姜黄素抑制ECV304细胞增殖及对基质金属蛋白酶2表达的影响

目的:探讨姜黄素对人脐静脉内皮细胞(ECV304)的作用以及对ECV304表达的基质金属蛋白酶2(MMP-2)的影响。方法:采用MTT法,台盼蓝染色法测定姜黄素对ECV304的量效关系和时效关系,Giemsa染色观察姜黄素对ECV304的抑制作用;通过RT-PCR检测姜黄素作用ECV304后MMP-2 mRNA表达,明胶酶谱法检测MMP-2的活性,免疫组化检测细胞MMP-2表达。结果:姜黄素对ECV304的抑制作用呈浓度依赖性和时间依赖性,Giemsa染色显示浓度为8μg/mL和10μg/mL的姜黄素可诱导ECV304凋亡,凋亡率分别是21.6%和34.7%;在10μg/mL姜黄素作用24 h下,MMP-2的mRNA显著减少,其分解明胶的活性也显著降低,免疫组化显示与阴性对照组相比内皮细胞MMP-2表达减少。结论:姜黄素能够抑制血管内皮细胞的生长、降低血管内皮细胞MMP-2的表达。     

β-榄香烯对血管内皮细胞功能紊乱和血管平滑肌细胞异常增殖的影响

研究β-榄香烯是否能改善低剪切力（LSS）诱导的血管内皮细胞功能紊乱和氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）诱导的血管平滑肌细胞增殖和迁移。分别采用平行板流动腔和ox-LDL建立血管内皮细胞（ECs）功能紊乱模型和血管平滑肌细胞（VSMCs）增殖和迁移模型,并检测β-榄香烯对ECs功能紊乱和VSMCs增殖迁移的影响。DHE法检测ECs中ROS的活性,DAF-FM DA法检测ECs中NO的活性。Western blot法检测ECs中Akt和ERK的蛋白磷酸化水平。MTT法检测VSMCs的增殖。细胞划痕实验和Transwell实验检测VSMCs的迁移。RT-qPCR法检测VSMCs中MMP-2和MMP-9的基因表达。在ECs中,β-榄香烯可以显著降低LSS诱导的ROS的升高,显著升高LSS诱导的NO的降低,并且降低ERK的磷酸化,并升高Akt的磷酸化。在VSMCs中,β-榄香烯可以显著降低ox-LDL诱导的VSMCs的增殖和迁移,降低MMP-2和MMP-9的基因表达。β-榄香烯可以改善LSS诱导的ECs功能紊乱和ox-LDL诱导的VSMCs增殖和迁移。     

肿瘤基质血管内皮细胞血管形成能力研究

目的:探讨肿瘤基质血管内皮细胞的血管形成能力.方法:对卵巢癌细胞SKOV3培养上清液诱导人内皮细胞ECV304获得能稳定生长的ECV304-SKOV3细胞,用免疫细胞化学测定其血管形成因子的表达、PT-PCR测定其端粒酶活性、双室联合培养测定其游走能力与管腔形成能力,并分析其蛋白质合成能力、粘贴能力.并与亲代细胞ECV304比较.结果:ECV304-SKOV3细胞蛋白质合成能力、端粒酶活性强于亲代细胞ECV304(P＜0.001),但粘贴能力减弱(P＜0.001).表达bcl-2、基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase 9,MMP-9)增强(P＜0.05),而粘合素(tenascin,TN)减弱(P＜0.05).ECV304-SKOV3细胞较ECV304细胞的游走能力强2.10倍,差异非常显著(P＜0.001),管腔形成能力也明显增强,平均每视野管腔数分别为(12.4±1.517)条和(6.4±0.894)条(P＜0.01),管腔长分别为(262.17±49.52)μm和(137.34±18.69)μm(P＜0.01).结论:肿瘤基质血管内皮细胞存活能力增强,表达多种细胞因子与血管形成因子增强,相应地游走能力与管腔形成能力明显增强.     

