EFFECT OF ESTRADIOL ON THE EXPRESSION PROFILE OF IRS-1 DURING MC3T3-E1 CELLS DIFFERENTIATION

目的:观察前成骨样细胞(MC3T3-E1细胞)分化过程中17 β-雌二醇对胰岛素受体底物-1(insulin receptor substrate-1,IRS-1)的影响.方法:应用10 mmol/L β-甘油磷酸钠和50 mg/L抗坏血酸诱导小鼠MC3T3-E1细胞分化成熟,分别在0,6,12,18,24,30 d收集细胞.17β-雌二醇干预,用半定量 RT-PCR和免疫印迹法检测干预组和对照组细胞IRS-1 mRNA和蛋白的表达,比较两组细胞IRS-1表达量的变化.结果:在MC3T3-E1细胞分化成熟过程中,IRS-1 mRNA和蛋白的表达在MC3T3-E1细胞分化成熟过程中逐渐增高.结论:IRS-1可能在17β-雌二醇诱导的骨转换过程中起着重要作用.     

雌激素对前成骨细胞胰岛素受体底物-1的影响

目的:观察前成骨样细胞(MC3T3-E1细胞)分化过程中17β-雌二醇对胰岛素受体底物-1(insulin receptor substrate-1,IRS-1)的影响。方法:应用10mmol/Lβ-甘油磷酸钠和50mg/L抗坏血酸诱导小鼠MC3T3-E1细胞分化成熟,分别在0,6,12,18,24,30d收集细胞。17β-雌二醇干预,用半定量RT-PCR和免疫印迹法检测干预组和对照组细胞IRS-1mRNA和蛋白的表达,比较两组细胞IRS-1表达量的变化。结果:在MC3T3-E1细胞分化成熟过程中,IRS-1 mRNA和蛋白的表达在MC3T3-E1细胞分化成熟过程中逐渐增高。结论:IRS-1可能在17β-雌二醇诱导的骨转换过程中起着重要作用。     

木犀草素对小鼠体外培养前成骨细胞MC3 T3-E1增殖、分化、矿化和Wnt通路的影响

目的:探讨木犀草素对小鼠体外培养前成骨细胞MC3T3-E1增殖、分化和矿化及Wnt通路的影响.方法:在体外培养的MC3T3-E1s培养基中加入木犀草素0.25~8.00μmol/L培养12、24和48 h,以洛伐他汀0.04μmol/L作为阳性对照,采用细胞计数试剂盒法检测细胞增殖情况;用碱性磷酸酶(ALP)试剂盒检测细胞内ALP的活性;茜素红S染色法检测细胞矿化能力;采用实时荧光定量反转录PCR法检测细胞Ⅰ型胶原、骨钙素、低密度脂蛋白受体相关蛋白5(Lrp5)、β-连环素、护骨素/细胞核因子κB受体活化因子配体mRNA表达水平.结果:木犀草素可以剂量依赖性和时间依赖性地促进成骨细胞MC3T3-E1增殖(P<0.05~P<0.01);木犀草素(2.00、4.00和8.00μmol/L)可以剂量依赖性地促进MC3T3-E1成骨细胞ALP活性,增强MC3T3-E1成骨细胞矿化能力并上调MC3T3-E1成骨细胞中Ⅰ型胶原、骨钙素、Lrp5、β-连环素和护骨素/细胞核因子κB受体活化因子配体mRNA表达.结论:木犀草素2.00、4.00和8.00μmol/L可以促进MC3T3-E1细胞的增殖、分化与矿化及Wnt通路中Lrp5和β-连环素mRNA的表达.     

