Gemin3抑制p53介导的细胞凋亡

目的 探讨Gemin3基因表达在细胞增殖中的作用及其途径.方法 采用免疫共沉淀、谷胱苷肽-S转移酶共沉淀实验确定Gemin3与p53两种蛋白在体内、体外相互结合及相互作用的结构域.荧光素酶报告基因检测转染Gemin3基因对p53基因的影响,依靠慢病毒载体介导发卡RNA干涉敲减Gemin3基因的表达并经嘌呤霉素筛选获得稳定的Gemin3低表达细胞系,实时PCR检测Gemin3敲减对p53及其下游基因在转录水平的影响,流式细胞检测Gemin3敲减对细胞增殖的影响.结果 Gemin3的C端与p53的中部DNA结合部位相互结合,Gemin3在转录水平抑制p53基因的表达,敲减Gemin3基因的表达导致细胞凋亡的增加. 结论 Gemin3与p53相互结合并通过抑制p53的表达促进细胞的增殖.     

鼻咽癌血清中EB病毒核抗原-1和核抗原-2抗体的研究

用抗补体免疫荧光法检测鼻咽癌患者和对照人群中EB病毒核抗原-1(EBNA-1)和EB病毒核抗原-2(EBNA-2)抗体的水平。鼻咽癌组中两种抗体滴度都升高,以EBNA-1抗体上升明显;且EBNA-1抗体与总EBNA抗体水平的变化趋势相一致。鼻咽增生性病变组中EBNA-2抗体略占优势,该组中EBNA-2抗体水平升高可能与潜伏状态的EB病毒激活或再感染的早期阶段有关。     

抗EB病毒口服液对EB病毒抗原表达的抑制作用及其细胞毒作用

目的 观察抗EB(Epstein-Barr)病毒口服液对EB病毒抗原表达的影响及对鼻咽癌CNE2细胞的细胞毒作用。方法 用间接荧光法测定抗EB病毒口服液对Raji细胞早期抗原(early antigen，EA)表达及B95-8细胞病毒壳抗原(virus capsid antigen，VCA)表达的影响；用MTT法测定其对鼻咽癌CNE2细胞的细胞毒作用。结果 抗EB病毒口服液在无毒的浓度下，对Raji细胞EB病毒EA抗原表达有较强的抑制作用，其IC50值为0．667mg／mL：对B95-8细胞EB病毒VCA抗原表达有较强的抑制作用。其IC50值为0．89mg／mL；对正丁酸钠激发的B95-8细胞EB病毒VCA抗原表达亦有较强的抑制作用，其IC50为1．1mg/mL。抗EB病毒口服液对人鼻咽癌细胞CNE2的IC50为7．57mg／mL。结论 抗EB病毒口服液能抑制EB病毒抗原的表达,在较高的浓度下对鼻咽癌细胞CNE2具细胞毒作用。     

EB病毒潜伏抗原功能的研究

EB病毒是由Epstein于1964年从1例Burkitt淋巴瘤患者的B细胞培养物中首先发现。自从被发现以来，EB病毒已被证实与多种淋巴系统有关，包括Burkitt淋巴瘤、何杰金病，某些种类的T细胞淋巴瘤和在器官移植或AIDS患者中，由于免疫功能受损而导致的B淋巴细胞增殖性病变。此外，所有鼻咽癌和10％胃癌的发生也与此病毒有关。     