蜂毒素体外抑制内皮细胞血管生成及其作用机制

目的:探讨蜂毒素对人脐静脉来源内皮细胞(ECV304)血管生成的抑制作用及其机制.方法:体外培养ECV304细胞,分别测定蜂毒素对其增殖、迁移及形成管状结构的影响.采用酶联免疫吸附法检测血管内皮细胞生长因子(VEGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的含量.应用实时荧光定量PCR方法检测ECV304细胞VEGF mRNA和bFGF mRNA的表达.结果:经蜂毒素作用后,ECV304细胞的增殖明显受到抑制,24,48,72 h的IC50分别为5.11,4.68,4.40 mg/L.蜂毒素低、中、高浓度组和沙利度胺(TLD)组ECV304细胞迁移数目(19.44±6.54),(11.17±2.85),(4.22±1.83)和(18.28±5.29)个,明显低于空白对照组(42.33±9.63 )个(P＜0.01).蜂毒素低、中、高浓度组及TLD组形成管状结构的面积分别为 (5947.22±973.72),(1558.33±281.06),(705.85±318.01)和(2928.92±735.67) μm2/视野,均低于空白对照组(7828.94±1202.54) μm2/视野(P＜0.01).经蜂毒素处理后,ECV304细胞分泌VEGF及bFGF的功能明显下降.荧光定量PCR证实,蜂毒素可降低ECV304细胞VEGF mRNA和bFGF mRN的表达.结论:体外实验结果表明,蜂毒素具有抑制ECV304细胞血管生成的作用,这种效应与血管内皮细胞VEGF和bFGF的活性降低及其合成受到抑制有关.     

β-榄香烯对肿瘤细胞上清夜诱导的大鼠骨髓来源的内皮祖细胞增殖、管腔形成能力及细胞周期的影响

目的探讨β-榄香烯对内皮祖细胞(EPCs)参与肿瘤血管形成的抑制作用。方法原代培养大鼠骨髓来源内皮祖细胞,胃癌细胞株SGC-7901培养上清液刺激与β-榄香烯干预,四唑氮蓝还原反应(MTT)法检测内皮祖细胞增殖;碘化丙啶(PI)标记流式细胞仪检测细胞周期,Matrigel检测细胞管腔形成能力。结果β-榄香烯抑制肿瘤细胞上清液诱导的内皮祖细胞的增殖,并呈剂量和时间依赖性。细胞周期检测结果显示,β-榄香烯干预后,G1期细胞增多,进入S期及G2期细胞减少,细胞周期被阻滞于G1期;接种于Matrigel的内皮祖细胞形成管腔数目减少。结论β-榄香烯可抑制内皮祖细胞的增殖,阻滞其从G1期进入S期,并降低其形成管腔的能力。     

腺病毒介导的Vasostatin基因对血管内皮细胞的作用

目的研究腺病毒介导的Vasostatin基因对体外培养的血管内皮细胞增殖及凋亡的作用.方法采用MTT法观察Vasostatin基因对人脐静脉血管内皮细胞ECV304的体外细胞增殖的影响.采用透射电镜、TUNEL与Hoechst33258双重荧光染色、流式细胞仪AnnexinV/PI双染法,检测腺病毒介导的Vasostatin基因作用后人脐静脉血管内皮细胞的凋亡.结果Ad-Vasostatin(MOI分别为25和50)作用72 h后,ECV304细胞数显著少于PBS组和Ad-lacZ组(P＜0.05);透射电镜下及TUNEL/Hoechst33258双重荧光染色,ECV304细胞出现典型的凋亡形态学改变.以MOI为50的Ad-Vasostatin处理ECV304细胞72 h后,细胞凋亡率为(15.70±0.84)%,PBS组为(2.54±0.83)%,Ad-lacZ组为(2.34±0.79)%,三组比较均有显著性差异(P＜0.01).结论腺病毒介导的Vasostatin基因可显著抑制人脐静脉血管内皮细胞ECV304的体外细胞增殖,同时对人脐静脉血管内皮细胞的凋亡具有诱导作用.     

