.05）。结论发育中大鼠皮层神经元惊厥样放电可以导致神经元PSD-95 mRNA表达的改变。     

无镁诱导海马神经元癫痫样放电中Cx32作用的研究

目的:探讨缝隙连接在癫痫发病机制中的作用。方法:采用无镁液诱导的体外原代培养新生大鼠海马神经元细胞癫痫模型,应用膜片钳技术记录细胞外放电。观察放电不同时点缝隙连接蛋白Cx32的表达情况,以及生胃酮和卡马西平的抑制作用。结果:神经元经无镁培养液处理3h后产生稳定的放电,放电后Cx32表达显著增多,8h后可达对照组5倍。生胃酮和卡马西平均可抑制神经元的放电。生胃酮显著抑制了Cx32的表达,而卡马西平组Cx32水平无明显变化。结论:缝隙连接参与癫痫的发生发展过程,而且具有独立于传统的化学性突触的机制,为开发新的作用于缝隙连接的治疗药物提供了思路。     

灵芝酸对痫样放电海马神经元ERK1/2磷酸化水平的影响

目的：探讨灵芝酸对癫痫样放电海马神经元ERK1/2磷酸化水平的影响。方法：以24h内新生Wistar大鼠为细胞源,用Neurobasal培养液培养海马神经元。①应用激光共聚焦显微镜检测培养神经元的纯度及其鉴定。②应用MTT法测灵芝酸的最适无毒浓度。③在研究最大无毒浓度的灵芝酸对痫样放电海马神经元ERK1/2磷酸化水平影响的实验中,将细胞随机分为：①正常对照组：将培养至第9天的海马神经元全液换成正常细胞外液处理3h,然后恢复正常培养3h后取材;②模型组：将培养至第9天的海马神经元全液换成无镁细胞外液处理3h,然后恢复正常培养3h后取材;③治疗组：将培养至第9天的海马神经元根据灵芝酸浓度不同,分为低、中、高三个浓度组（浓度分别为20μg/mL、80μg/mL、320μg/mL）,将各组的维持培养液全液换成无镁细胞外液处理3h,然后全液换成维持培养液配制不同浓度灵芝酸混悬液处理3h后取材。ELISA方法检测ERK1/2磷酸化水平的表达。结果：成功离体培养海马神经元,并用酶联免疫分析ERK1/2磷酸化水平的表达。各实验组中均有ERK1/2的表达并且各治疗组均能降低ERK1/2磷酸化水平,浓度为80μg/mL时结果最明显。结论：海马神经元癫痫样放电后ERK1/2被激活,在有效浓度的灵芝酸能显著抑制此反应中ERK1/2的磷酸化水平。     

早期惊厥样放电对发育中大鼠皮层神经元Cx36 mRNA表达的远期影响

目的　探讨早期惊厥样放电对发育中大鼠皮层神经元缝隙连接蛋白Cx36mRNA表达的远期影响。方法　以原代培养的大鼠大脑皮层神经元无镁诱导的反复惊厥样放电为模型 ,根据对培养 6d皮层神经元的不同处理分为三组 :正常DMEM培养液组 (CONT1)、正常细胞外液组 (CONT2 )和无镁细胞外液组 (MGF)。神经元分别在上述三种液体中孵育 3h ,然后恢复正常DMEM培养液继续培养 ,在培养 7,12及 17d时测定了发育中大鼠皮层神经元早期惊厥样放电后不同时间Cx36mRNA表达。结果　分别与CONT1和CONT2组相比较 ,MGF组Cx36mRNA表达在培养 7d时无统计学差异 (P >0 .0 5 ) ,培养 12d时明显升高 ,17d时明显降低 (P <0 .0 5 )。结论　早期惊厥样放电可能导致发育中大鼠皮层神经元Cx36mRNA表达的远期影响     

无镁诱导培养的大鼠皮层神经元癫疒间样放电

目的: 观察无镁细胞外液短暂处理培养的胚胎鼠大脑皮层神经元能否诱导自发、反复的惊厥样放电.以期提供一种较好的研究发育中脑癫活动的细胞模型.方法:采用全细胞电流钳记录技术,记录体外培养12～18 d的大脑皮层神经元在正常细胞外液、无镁细胞外液、无镁细胞外液处理3 h继而恢复正常细胞外液后1～2 h、24 h、72 h神经元电活动的变化.结果:(1)神经元在正常细胞外液中自发放电形式表现为兴奋性突触后电位(EPSP)及约16次/min左右的动作电位(n=29).(2)无镁细胞外液孵育3 h,孵育期间100%的细胞(n=25)放电形式发生改变,表现为两种形式:持续强直的高频爆发及"楔形"去极化.(3) 经无镁细胞外液孵育3 h恢复正常细胞外液后2 h 100%的细胞发生异常放电(n=12),72 h仍有近80%的细胞发生异常放电,主要表现为阵发性持续棘波样爆发、"楔形"去极化及PDSs样发作(paroxysmal depolarizing shifts).结论: 培养的胚胎鼠皮层神经元予短暂的无镁处理后可诱导自发、反复的惊厥样活动,且惊厥样活动可持续72 h,为进一步研究发育中惊厥性脑损伤及保护提供了较好的癫细胞模型.     