杜仲叶提取物对MC3T3-E1细胞增殖作用的实验研究

目的研究杜仲叶提取物（Euec）对小鼠成骨样细胞株MC3T3-E1细胞生长、增殖的影响及其分子机制。方法采用Euec与MC3T3-E1细胞体外共同培养,MTT法检测不同浓度Euec处理MC3T3-E1细胞24、48、72h后的细胞增殖情况,流式细胞仪检测细胞周期分布。结果4．0～125．0μg／ml的Euec能促进MC3T3-E1细胞增殖,其中7.8μg／ml的Euec对MC3T3-E1细胞增殖的促进作用最强。流式细胞仪检测显示,6.25μg／ml的Euec作用MC3T3-E1细胞48h后,G0/G1期成骨样细胞显著减少,S期成骨样细胞增多,G2/M期成骨样细胞显著增多。结论Euec可促进MC3T3-E1细胞向G2／M期转换,使G1期的成骨样细胞减少,G2期的成骨样细胞显著增加,从而促进细胞的有丝分裂和细胞的增殖。     

还原型谷胱甘肽上调β-catenin蛋白表达促进MC3T3-E1细胞成骨分化

目的:探讨还原型谷胱甘肽(GST)对小鼠成骨细胞MC3T3-E1成骨分化的影响,并从Wnt/β-catenin信号通路角度初步探讨其可能的机制。方法:通过碱性磷酸酶(ALP)染色以及细胞外钙化结节来检测成骨细胞MC3T3-E1的分化情况;GST干预MC3T3-E1成骨细胞株7 d、14 d和21 d后,利用Real-time PCR检测成骨相关因子RUNX2、OSX、COLⅠ、OCN基因及Wnt/β-catenin信号通路相关基因β-catenin、LRP5和GSK-3β的表达;通过Western blot检测β-catenin蛋白表达。结果:ALP染色观察到MC3T3-E1细胞外基质存在钙质沉积,且MC3T3-E1 ALP活性阳性。GST能明显提高MC3T3-E1细胞成骨相关基因以及Wnt/β-catenin信号通路相关基因的表达。Western blot结果提示GST可以明显促进β-catenin蛋白的表达。结论:MC3T3-E1细胞本身具有一定的成骨细胞特性,有效浓度的GST能促进小鼠MC3T3-E1细胞成骨分化,Wnt/β-catenin信号转导通路在成骨分化过程中起一定的调节作用。     

重楼皂苷I对成骨细胞MC3T3-E1增殖及分化的实验研究

目的:研究重楼皂苷I (PPL I)对小鼠成骨样细胞MC3T3-E1增殖的作用及其机制。方法:采用MTT比色法、EdU试剂盒、碱性磷酸酶(ALP)活性检测法、茜素红染色法,观察加入PPL I (1、3、10、30μmol/L)后,MC3T3-E1的增殖、成熟与矿化情况;采用免疫印迹法,观察PPL I (3、10μmol/L)对细胞中β-连环素(β-catenin)和骨形成蛋白-2 (BMP-2)的表达影响。结果:PPL I可以有效地促进成骨样细胞MC3T3-E1增殖,并浓度依赖性地升高β-catenin与BMP-2蛋白的水平。结论:PPL I能促进MC3T3-E1细胞的增殖与分化,可能与其调节β-catenin与BMP-2的表达有关。     

Col24α1基因低表达对成骨细胞碱性磷酸酶及矿化作用的影响

目的:探讨细胞外基质基因Col24α1在MC3T3-E1细胞成骨样分化过程中的表达情况,及其对分化过程中碱性磷酸酶活性和细胞矿化作用的影响。方法:培养MC3T3-E1细胞并诱导成骨分化,从基因及蛋白水平观察Col24α1在成骨细胞分化过程中的表达情况;构建Col24α1低表达慢病毒载体包装,滴度测定,细胞转染效率的验证;分别转染MC3T3-E1细胞,与空白组对照观察Col24α1沉默后碱性磷酸酶活性变化,细胞成骨矿化的影响。结果:Col24α1在成骨细胞在分化过程中表达随着矿化过程的进展而增加。使用慢病毒介导的RNA干扰(RNAi)技术,可以在MC3T3-E1成骨细胞中成功降低Col24α1表达,发现沉默Col24α1表达显著降低ALP活性和细胞矿化作用。结论:Col24α1可以调节成骨细胞的ALP活性和细胞矿化作用,其异常表达可能与骨骼病变相关。     