不同浓度醛固酮对血管平滑肌细胞MMP-2活性的影响

目的 高血压可促使血管平滑肌细胞增殖进而引起血管重构.近年来研究表明,醛固酮在血管重构中有重要作用.但其具体作用机制尚不十分清楚.因此我们将观察不同浓度醛固酮对血管平滑肌细胞增殖以及基质金属蛋白酶MMPs活性的影响.方法 采用原代分离培养血管平滑肌细胞,用CCK8法检测不同浓度醛固酮对细胞增殖的影响;进一步用明胶酶谱法观察不同浓度醛固酮对MMPs活性的作用.结果 不同浓度醛固酮并不影响血管平滑肌细胞的增殖,但却浓度依赖的抑制MMP-2的活性.结论 醛固酮可能通过抑制血管平滑肌细胞增殖和促进MMP-2活性而参与血管重构.     

腺病毒介导的Vasostatin基因对血管内皮细胞的作用

目的研究腺病毒介导的Vasostatin基因对体外培养的血管内皮细胞增殖及凋亡的作用。方法采用MTT法观察Vasostatin基因对人脐静脉血管内皮细胞ECV304的体外细胞增殖的影响。采用透射电镜、TUNEL与Hoechst33258双重荧光染色、流式细胞仪AnnexinV/PI双染法,检测腺病毒介导的Vasostatin基因作用后人脐静脉血管内皮细胞的凋亡。结果Ad-Vasostatin(MO I分别为25和50)作用72 h后,ECV304细胞数显著少于PBS组和Ad-lacZ组(P<0.05);透射电镜下及TUNEL/Hoechst33258双重荧光染色,ECV304细胞出现典型的凋亡形态学改变。以MO I为50的Ad-Vasostatin处理ECV304细胞72 h后,细胞凋亡率为(15.70±0.84)%,PBS组为(2.54±0.83)%,Ad-lacZ组为(2.34±0.79)%,三组比较均有显著性差异(P<0.01)。结论腺病毒介导的Vasostatin基因可显著抑制人脐静脉血管内皮细胞ECV304的体外细胞增殖,同时对人脐静脉血管内皮细胞的凋亡具有诱导作用。     

重组人可溶性血管内皮细胞生长抑制因子体外抗血管内皮细胞增殖的活性

目的：研究重组人可溶性血管内皮细胞生长抑制因子（VEGI）体外抗血管内皮细胞增殖的活性。方法：MTT法检测重组人可溶性VEGI对血管内皮细胞及肿瘤细胞增殖的抑制活性。结果：在体外,重组人可溶性BEGI可强烈抑制人脐静脉内皮细胞ECV304、大鼠肺源毛细血管内皮细胞（MPCEC）及新生牛主动脉内皮细胞（BAEC）的增殖,不能报制黑色素瘤细胞B－16和小鼠成纤维细胞L－929的增殖。结论：重组人可溶性VEGI能作用于不同来源的血管内皮细胞,而对肿瘤细胞增殖无抑制作用,提示其可能通过抗肿瘤新生血管生成而发挥抗肿瘤作用。     

心肌成纤维细胞诱导体外血管新生的实验研究

目的探讨心肌成纤维细胞在血管新生中的作用。方法分离培养乳鼠心肌成纤维细胞(cardiac fibroblasts,CF),并收集其条件培养液(cardiacfibroblastconditionedmedium,CF CM)作为ECV304[人脐静脉内皮细胞株(humanumbilicalveinendothelialcellstrain)]细胞的培养液,用3H TdR掺入法检测CF CM对ECV304细胞增殖活性的影响;采用体外血管新生三维模型,检测其是否能诱导ECV304细胞向凝胶内侵入。结果乳鼠心肌成纤维细胞的条件培养液明显促进ECV304细胞增殖(P<0.01),诱导ECV304细胞向凝胶内侵入迁移生长,形成树枝样发芽结构。结论心肌成纤维细胞的条件培养液可促进ECV304细胞增殖和迁移,即有促血管新生作用。     