海马神经元无镁致痫性损伤对CREB磷酸化水平的影响

目的：观察原代培养的海马神经元经无镁人工脑脊液诱发癫痫样放电后,cAMP反应元件结合蛋白（cAMP response-element binding protein,CREB）磷酸化表达水平的变化。方法：将所培养的神经元随机分成癫痫组和对照组,癫痫组中的神经元培养至第10天时,经无镁人工脑脊液（artificial cerebrospinal fluid,ACSF）处理3 h建立癫痫样放电模型,对照组中的神经元培养至第10天时,使用正常人工脑脊液处理3 h。使用Western blot检测p-CREB和β-actin的表达,免疫荧光双重标记磷酸化CREB（p-CREB）和神经元核抗原（neuronal nuclei,NeuN）的表达。结果：Western blot显示p-CREB水平在癫痫样放电后2 h即较对照组增强且在6 h达到高峰,在12 h和24 h都维持在增强水平,差异皆有统计学意义（P＜0.01）。取癫痫样放电后6 h的神经元行免疫荧光检测,其荧光强度绝对值较对照组明显增强,差异有统计学意义（P＜0.01）。结论：p-CREB水平在海马神经元无镁致痫性损伤后增强,可能在癫痫样放电中起到重要作用。     

COMBINATION OF γ-INTERFERON WITH TRAIL AND CISPLATIN OR ETOPOSIDE INDUCES APOPTOSIS IN HUMAN NEUROBLASTOMA CELL LINE SH-SY5Y

TUMOR necrosis factor related apoptosis inducingligand (TRAIL) is a recently discoveredmemberof the tumor necrosis factor (TNF) superfam i-ly.TRAIL becomes a widely studied anti-tumor drugsince it induces celldeath in a variety of tumors butnot innormal t…     

糖基化终末产物对SH-SY5Y细胞氧化应激及凋亡的影响

目的研究糖基化终末产物(AGEs)对人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)凋亡的影响,探讨AGEs与阿尔茨海默病(AD)发病机制的关系。方法分别以不同浓度糖基化修饰的牛血清白蛋白(AGE-BSA)处理SH-SY5Y细胞48 h,选取AGE-BSA敏感浓度(200μg/mL)处理细胞不同时间,流式细胞仪(FCM)检测细胞凋亡率,确定AGE-BSA诱导SH-SY5Y凋亡最佳浓度及时间。将细胞随机分为对照组、牛血清白蛋白(BSA)对照组、AGE-BSA组、AGE-BSA+抗RAGE中和抗体组、AGE-BSA+α-硫辛酸组、AGE-BSA+DPI(NADPH氧化酶抑制剂)组。FCM检测细胞凋亡率变化,Hoechst 33258染色观察细胞形态改变,应用活性氧荧光探针DCFH-DA检测活性氧(ROS)水平,Western blot测定Caspase-12的表达。结果细胞凋亡率随AGE-BSA浓度增加及作用时间延长而升高,200μg/mL AGE-BSA作用48 h细胞凋亡率从对照组的(2.23±0.08)%增加到(16.8±1.27)%(P<0.05),同时,Hoechst染核后可见典型凋亡形态改变,细胞内ROS水平显著增高,Caspase-12蛋白表达明显上调,与对照组相比差异显著(P<0.05),而分别用抗RAGE中和抗体、α-硫辛酸、DPI预处理后再加入AGE-BSA,各组与AGE-BSA组比较,凋亡率明显下降,ROS水平、Caspase-12蛋白表达均明显降低(P<0.05)。结论糖基化终末产物可刺激SH-SY5Y细胞产生大量ROS及活化Caspase-12介导细胞凋亡,通过阻断其与特异性受体RAGE结合或减少细胞内ROS可减轻细胞凋亡的发生。     