EB病毒核抗原1优势表位区段抗原的克隆表达及其在鼻咽癌诊断中的应用

目的制备高活性EB病毒核抗原1(Epstein-Barr virus nuclear antigen 1, EBNA1)的优势表位区段抗原,并初步评价该抗原在鼻咽癌诊断中的应用价值。方法利用生物学软件BIOSUN分析EBNA1抗原的B细胞表位分布,并从中选取含有优势表位的抗原区段。然后利用分子生物学技术构建含有优势表位区段序列的原核表达质粒并进行表达,获得纯化优势表位抗原,采用间接酶联免疫吸附试验(ELISA)初步评价优势表位区段抗原的检测性能。结果成功构建含有优势表位抗原区段序列的原核表达质粒,获得了可溶性表达的EBNA1优势表位区段抗原NA-2(401~641 aa)。通过间接ELISA法对小量样本进行验证,确定NA-2抗原针对EBNA1-IgA抗体具有较高的抗原活性和特异性,较EBNA1-IgG和EBNA1-IgM抗体而言,能够较好地区分鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma, NPC)和健康对照样本。放大样本量进行检测,基于NA-2抗原的EBNA1-IgA抗体间接ELISA方法检测灵敏度和特异性分别为90.38%和91.58%,EBNA1-IgA抗体检测的AUC值为0.942。结论获得EBNA1优势表位区段抗原NA-2,该抗原是优选的可以用于EBNA1-IgA检测的抗原,利用该抗原所建立的间接ELISA检测方法可以很好地区分鼻咽癌患者和健康对照。     

带EB病毒膜抗原基因痘苗病毒的构建和表达

以痘苗病毒天坛株为载体,构建表达EB病毒膜抗原的重组痘苗病毒株。在重组病毒的感染细胞膜上表达病毒的膜抗原。该抗原免疫家兔能产生抗体。     

EB病毒BARF1基因真核表达载体的构建

①目的 构建携带EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)编码BARF1基因的真核表达载体.②方法 根据GenBan提供的BARF1基因的cDNA序列,设计特异性引物,并在两端添加酶切位点;常规培养B95-8细胞,提取细胞RNA,通过RT-PCR扩增BARF1基因,将其克隆到pUM-T载体,转化E.coli DH5α,经氨苄青霉素抗性筛选阳性克隆,提取质粒并用EcoRI和XbaI双酶切与测序鉴定,证实BARF1基因已克隆到pUM-T载体.凝胶回收双酶切产物BARF1片段,再将其连接到真核表达载体pcDNA3.1(+)-his,转化E.coli DH5α,通过氨苄青霉素抗性筛选阳性克隆,提取质粒并用EcoRI和XbaI双酶切分析,确认插入方向.③结果 以B95-8细胞提取RNA进行RT-PCR扩增的cDNA为模板扩增BARF1,得到与预期片段大小相符的666bp的片段;对所提质粒进行鉴定后,证实目的 基因BARF1片段已插入pUM-T载体,经双酶切和测序分析,确认BARF1基因已正确连接到pcDNA3.1(+)-his真核表达载体.④结论 成功地构建真核表达载体.pcDNA3.1(+)/BARF1-his.     

EB病毒壳抗原在大肠杆菌中的表达及纯化

本文报告对EB病毒壳抗原(VCA)带有抗原决定簇的蛋白质在大肠杆菌中的表达及其纯化。以纯化后的蛋白为抗原检测人血清中VCA/IgA抗体,鼻咽癌病人及某些急性EB病毒感染人群呈抗体阳性.而对照组呈阴性。这一结果提示VCA蛋白在鼻咽癌的普查中有应用价值。     

EB病毒核抗原-1特异性核酶对成淋巴细胞系肿瘤形成能力的影响

目的 探讨腺病毒载体介导的ＥＢ病毒核抗原－１（ＥＢＮＡ－１）特异性核酶对成淋巴细胞系（ＬＣＬｓ）在严重的联合免疫缺陷（ＳＣＩＤ）小鼠体内致瘤性的影响,方法 用分子克隆技术构建ＥＢＮＡ－１核酶（ＲＺ１）及其无活性诱变体（ＲＺ１ ｍｕｔ）的重组腺病毒表达载体（Ａｄ．ＲＺ１和Ａｄ．ＲＺ１ｍｕｔ）。通过同源重组方式在２９３细胞生成腺病毒,并通过噬斑形成进行分离建立ＬＣＬ。将感染重组腺病毒的ＬＣＬ细胞注射于     