Celebrex对VEGF诱导的内皮细胞迁移的影响及其机制

目的:观察选择性环氧化酶-2(COX-2)抑制剂celebrex对血管内皮生长因子(VEGF)诱导的内皮细胞细胞迁移能力的影响及其与细胞内MMP-9表达的关系。方法:体外培养内皮细胞系ECV304,将细胞分为4组:①空白对照组(ECV304);②VEGF组(ECV304+VEGF);③celebrex+VEGF组(ECV304+VEGF+cele-brex);④celebrex组(ECV304+celebrex)。观察:①用损伤修复实验观察不同浓度celebrex对ECV304细胞迁移能力影响及对VEGF诱导下ECV304细胞迁移速度影响;②用半定量RT-PCR法检测VEGF及celebrex对ECV304细胞MMP-9 mRNA表达的影响。结果:ECV304细胞的迁移速度随VEGF浓度(0.02,0.2,2μmol/L)的增加呈降低趋势;celebrex+VEGF组(2μmol/L celebrex+5μg/L VEGF)迁移速度为(3.55±0.02)μm/h与VEGF组(5μg/L VEGF)迁移速度(7.66±0.02)μm/h比较,两者有显著差异(P<0.01);celebrex+VEGF组(2μmol/L celebrex+5μg/L VEGF)的MMP-9表达量明显低于VEGF组(5μg/L VEGF)。结论:celebrex能抑制VEGF诱导的ECV304细胞迁移,并使COX-2下游的MMP-9表达量显著下调,这是可能的机制之一。     

重组腺病毒介导hCGPx转染致血管内皮细胞产生抗氧化损伤作用的研究

目的 研究重组腺病毒介导的人胞浆型谷胱甘肽过氧化物酶（hCGPx）转染对血管内皮细胞ECV304氧化损伤保护作用。方法 将含hCGPx cDNA的质粒pGEM-T-hCGPx和重组腺病毒载体pACCMV-pLpA穿梭质粒进行基因重组,构建成pACCMV-hCGPx穿梭质粒后,与包装质粒pJM17共转染293细胞,构建成重组腺病毒AdCMV-hCGPx。用AdCMV—hCGPx转染体外培养的ECV304细胞并分为转染24、48和72h组,以转染空载体的细胞为对照组,检测转染细胞的基因表达水平。各组ECV304细胞经H2O2氧化损伤处理后,分别对细胞的活力和凋亡进行检测分析。结果 各转染组细胞转染基因表达率均显著高于对照组（P〈0．01）。经H2O2氧化损伤处理后,AdCMV-hCGPx转染组细胞活力较对照组明显增强,凋亡受到抑制。结论 重组腺病毒介导的hCGPx转染可保护ECV304细胞抵抗氧化损伤,具有明确的细胞保护作用,其具体保护机制可能与抗氧化和抑制细胞凋亡有关。     

三氧化二砷抗肝癌血管新生作用

目的:探讨三氧化二砷(As2O3)注射液抗肝癌血管新生的作用及其相关机制。方法:采用MTT法、透射电镜观察、免疫组化、鸡胚尿囊膜(CAM)血管形成实验等方法,观察As2O3注射液对人肝癌细胞株SMMC-7721和人脐静脉内皮细胞ECV304生长、超微结构、血管内皮生长因子(VEGF)和表皮生长因子受体(EGFR)蛋白表达以及对CAM血管形成的影响。结果:As2O3能显著抑制人肝癌细胞SMMC-7721和人脐静脉内皮细胞ECV304生长,用药后诱导其出现了典型的细胞凋亡超微结构改变;As2O3对SMMC-7721细胞和ECV304细胞VEGF、EGFR的表达均有抑制作用;As2O3能抑制CAM血管形成。结论:As2O3注射液具有显著抗肝癌血管新生作用,其机制与抑制血管内皮细胞生长、诱导血管内皮细胞凋亡、调控肿瘤血管新生相关因子VEGF和EGFR的表达密切相关。     