瘦素减轻6-羟基多巴胺诱导的SH-SY5Y细胞损伤

目的探讨瘦素对6-羟基多巴胺（6-hydroxydopamine,6-OHDA）所诱导的人神经母细胞瘤细胞（SH—SY5Y）凋亡的抑制作用。方法建立6-OHDA诱导的SH—SY5Y细胞损伤模型,用瘦素进行干预,采用倒置显微镜观察细胞形态,MTT法检测细胞活性,LDH法检测细胞损伤,台盼蓝检测细胞死亡率,流式细胞术检测细胞凋亡率,并用免疫荧光检测activecaspase-3的荧光强度,Westernblot检测Bcl-2和Bax的表达水平。结果成功建立了6-OHDA诱导的SH—SY5Y细胞损伤模型。在模型的基础上,瘦素干预后,细胞凋亡率降低约15％,细胞存活率提高约14％,细胞损伤降低率和死亡率,activecaspase-3的浓度下降,Bcl～2／Bax的比值显著提高（P〈0．05）。结论瘦素对6-OHDA诱导的SH—SY5Y细胞凋亡具有一定的抑制作用,这对瘦素可能参与帕金森病的保护作用提供了证据。     

热打击可通过调控内质网应激通路促进神经细胞凋亡

Objective To explore the role of endoplasmic reticulum stress in heat stress-induced apoptosis of human neuroblastoma SH-SY5Y cells. Methods SH-SY5Y cells were incubated at 43 ℃ for 2 h followed by further culture at 37 ℃ for 0, 3 h, or 6 h. With the cells cultured at 37 ℃ as the control, the cells exposed to heat stress were examined for morphological changes under optical microscope and changes in cell viability using CCK-8 assay. Flow cytometry was performed for detecting apoptosis of the cells following heat stress, and intracellular Ca2 + level in the cells was determined using flow cytometry and immunofluorescence confocal microscopy. The mRNA expression levels of caspase-12, BIP and XBP-1 in the cells were detected using qRT-PCR, and the protein expressions of caspase-12, BIP, P- JNK, JNK and XBP-1 were examined using Western blotting. The effect of pretreatment with 4-PBA on cell apoptosis following heat stress was analyzed with Western blotting. Results SH-SY5Y cells showed obvious cell shrinkage immediately after the exposure to heat stress, followed then by gradual cell stretching over time. The cell viability decreased significantly after heat stress (P=0.001), and the intracellular Ca2+ level increased significantly at 0 h and gradually recovered the normal level at 3 and 6 h. Heat stress induced significant increase in the protein expression of cleaved caspase-3 and time-dependent increase of caspase-12 (P=0.002) and BIP (P=0.008) expression at both the protein and mRNA levels. The expression of P-JNK/JNK protein increased significantly at 0 h (P=0.003) followed by gradual decrease; the expression levels of XBP-1 protein and mRNA gradually decreased after heat stress (P=0.005, P=0.002). Pretreatment with 4-PBA significantly reduced the expression level of cleaved caspase-3 in SH-SY5Y cells following heat stress. Conclusion Heat stress induces apoptosis of SH- SY5Y cells by triggering endoplasmic reticulum stress and the imbalance of intracellular calcium ion homeostasis.     

连翘苷对MPP+诱导人神经母细胞株SH-SY5Y细胞损伤的保护作用

目的：研究连翘苷对1-甲基-4-苯基吡啶离子（1-methyl-4-phenylpyridinium,MPP⁺）诱导人神经母细胞株SH-SY5Y细胞损伤的神经保护作用。方法：培养的SH-SY5Y细胞加入不同浓度的连翘苷,以MTT代谢率为指标确定连翘苷的无毒范围;对培养的SH-SY5Y细胞加入连翘苷100,10,1 μmol·L^-1预孵育24 h,加入1 mmol·L^-1 MPP⁺ 作用48 h诱导损伤,观察MTT代谢率、乳酸脱氢酶（Lactate dehydrogenase,LDH）漏出率的改变。结果：连翘苷在1~100 μmol·L^-1浓度范围内不影响SH-SY5Y细胞存活率;与正常对照组细胞相比,MPP⁺损伤模型组MTT代谢率明显降低（P＜0.001）,LDH漏出率显著增加（P＜0.001）;与模型组相比,连翘苷各组细胞活性显著升高（P＜0.05）,LDH漏出率明显降低（P＜0.01）。结论：连翘苷对MPP⁺诱导的SH-SY5Y细胞损伤具有神经保护作用。     

