蛋白酶体抑制剂对大肠癌细胞增殖和凋亡的影响

目的研究蛋白酶体抑制剂MG132对大肠癌细胞系HCT-8增殖和凋亡的影响及其机制。方法将不同浓度MG132分别作用于HCT-8细胞,MTT法测其对HCT-8细胞增殖的抑制作用,流式细胞术检测细胞凋亡率,免疫细胞化学检测NF—κB、caspase3蛋白表达。结果随着MG132剂量、作用时间的增加,细胞增值抑制率增加（P〈0．01）;MG132作用细胞48h后,随着药物浓度的增加,细胞凋亡率增加（P〈0．01）;细胞内NF—kBp65的表达减少而caspase3的表达增加（P〈0．01）。结论MG132能显著抑制大肠癌细胞增殖并诱导其凋亡,可能与下调NF—κB表达、促进caspase3表达有关。     

梅毒螺旋体金属蛋白酶水解纤维蛋白原的活性研究

目的　研究梅毒螺旋体金属蛋白酶Tp0751对细胞外基质纤维蛋白原的水解能力,为深入研究TP的致病机制提供实验依据。　方法　采用两点法构建H198A突变型及H202A突变型Tp0751基因,分别构建野生型和突变型Tp0751原核载体进行诱导表达;体外实验检测Tp0751野生型Tp0751蛋白、H198A　Tp0751突变型蛋白、H202ATp0751突变型蛋白对纤维蛋白原的降解活性。　结果　成功表达并纯化了野生型Tp0751蛋白、H198A　Tp0751突变体蛋白、H202A　Tp0751突变体蛋白,各蛋白相对分子量大小约为26kD;纤维蛋白原在与野生型Tp0751蛋白作用约24h后被完全水解;与H198A　Tp0751突变体蛋白作用约24　h后部分水解,尚有部分未被降解;与H202A　Tp0751突变体蛋白作用约24h后几乎不被水解。　结论　野生型Tp0751蛋白具有水解纤维蛋白原的作用;Tp0751蛋白水解纤维蛋白原的活性可能与金属蛋白酶HEXXH域相关,影响Tp0751蛋白对纤维蛋白原的降解的活性位点可能是202位的H而不是198位的H。     

蛋白酶体抑制剂MG132联合顺铂对肺癌细胞凋亡及Caspase-3、Caspase-8蛋白表达的影响

目的探讨蛋白酶体抑制剂MG132联合顺铂对肺癌NCI—H1299细胞凋亡及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-8(Caspase-8)蛋白表达的影响。方法将肺癌NCI—H1299细胞行体外原代及传代培养,将培养好的细胞分为4组:对照组(C组,加入磷酸盐缓冲液3 ml)、顺铂组(D组,加入顺铂20 mg/L)、MG132组(M组,加入MG-132 2.5μmol/L)、顺铂+MG132组(D+M组,加入顺铂20 mg/L+MG-132 2.5μmol/L)。孵育30 min,应用MTT比色检测法测定各组肺癌NCI-H1299细胞生长抑制情况,倒置显微镜观察肺癌细胞形态学的变化,流式细胞仪测定肺癌细胞凋亡情况,应用Western blot法对Caspase-3、Caspase-8蛋白表达进行定性及定量分析。结果 MTI结果显示,M组、D+M组肺癌NCI-H1299细胞增殖率显著高于C组及D组(P<0.05),而D+M组肺癌细胞增殖率高于M组(P>0.05);肺癌NCI-H1299细胞培养48 h后M组、D+M组细胞凋亡率高于C组及D组(P<0.05),且D+M组肺癌细胞凋亡率高于M组;Western blot法显示M组、D+M组Caspase-3、Caspase-8蛋白表达水平低于C组及D组(P均<0.05)。结论 MG132与顺铂联合应用可抑制TGF—β1诱导肺癌NCI-H1299细胞凋亡,可能作用机制是MG132能有效下调Caspase-3、Caspase-8蛋白表达。     