EB病毒膜抗原BLLF1基因在转基因小鼠中的表达

目的:分析EB病毒膜抗原(membrane antigen, MA)BLLF1基因在转基因小鼠外周血淋巴细胞中的表达.方法:EB病毒膜抗原BLLF1基因转基因首建鼠4只,尾组织经PCR检测携带有BLLF1基因,用流式细胞仪分析MA在外周血淋巴细胞中的表达并用激光共焦显微镜确定MA在细胞中的表达部位.结果:4只首建鼠中有2只KM-Tg-EBV1和KM-Tg-EBV5外周血淋巴细胞中有MA的表达,表达部位在细胞浆中和细胞膜上.结论:表达EB病毒膜抗原的转基因小鼠可作为研究EB病毒致病机制的一个新的动物模型.     

EBNA3C combines with Gemin3 and up-regulates its expression

Objective To investigate the combination of Epstein-Barr virus nuclear protein 3C (EBNA3C) with Gemin3 and its effect on Gemin3 expression.Methods Co-immunoprecipitation,GST pull-down and immunofluores...     

Survivin在胃癌组织中的表达及其与caspase-3、p53基因表达相关性的初步研究

目的　研究Survivin在胃癌组织中的表达及其与caspase 3、p5 3基因表达的相关性。方法　收集 32例胃癌组织标本及相应的癌旁组织 ,利用免疫组织化学法检测Survivin、caspase 3、p5 3基因的表达。结果　 6 2 5 % (2 0例 )的胃癌组织表达Survivin蛋白 ,而癌旁组织内无阳性表达。Survivin表达与胃癌组织的大小、分化程度、临床分期及淋巴结转移无明显相关关系。Caspase 3、p5 3蛋白与Survivin表达显著相关。结论　Survivin在胃癌组织中选择性表达 ,提示该基因在胃癌的发生发展中起重要作用。Caspase 3的失表达、p5 3的突变与Survivin基因的表达可能在胃癌发生中起协同作用。     

人神经营养素-3成熟区基因在大肠杆菌内的表达

【目的】应用基因工程方法制备人神经营养素 3(hNT 3)蛋白 ,为探讨其对阿尔茨海默病等中枢神经退行性疾病的治疗作用提供材料。【方法】将通过序列分析确定的hNT 3成熟区基因重组至原核表达质粒pBV2 2 0中 ,构建了重组表达载体 pBV/mhNT 3 ,在大肠杆菌中表达后 ,SDS PAGE法测定表达蛋白的相对分子质量 ,鸡胚背根节培养法检测其生物学活性。【结果】pBV/mhNT 3可在大肠杆菌中表达出一相对分子质量为 15× 10 3 的新蛋白 ,与hNT 3蛋白相对分子量相符。表达蛋白主要以包涵体形式存在 ,经纯化复性后 ,可明显促进鸡胚背根节的生长。【结论】人神经营养素 3成熟区基因可在大肠杆菌内高效表达hNT 3。     

人神经营养因子-3基因在大肠杆菌中的克隆和表达

目的 :获得人神经营养因子 - 3 (hNT - 3 )在大肠杆菌中的克隆并表达。方法 :采用PCR方法从 2 0周人胎脑cDNA文库中扩增hNT - 3基因 ,通过双酶切法在M 13mp18载体上克隆获得全长基因 ,将正确全长基因插入PBV2 2 0载体 ,通过选择合适宿主菌获得hNT - 3的高效表达。结果 :获得全长基因完全正确的hNT - 3基因 ,获得占细菌总蛋白 3 0 %的hNT - 3表达菌株。结论 :本研究获得了序列正确的hNT - 3基因克隆 ,并实现了在大肠杆菌中的高效表达。     