胶体金对MC3T3-E1增殖、分化及RUNX2基因表达的影响

目的研究30nm胶体金对小鼠成骨细胞系MC3T3-E1增殖、分化及成骨相关基因RUNX2表达的影响。方法体外培养小鼠成骨细胞MC3T3-E1,在仪-MEM培养液中加入不同体积的胶体金处理细胞,利用M1Tr法检测胶体金对成骨细胞增殖活性的影响,碱性磷酸酶活性测定及RT—PCR法分别检测其对成骨细胞分化及成骨相关基因RUNX2表达的影响。结果浓度为10^（-10）、10^（-11）、10^（-12）mg／L的胶体金均促进成骨细胞的增殖,且ALP相对活性及RUNX2基因表达也均高于阳性对照组。结论30nm胶体金能促进小鼠前成骨细胞系MC3T3-E1增殖、分化及成骨相关基因RUNX2的表达,进而促进成骨。     

持续阻断p44/42MAPK信号通路促进成骨前体细胞系MC3T3-E1分化

目的:探讨p44/42MAPK信号通路对成骨前体细胞系MC3T3-E1分化的调控作用。方法:应用MEK1激酶的特异性抑制剂PD98059持续阻断p44/42MAPK信号通路在成骨前体细胞系MC3T3-E1中的活化;通过组织化学染色试验观察成骨前体细胞碱性磷酸酶活性以及体外钙质沉积情况;半定量RT-PCR试验检测成骨前体细胞特异性基因 mRNA的表达;荧光素酶分析试验测定成骨前体细胞特异性转录因子CBFA1基因启动子的活性。结果:PD98059不仅提高MC3T3-E1细胞的碱性磷酸酶活性,同时促进成骨前体细胞体外钙沉积和成骨特异基因的表达。而且PD98059作用后成骨特异性转录因子CBFA1启动子的活性也显著提高。结论:持续阻断p44/42MAPK信号通路促进成骨前体细胞分化。     

多西环素通过MEK/ERK信号通路促进MC3T3-E1细胞株体外成骨分化

目的：研究在体外条件下多西环素（doxycycline,DOX）对前成骨细胞株MC3T3-E1成骨分化的影响及可能机制。方法：在成骨诱导剂体外诱导MC3T3-E1细胞株成骨分化条件下，茜素红染色检测成骨细胞分化；实时定量PCR检测DOX对MC3T3-E1细胞相关成骨基因OCN、Runx2的影响；用DOX、MEK抑制剂（U0126）单独或联合处理MC3T3-E1细胞后，Western blot检测N-cadherin、p-MEK及p-ERK等蛋白的表达。结果：在MC3T3-E1细胞株体外成骨诱导分化中，加入DOX可以增强茜素红染色阳性率。DOX上调MC3T3-E1细胞相关成骨基因OCN、Runx2的表达。DOX处理MC3T3-E1细胞后，其N-cadherin蛋白表达水平下降（P <0.05）,p-MEK和p-ERK蛋白的表达增加（P <0.05）。而MEK拮抗剂（U0126）则显著上调N-cadherin蛋白表达水平，同时降低p-MEK、p-ERK水平。用U0126联合DOX处理MC3T3-E1细胞后，DOX对N-cadherin、p-MEK和p-ERK蛋白水平的影响可被U...     

BMPER通过Wnt/β-catenin信号通路减轻高糖高脂对MC3T3-E1细胞成骨分化的抑制

目的：探究骨形态发生蛋白内皮细胞前体来源调节因子（BMPER）在成骨分化中的生物学作用。方法：将MC3T3-E1细胞分为对照（control）组、成骨诱导（OM）组和成骨诱导+高糖高脂（OM+HG/PA）组。采用Western印迹法检测各组细胞Runt相关转录因子2(Runx2)、Ⅰ型胶原α1(Col1α1)、BMPER的表达。将空载体对照质粒及BMPER过表达质粒转染到MC3T3-E1细胞中,将细胞分为p-NC和p-BMPER组。使用Western印迹法检测各组细胞BMPER、Runx2、Col1α1、Wnt1、Wnt3a、active β-catenin表达。碱性磷酸酶（ALP）染色检测BMPER对成骨分化的影响。应用非特异性siRNA及合成的靶向沉默BMPER小干扰RNA(siRNA)转染MC3T3-E1细胞,将细胞分为si-NC组及si-BMPER组,使用Western印迹法检测各组细胞Wnt1、Wnt3a、activeβ-catenin表达。结果：与OM组相比,OM+HG/PA组中Runx2、Col1α1、BMPER蛋白表达显著减少（t=7.572、8.568、10.742,...     