生存素在肿瘤研究中的进展

survivin是一种新发现的凋亡抑制蛋白(inh ib iorapoptosisipro-te in,IAP),它主要通过抑制半胱天冬蛋白酶3(caspase 3)和半胱天冬蛋白酶7(caspase 7)的活性而抑制细胞凋亡。目前,对survivin的分子生物学,组织分布特点,凋亡抑制机制与细胞周期关系及其与肿瘤的发生发展、诊断、     

三七总皂甙对脑出血大鼠前脑促凋亡基因caspase-3影响的研究

目的　研究大鼠脑出血前脑内促凋亡基因半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶 - 3(caspase 3)的表达 ,以及三七总皂甙对其表达的影响。方法　用原位杂交法观察胶原酶诱导的脑出血大鼠前脑内caspase 3mRNA在给药组和对照组的表达变化 ;用免疫组化法观察caspase 3p2 0蛋白的变化。结果　脑出血后前脑内caspase 3mRNA及caspase 3p2 0主要在病灶及病灶周围、大脑皮质Ⅱ～Ⅴ层、海马CA2 、CA3区表达 ,阳性细胞包括变性神经元和胶质细胞。给药组阳性细胞数量显著减少 ,细胞着色变浅。结论　三七总皂甙可通过抑制caspase 3mRNA的转录及caspase 3蛋白的裂解活化 ,减少细胞凋亡 ,促进脑出血后前脑内神经元的存活及损伤修复     

蛋白酶体抑制剂MG132诱导人血管内皮细胞凋亡及其机制

目的观察蛋白酶体抑制剂MG132对人血管脐静脉内皮细胞（ECV-304）的致凋亡作用,并从泛素-蛋白酶体途径（UPP）相关基因E1、E2和E3及天冬氨酸特异的半胱氨酸蛋白酶3（Caspase-3）表达初步探讨MG132的致细胞凋亡机制。方法采用蛋白酶体抑制剂MG132（2μmol/L和5μmol/L）处理ECV-304细胞;流式细胞术检测细胞凋亡率;逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测UPP相关基因E1、E2、E3和凋亡相关基因caspase-3的转录水平;免疫细胞化学检测细胞caspase-3蛋白表达。结果MG132处理组细胞的凋亡率明显增加;细胞内UPP相关基因E1、E2、E3 mRNA表达下降,而凋亡相关基因caspase-3 mRNA表达上调;细胞内caspase-3蛋白表达水平升高。结论蛋白酶体抑制剂MG132能够诱导ECV-304细胞凋亡,其机制可能是MG132抑制UPP活性,使细胞内caspase-3蛋白降解减少,同时上调caspase-3基因转录而促进细胞凋亡。     

卵巢癌细胞凋亡中核因子кB、半胱酰氨天冬氨酸特异性蛋白酶3、survivin的调控

核因子кB是一种多极性转录因子,参与免疫反应、细胞凋亡、肿瘤发生和转移等多种生理病理过程;参与多种基因的表达与调控.半胱酰氨天冬氨酸特异性蛋白酶(caspase)-3是凋亡效应蛋白酶家族中主要的效应蛋白,在细胞凋亡过程中发挥极其关键的作用.Survivin是凋亡抑制蛋白家族中较活跃的一员,具有抑制细胞凋亡的作用.本文主要综述核因子кB、caspase-3、survivin在凋亡中的作用,以及三者在卵巢癌的表达和影响.     

卵巢癌细胞凋亡中核因子κB、半胱酰氨天冬氨酸特异性蛋白酶3、survivin的调控

核因子κB是一种多极性转录因子,参与免疫反应、细胞凋亡、肿瘤发生和转移等多种生理病理过程;参与多种基因的表达与调控。半胱酰氨天冬氨酸特异性蛋白酶(caspase)-3是凋亡效应蛋白酶家族中主要的效应蛋白,在细胞凋亡过程中发挥极其关键的作用。Survivin是凋亡抑制蛋白家族中较活跃的一员,具有抑制细胞凋亡的作用。本文主要综述核因子κB、caspase-3、survivin在凋亡中的作用,以及三者在卵巢癌的表达和影响。     