6-羟基-1-氢-吲唑保护 MPP +诱导凋亡的 SH-SY5Y 细胞的机制

目的：研究6-羟基-1-氢-吲唑对1-甲基-4-苯基-吡啶离子(MPP +)诱导凋亡的 SH-SY5Y 细胞的保护作用机制。方法体外培养人神经母细胞瘤细胞 SH-SY5Y,以200μmol/ L MPP +诱导 SH-SY5Y 细胞凋亡建立体外帕金森病细胞模型。 Western blot 法分别检测200μmol/ L MPP +和200μmol/ L MPP +联合0.1μmol/ L 6-羟基-1-氢-吲唑作用后 SH-SY5Y 细胞内糖原合酶激酶3β(GSK-3β)、周期依赖性蛋白激酶5(CDK5)以及凋亡蛋白酶3(caspase-3)的活性。结果200μmol/ L MPP +作用 SH-SY5Y 细胞8 h, GSK-3β、CDK5与 caspase-3活性升高。200μmol/ L MPP +联合0.1μmol/ L 6-羟基-1-氢-吲唑作用 SH-SY5Y 细胞8 h,GSK-3β、CDK5与 caspase-3的活性降低。结论6-羟基-1-氢-吲唑对MPP +诱导凋亡的 SH-SY5Y 细胞的保护机制可能是抑制GSK-3β、CDK5和 caspase-3的活性。     

多器官细胞共同培养方法检测双黄连口服液的细胞毒性

目的：观察双黄连口服液对人类体外不同靶器官细胞的毒性及特点。方法：应用人类多器官细胞共培养模型,观察双黄连口服液分别作用24、48、72 h后,对WI-38、HepG2、HEK293、SH-SY5Y和HCF细胞增殖的影响。结果：双黄连口服液处理24、48、72 h后,各种细胞的增殖率有随着剂量的降低而升高的趋势、且有较好的剂量-效应关系。该药除在72 h后的1/32浓度对HEK293细胞无影响外,在所有时点的各浓度均抑制该细胞的增殖。处理24 h后,1/4～1（原液）浓度的双黄连口服液抑制WI-38细胞,1/8～1（原液）浓度的该药抑制HepG2、SH-SY5Y和HCF细胞增殖;48 h后,1/16～1（原液）浓度抑制WI-38、HepG2、SH-SY5Y和HCF细胞;72 h后,1/2～1（原液）浓度的双黄连口服液抑制WI-38细胞,所有浓度的该药均抑制HepG2、SH-SY5Y和HCF细胞。结论：双黄连口服液对WI-38、HepG2、HEK293、SH-SY5Y和HCF细胞可能均有毒作用,其可能的毒性大小顺序为肾细胞>肝细胞>神经、心肌细胞>肺细胞。     

可溶性耐药相关钙结合蛋白在MPP+诱导的SH-SY5Y细胞帕金森病模型中的表达及意义

目的:观察1-甲基-4-苯基吡啶离子(MPP+)诱导的SH-SY5Y细胞帕金森病(PD)模型中可溶性抗药性相关钙结合蛋白(sorcin)表达的变化,寻求参与PD多巴胺能神经元细胞神经变性的蛋白质改变,为阐明PD的发病机制提供理论依据.方法:应用1.0 mmol·L-1 MPP+处理未分化的SH-SY5Y细胞24 h,在...     

反义P38cDNA抑制胆红素诱导的人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞凋亡

目的：观察P38激酶特异性抑制剂SB203580及反义P38激酶cDNA对胆红素诱导人神经母细囊瘤SH—SY5Y细胞凋亡的影响，探讨P38激酶信号转导通路在胆红素诱导SH—SY5Y细胞凋亡中的作用及高胆红素血症损伤中枢神经细胞的分子机制及在听神经病发病中的作用。方法：分别经SB203580和二甲基亚砜预处理的SH—SY5Y细胞在胆红素作用3h和5h后，在倒置光显微镜下观察细胞形态的变化及存活情况；流式细胞仪检测凋亡细胞百分率。采用脂质体法将含人反义P38cDNA的真核表达载体pcDNA3．O—antiP38导入SH—SYSY细胞，建立稳定低表达P38蛋白的细胞株，经Western blotting鉴定后命名为SH—SY5Y—antiP38，而转染空载体pcDNA3．0的SH—SY5Y细胞株则命名为SH—SY5Y细胞株则命名为SH-SY5Y-pcDNA3.0；SH—SY5Y—antiP38细胞和SH-SY5Y-pcDNA3．O细胞分别经胆红素作用3h和5h，在倒置光显微镜下观察细胞形态的变化及存活情况；流式细胞仪检测凋亡细胞百分率。结果：在0．02g／L胆红素作用下，流式细胞仪显示与对照相比SB203580预处理的SH—SY5Y细胞在胆红素作用3h后，其凋亡细胞由19．4％下降到12．1％，5h后由66．2％降到39．3％；与SH—SY5Y—pcDNA3．O细胞相比，SH—SY5Y—antiP38细胞在胆红素作用3h后，其凋亡细胞由11．1％降到8．02％，5h后67％降到23．4％。结论：P38激酶参与了胆红素诱导SH—SY5Y细胞凋亡的信号转导。P38通路的激活可能在高胆红素血症导致的神经细胞损伤中(包括听神经细胞)发挥重要作用。