先天性巨结肠患者SEMA3C/SEMA3D基因错义突变对Semaphorin3蛋白表达的影响

目的明确先天性巨结肠患者携带的5个SEMA3C/SEMA3D基因错义突变对Semaphporin 3蛋白表达的影响作用。方法将野生型和突变型AP-tagged SEMA3质粒分别转染HEK293T细胞,72h后收集细胞培养液上清并提取细胞总蛋白,利用融合蛋白N-末端含有的碱性磷酸酶在底物PNPP存在时可以发生颜色变化的特性,通过对各野生型和突变型质粒转染后所表达的AP-SEMA3蛋白在特定波长的吸光值进行检测以达到蛋白定量的目的。结果 5个错义突变中的4个(SEMA3C:V337M;SEMA3D:H424Q、V457I、P615T)都会不同程度地影响相应Semaphorin 3蛋白的表达和分泌,说明它们可能通过严重影响蛋白的表达量而妨碍蛋白功能的正常行使。结论 Semaphorin 3作为一类经典的神经元轴突导向因子,很可能参与了肠神经系统的发育调控并在功能失常的情况下引发先天性巨结肠缺陷表型。     

EBNA2基因真核表达载体的构建及表达产物的功能

目的: 构建EB病毒核心抗原2(EBNA2)的真核表达载体,在真核细胞中表达,并检测其表达产物的功能.方法: 应用DNA重组和PCR方法从质粒pSG5-EBNA2中亚克隆EBNA2的编码基因,插入到真核表达载体pCMV-HA中.应用脂质体的方法将重组质粒pCMV-EBNA2瞬时转染Cos-7细胞,通过Western blot和免疫荧光方法检测EBNA2的表达.应用荧光素酶报告实验检测EBNA2蛋白的活性.结果:克隆EBNA2的编码基因,经序列分析证实与GenBank中的序列完全一致.以含有EBNA2编码基因的真核表达载体瞬时转染Cos-7细胞,EBNA2基因的表达产物通过Western blot和免疫荧光方法得到证实.荧光素酶报告实验显示所表达的蛋白具有转录激活活性.结论:成功构建EBNA2的真核表达载体,证实其在真核细胞Cos-7可以表达,并具有转录激活功能.     

CsA对移植肾受者淋巴细胞免疫相关基因的调控

目的研究环孢素A（CsA）作用后，移植肾受者淋巴细胞免疫相关基因表达的变化。方法分离移植肾受者在药物作用前后24h外周血淋巴细胞，将它们总RNA分别逆转录并同基因芯片杂交，通过生物信息学方法比较分析。结果CsA作用24h后，7个基因显著下调。结论CsA通过以上一系列靶基因发挥药理作用，这为临床治疗提供了新的依据。     

胃蛋白酶C基因在大鼠胃底腺发育过程中上皮细胞内的表达

目的：研究胃蛋白酶原基因C在大鼠胃底腺发育过程中上皮细胞的表达。方法：采用地高辛标记的RNA探针，用原位杂交的方法研究了大鼠胃底腺中胃蛋白酶C产生细胞的个体发育。结果：大鼠胃腺在胚胎18．5天开始出现，但没有形态分化，胃蛋白酶的mRNA在出生后3．5天首次被原位杂交法检出，其蛋白酶产生细胞在出生后8周发育成熟．胃蛋白酶的mRNA表达在主细胞和颈黏液细胞内，其发育可分为4个阶段：①胚胎18．5天至出生后0．5天；②出生后3．5天至2周；③生后3周至4周；④出生后8周。在胃底腺发育过程中，胃蛋白酶mRNA的表达至局限于某种特定的细胞，这些细胞的分布具有明确的阶段特异性。结论：认为在发育生物学的研究中，胃蛋白酶C可作为胃上皮细胞分化的分子标志。     

分子佐剂小鼠补体C3d基因的克隆与序列分析

目的 构建C3d的真核表达质粒，以期将其作为分子佐剂，提高核酸疫苗的免疫效能。方法 采用PCR技术扩增小鼠补体C3d基因（897bp)，并将其克隆至pGEM-T 载体上；经鉴定其DNA序列正确；再将其亚克隆至真核表达载体pVAX1上。结果 经DNA测序证实了该克隆片段为小鼠补体C3dA基因，可进一步用于基因表达和基因治疗的研究。结论 构建了C3d真核表达质粒，为高效核酸疫苗的研究打下了良好的基础。