磷酸肌酸对小鼠前成骨细胞MC3T3-E1增殖、分化及矿化的影响

目的 探讨磷酸肌酸(phosphocreatine,PCr)对体外培养的小鼠前成骨细胞MC3T3-E1的增殖、成骨分化及矿化的影响.方法 在体外培养的MC3T3-E1细胞中,分别加入含不同浓度(5,10,20 mmol·L-1)的PCr进行培养,并以不给予PCr药物处理的组为空白对照组.采用MTT法检测MC3T3-E1细胞的增殖情况;使用碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性试剂盒检测MC3T3-E1细胞内ALP的活性;采用Western Blot法检测MC3T3-E1细胞内ALP、骨形态发生蛋白-2(bone morphogenetic protein-2,BMP-2)的蛋白表达情况;利用茜素红染色法检测MC3T3-E1细胞形成矿化的能力.结果 PCr可以促进MC3T3-E1细胞的增殖且具时间依赖性,当处理12 h时,PCr对细胞无明显促增殖作用(P＞0.05);然而当处理48 h时,PCr(5,10,20mmol·L-1)对细胞的促增殖作用可分别达到137％、146％、153％.PCr(10,20 mmol·L-1)使MC3T3-E1细胞内ALP的活性分别增加到空白对照组的1.37和2.14倍(P ＜0.05,P＜0.01),并且显著上调ALP蛋白表达(P＜0.01,P＜0.01).PCr(5,10,20 mmol·L-1)还可明显上调MC3T3-E1细胞内BMP-2的蛋白表达(P＜0.05,P＜0.01,P＜0.01),并使MC3T3-E1细胞形成的矿化结节数增加(P＜0.05,P＜0.01,P＜0.001).结论 PCr可以促进MC3T3-E1细胞的增殖、分化与矿化,具有促成骨作用.     

IL-17A对成骨细胞系MC3T3-E1细胞中明胶酶表达的影响及其作用机制

目的 检测IL-17A对MC3T3-E1细胞中明胶酶表达的影响,并探讨其作用机制。方法 采用小鼠重组细胞因子IL-17A作用于MC3T3-E1细胞,通过Real-time PCR和ELISA分别检测MMP-2及MMP-9在mRNA水平及蛋白水平上的表达情况;通过免疫荧光和Western Blot检测NF-κB的磷酸化水平的变化,并通过使用NF-κB阻断剂检测其在MMP-9表达中的影响。结果 IL-17A在mRNA水平及蛋白水平上均上调MMP-9的表达(P＜0.01),然而对MMP-2的表达无明显影响;IL-17A促进转录因子NF-κB的磷酸化水平(P＜0.01);阻断NFκB的活性可减弱IL-17A对MMP-9的上调作用(P＜0.05);IL-17A对MC3T3-E1细胞中TIMP-1及TIMP-2的表达没有影响。结论 IL-17A可以通过激活NF-κB促进MC3T3-E1细胞分泌MMP-9。     