昆明山海棠碱诱导Jurkat淋巴瘤细胞株的PARP酶剪切和caspase-3激活

目的　探讨昆明山海棠碱诱导淋巴瘤细胞凋亡过程中caspase 3和PARP酶的作用 ,以了解THH碱诱导细胞凋亡的机制。方法　THH碱诱导JurkatT淋巴瘤细胞后 ,FAM DEVD FMK荧光标记活化的caspase 3 ,免疫细胞化学方法荧光标记PARP酶剪切后的 89× 10 3片段 ,均以流式细胞术检测。结果　THH碱能有效诱导caspase 3激活和PARP酶剪切。结论　提示在THH碱能诱导JurkatT淋巴瘤细胞凋亡过程中caspase 3和PARP酶参与调控 ,它们可能抑制了受损伤DNA的修复 ,从而导致DNA片段化     

线粒体/细胞色素C介导的凋亡通路的研究进展

线粒体凋亡途径在细胞凋亡信号转导途径中是近年来研究的热门。细胞内外各种刺激信号引起Bcl-2同源结构域3(Bcl-2 homology domain3,BH3)-only蛋白激活,通过Bcl-2家族(B celllymphoma 2)调控线粒体,使线粒体外膜渗透而导致细胞色素C及(second mitochondrial-derived activa-tor of caspase,Smac)流入胞质与凋亡活化因子-1(apoptosis activated factor-1,Apaf-1)及胱天蛋白酶-9(caspase-9)结合形成复合体。caspase-9的激活将引起其下游胱天蛋白酶的级联反应,导致该细胞凋亡。这一过程中有一系列反馈调节如Smac对凋亡抑制蛋白(IAP)的抑制等。     

Muc3羧基端内SEA组件的蛋白酶切与N糖基化关系的研究

目的Muc3的羧基端在翻译后经历了蛋白酶切反应,探讨Muc3的羧基端蛋白酶切反应发生是否与其羧基端内的N型糖链有关。方法截断了的Muc3的羧基端(含完整的SEA组件)(p20SEA)采用定点突变方法在所要求的位点插入终止密码子,所表达蛋白质的检测采用pulse/chase和免疫共沉淀方法或SDS/PAGE和Western印迹方法,所表达蛋白质的N型糖链合成抑制采用Tunicamycin处理转染的COS-1细胞。结果p20表达产物(完整的Muc3羧基端产物)经历了翻译后蛋白酶切,产生30×103的氨基端酶切片段和49×103的羧基端酶切片段;Tunicamycin处理后主要的表达蛋白是60×103的全长的非糖基化产物,22×103的少量氨基端酶切片段和41×103的羧基端酶切片段;p20SEA表达产物(含完整的SEA组件但不含SEA组件后续氨基酸的截断Muc3羧基端)抑制N型糖链出现未酶切的36×103全长产物和22×103酶切的非N糖基化产物。结论大鼠Muc3羧基端在抑制其N型糖链合成后出现Muc3的羧基端蛋白酶切的抑制。     

探讨MG132对人肺腺癌A549细胞凋亡的影响及其机制

目的：研究不同浓度蛋白酶体抑制剂MG132对人肺腺癌A549细胞凋亡的作用,并且观察对细胞中Bcl-2和Bad两种凋亡相关蛋白表达的影响。方法：体外培养A549细胞分别暴露于0、5、10、20、40Ixmol／L的MGl32,24h后MTF法测定细胞存活率,流式细胞术（FCW）检测细胞的凋亡率,WesternBlot方法测定A549细胞中Bcl-2和Bad两种蛋白的表达情况。结果：MTY法和流式细胞术检测结果显示,A549细胞的存活率和凋亡率与MGl32呈浓度依赖性关系,MG132浓度越高细胞存活率越低,并且凋亡率越高。WesternBlot方法测定结果显示A549细胞中Bcl-2的表达随着MG132浓度增高而逐渐减少,而Bad的表达无明显变化。结论：MG132可以诱导人肺腺癌A549细胞的凋亡,实现该作用的可能机制部分是通过降低Bcl-2蛋白的表达,而Bad在这一过程中似乎没有表现出明显的作用。     

The Apoptosis of Bovine Lens Epithelial Cells Induced by Proteasome Inhibitor MG132

To investigate the effect of proteasome inhibitor MG132 on the apoptosis of bovine lens epithelial cells （BLECs）, the cells were treated with MG132 at different concentrations for12, 24 and 36 h. The cell viability was analyzed by MTT assay and the effect of MG132 on the apoptosis of BLECs was assessed by flow cytometry （FCM）. The results showed that after treatment for the same period, the inhibitory effect of MG132 on BLECs proliferation was enhanced with the increment of the concentration of MG132 （0, 2, 5, 10, μmol/L） （P〈0.05）. The 50% inhibiting concentration （IC50） was 2.03 μmol/L when the BLECs were treated with MG132 for 36 h. MG132 also induced the apop- tosis of BLECs obviously. FCM showed that the apoptosis index of the cells treated by MG132 at 2 μmol/L for 12 h was （20.24±1.51）%, and that of the control was （0.98±0.20）% respectively （P〈0.01, n=3）. It was concluded that MG132 could lead to apoptosis of BLECs. The decrease of proteasome activity may play an important role in the formation and development of cataract.     

蛋白酶体抑制剂lactacystin诱导PC12细胞凋亡以及半胱氨酸蛋白水解酶3活化的实验研究

目的探讨蛋白酶体功能缺陷是否能诱导多巴胺能细胞发生凋亡及其可能的作用机理。方法应用高选择性的蛋白酶体抑制剂lactacystin(0、1μmol/L、5μmol/l或10μmol/L)处理大鼠嗜铬细胞瘤PC12细胞株24h,四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测细胞活力的改变。10μmol/Llactacystin作用24h后,Hoechst荧光染色观察凋亡细胞的核形态学改变,流式细胞仪测定细胞凋亡百分率。用Western印迹法检测10μmol/Llactacystin作用0、24或48h时PC12细胞内半胱氨酸蛋白水解酶3活化片段的动态变化。结果5μmol/L或10μmol/Llactacystin作用24h后,PC12细胞的活力(87%±6%和26%±6%)显著低于对照组(P<0.05)。Hoechst荧光染色显示10μmol/Llactacystin作用24h后部分细胞呈现凋亡细胞核形态学改变;流式细胞仪证实31.4%±4.0%的PC12细胞发生了凋亡,与对照组(7.5%±0.8%)比较差异有统计学意义(P<0.01)。Western印迹法显示对照组细胞内仅有极少量的半胱氨酸蛋白水解酶3活化片段表达;10μmol/Llactacystin作用48h的PC12细胞内半胱氨酸蛋白水解酶3活化片段的表达明显较多。结论蛋白酶体抑制剂lactacystin能诱导多巴胺能细胞PC12发生凋亡,半胱氨酸蛋白水解酶3蛋白酶的激活可能参与lactacystin诱导的PC12细胞凋亡过程;蛋白酶体的功能缺陷在帕金森病发病机制中可能发挥重要作用。     

藁本内酯预处理对Aβ25-35诱导人脑神经瘤母细胞SH-SY5Y细胞毒性的保护作用

目的探讨藁本内酯(Z-ligustilide,LIG)对β淀粉样蛋白(Aβ)25-35引起的人脑神经瘤母细胞SH-SY5Y细胞毒性的保护作用。方法 0.1、1.0、2.5、5.0μg/mL LIG作用于SH-SY5Y细胞,24h后以50μmol/LAβ25-35诱导SH-SY5Y细胞凋亡建立阿尔茨海默病体外模型,MTT法检测细胞活性,Western blot法检测细胞中凋亡蛋白含量。结果经Aβ25-35处理后,细胞存活率下降,细胞内凋亡相关蛋白——Bax、cleaved caspase3、细胞色素C、caspase8表达上调,但Bcl-2蛋白表达下降(P均<0.05)。细胞经过LIG一定浓度预处理,细胞存活率提高,凋亡相关蛋白——Bax、cleaved caspase3、细胞色素C、caspase8蛋白表达下降,Bcl-2表达上升(P均<0.05)。结论 LIG具有对Aβ25-35诱导的SH-SY5Y细胞毒性的保护作用,其机制可能是抑制Aβ诱导的细胞凋亡。     