聚乙烯亚胺介导miR-2861模拟物转染MC3T3-E1细胞的体外成骨分化

目的：通过非病毒载体聚乙烯亚胺（PEI）介导miRNA-2861（miR-2861）模拟物转染MC3T3-E1细胞系,探讨miR-2861/PEI复合物在前成骨细胞中的转染效率及其对细胞增殖和成骨向分化的影响。方法：将适量的PEI分别与miR-2861和阴性对照（NC）以元素N/P=10的比例混合形成基因/载体复合物。将miR-2861/PEI复合物作为实验组,NC/PEI复合物作为阴性对照组以排除人工合成的双链基因对成骨作用的干扰。采用MTT法筛选PEI复合miR-2861模拟物的最佳使用浓度;应用荧光成像和茎环法RT-PCR技术分别检测10、30、50和100 nmol·L^-1 miR/PEI复合物对MC3T3细胞的瞬时转染效率和miR-2861的表达情况;采用qRT-PCR技术和茜素红染色检测用选定浓度瞬时转染miR-2861/PEI复合物作用下MC3T3细胞的成骨能力。结果：与空白对照组比较,100 nmol·L^-1 miR-2861/PEI复合物作用72h时MC3T3细胞增殖率明显下降（P<0.05）。随转染浓度增加,miR-2861/PEI复合物在MC3T3细胞中的转染效率逐渐升高。茜素红染色及定量分析,实验组诱导21 d后出现较多的钙盐沉积结节,而空白对照组和阴性对照组均较少。结论：以PEI作为载体可使miR-2861模拟物有效转染MC3T3-E1细胞并在细胞中高表达,miR-2861模拟物具有一定的促MC3T3-E1细胞成骨向分化的作用。     

miRNA expression profile during fluid shear stress-induced osteogenic differentiation in MC3T3-E1 cells

Background Mechanical stress plays an important role in the maintenance of bone homeostasis.Current hypotheses suggest that interstitial fluid flow is an important component of the system by which tissue level strains are amplified in bone.This study aimed to test the hypothesis that the short-term and appropriate fluid shear stress (FSS) is expected to promote the terminal differentiation of pre-osteoblasts and detect the expression profile of microRNAs in the FSS-induced osteogenic differentiation in MC3T3-E1 cells.Methods MC3T3-E1 cells were subjected to 1 hour of FSS at 12 dyn/cm2 using a parallel plate flow system.After FSS treatment,cytoskeleton immunohistochemical staining and microRNAs (miRNAs) were detected immediately.Osteogenic gene expression and immunohistochemical staining for collagen type Ⅰ were tested at the 24th hour after treatment,alkaline phosphatase (ALP) activity assay was performed at 24th,48th,and 72th hours after FSS treatment,and Alizarin Red Staining was checked at day 12.Results One hour of FSS at 12 dyn/cm2 induced actin stress fiber formation and rearrangement,up-regulated osteogenic gene expression,increased ALP activity,promoted synthesis and secretion of type Ⅰ collagen,enhanced nodule formation,and promoted terminal differentiation in MC3T3-E1 cells.During osteogenic differentiation,expression levels of miR-20a,-21,-19b,-34a,-34c,-140,and-200b in FSS-induced cells were significantly down-regulated.Conclusion The short-term and appropriate FSS is sufficient to promote terminal differentiation of pre-osteoblasts and a group of miRNAs may be invovled in FSS-induced pre-osteoblast differentiation.     

含枸杞多糖血清对MC3T3-E1成骨细胞增殖、分化和矿化的影响

目的研究含枸杞多糖血清对MC3T3-E1成骨细胞细胞增殖、分化和矿化的影响。方法含枸杞多糖血清分别加入MC3T3-E1成骨细胞培养液中,使其终浓度为5%、10%、20%3种体积浓度,通过MTT法,碱性磷酸酶活性测定,骨钙素检测和Von kossa矿化染色法观察含枸杞多糖血清的促细胞增殖、分化、矿化作用。结果含枸杞多糖血清在5%、10%浓度促进MC3T3-E1成骨细胞增殖,差异有统计学意义(P<0.05);10%、20%浓度提高MC3T3-E1成骨细胞内碱性磷酸酶的活性,差异有统计学意义(P<0.01)。含枸杞多糖血清在20%浓度培养7及11 d时能明显促进MC3T3-E1成骨细胞骨钙素合成和分泌,20%浓度培养18 d时MC3T3-E1成骨细胞的矿化结节数目增多,差异有统计学意义(P<0.01)。结论含枸杞多糖血清可以促进MC3T3-E1成骨细胞增殖、分化和矿化能力。