选择性抑制转录核因子κB活性对白血病K562细胞生存素表达的影响

目的探讨高选择性的蛋白酶抑制药MG132诱导的K562细胞凋亡及其对转录核因子KB（NF-κB）活性和抗凋亡蛋白生存素（Survivin）表达的影响。方法采用细胞形态学观察和流式细胞术检测细胞凋亡,免疫细胞化学和Western印迹分析NF-KB的活性和Survifin的表达。结果不同浓度的MG132作用24h后可诱导K562细胞凋亡,呈剂量依赖效应。NF-κB和Survivin在K562细胞中异常高表达,MG132作用后均明显下调。2、4、6、8μmol／LMG132作用于K562细胞24h后,NF-κB活性分别下调至作用前的75．0％±3．7％、59．9％±5．3％、45．4％±5．7％和25．0％±4．2％,而Survivin蛋白表达分别下调至作用前的90．9％±10．1％、66．7％±5．2％、45．4％±5．7％和30．3％±6．6％,NF-κB活性降低的同时Survivin蛋白的表达也下调,两者密切相关（Pearson相关系数0．989,P〈O．01）。结论MG132可有效地抑制NF-κB的活性,诱导K562细胞发生凋亡,同时抗凋亡蛋白Survifin的表达也随之下调。     

Lipopolysaccharide-enhanced early proliferation of insulin secreting NIT-1 cell is associated with nuclear factor-kappaB- mediated inhibition of caspase 3 cleavage

Background  Increased levels of plasma lipopolysaccharide (LPS) have been found in obesity and diabetes patients. This study was to investigate the effect of LPS on pancreatic beta-cell viability and the involvement of caspase 3 in NIT-1 cell line.

Methods  Mouse insulinoma NIT-1 cells were treated with LPS for the indicated time and dose. Cell viability was measured by cell counting kit-8 reagent. Toll-like receptor 4 (TLR4), caspase 3 and cleaved caspase 3 were detected by Western blotting. Insulin was determined by radioimmunoassay (RIA).

Results  LPS promoted NIT-1 cell proliferation at 1 µg/ml, peaked at 72 hours of incubation. A reduction in cleavage of caspase 3 was observed upon LPS treatment. Bay11-7082, a specific inhibitor of nuclear factor (NF)-κB, blunted LPS-induced inhibition of caspase 3 cleavage. Reduction in chronic insulin secretion was observed after treatment with LPS at 1 µg/ml for 48 and 72 hours, not for 24 hours. TLR4 protein was upregulated when NIT-1 cells were treated with LPS at 1 µg/ml for 24 hours.

Conclusions  LPS promotes early NIT-1 cell proliferation in association with NF-κB-mediated inhibition of caspase 3 cleavage. LPS exerts a time-dependent inhibitory effect on chronic insulin secretion from NIT-1 cells.

     

20(s)-原人参二醇对体外培养Siha细胞caspase-3表达激活的影响

目的：观察20(s)-原人参二醇（PPD）对体外培养人宫颈癌Siha细胞中caspase-9和caspase-3转录表达的影响,以及caspase-3的活化形式cleaved caspase-3含量的变化,阐明其诱导Siha细胞凋亡的机制。方法：体外培养人宫颈癌Siha细胞,将其分为阴性对照组（乙醇）和实验组（20　 μgL^-1 PPD）,分别用乙醇和PPD处理体外培养的宫颈癌Siha细胞,48　h后流式细胞仪检测细胞的凋亡峰,半定量RT-PCR、Western blotting和免疫细胞化学染色方法检测PPD处理后Siha细胞中caspase-9和caspase-3基因的转录与表达水平。结果：与阴性对照组比较,20　 μg?L-1 PPD处理48 h后,Siha细胞凋亡率增加(P<0.05),Siha细胞中caspase-9与caspase-3转录水平升高(P<0.01),表达上调(P<0.01),caspase-3的活化形式cleaved caspase-3含量增加(P<0.01)。细胞免疫化学检测可见实验组细胞出现棕色颗粒。 结论：PPD可促进人宫颈癌Siha细胞凋亡,其机制与激活caspase家族级联反应有关。