腺病毒介导的生长抑制基因4对ECV304细胞体外生长及分泌血管内皮生长因子的影响

目的: 检测腺病毒介导的生长抑制基因4(adenovirus-mediated inhibitor of growth family member 4,Ad-ING4)感染后ECV304细胞体外生长及分泌血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的影响,探讨ING4抑制肿瘤生长的可能机制。方法: 构建ING4腺病毒载体,用MTT法检测Ad-ING4感染后ECV304细胞体外生长影响,ELISA检测VEGF的分泌情况。结果: Ad-ING4感染后第3天和第4天ECV304细胞体外生长均受到抑制(P < 0.01),第4天时抑制率达63.6%,VEGF分泌受到抑制。结论: ING4能抑制ECV304细胞生长及VEGF分泌。Ad-ING4能抑制血管内皮细胞生长和血管的生成,从而可抑制体内肿瘤的生长。     

alphastatin抑制体外内皮细胞血管生成及其作用机制的实验研究

目的探讨人纤维蛋白原α链末端的24个氨基酸片断alphastatin对人脐静脉来源内皮细胞(ECV304)血管生成抑制作用及机理。方法体外培养ECV304细胞,分别测定alphastatin对其迁移、增殖和体外管状结构形成的作用。用逆转录聚合酶链反应技术(RT-PCR)定性检测ECV304细胞中鞘氨醇激酶(SPK)mRNA的表达。分别以10、100、1000nmol/Lalphastatin处理ECV304细胞,提取细胞蛋白质,通过三磷酸腺苷(ATP)检测细胞SPK酶活性。结果不同浓度alphastatin处理组中ECV304细胞迁移的数目,分别为(103±4)个、(75±3)个、(13±1)个,低于对照组的(131±4)个,均P<0·05。alphastatin浓度为100nmol/L、1000nmol/L时,形成管状结构的面积分别为(1509±30)μm2/视野和(1301±20)μm2/视野,也明显低于对照组的(2996±31)μm2/视野,均P<0·05。alphastatin对ECV304细胞增殖的影响差异无统计学意义。RT-PCR证实ECV304细胞SPKmRNA的表达。与对照组比较,alphastatin降低ECV304细胞内1-磷酸鞘氨醇(S1P)生成量,当其浓度为100nmol/L,作用时间为12h时,效应最明显。结论体外实验证实alphastatin具有明显抑制ECV304细胞血管生成的作用,这种效应与降低细胞SPK活性、减少S1P的生成有密切关系。     

三羟异黄酮对脐静脉内皮细胞ECV304增殖影响与VEGFR的关系

目的探讨三羟异黄酮(genistein)抗肿瘤血管生成的机制.方法通过绘制生长曲线和流式细胞仪检测三羟异黄酮和血管内皮生长因子(vaScular endothelial growth factor,VEGF)对脐静脉内皮细胞ECV304增殖的影响,应用免疫沉淀和激酶活性分析方法检测ECV304细胞血管内皮生长因子受体(vascular endothelial growthfactor receptor,VEGFR)磷酸化水平和蛋白酪氨酸激酶(protein tyrosine kinase,PTK)活性.结果VEGF单独处理能使ECV304细胞增殖,VEGFR磷酸化水平和PTK活性升高,而三羟异黄酮单独处理能抑制ECV304细胞生长,细胞周期主要被阻止在G2/M期,并出现细胞凋亡现象,VEGFR磷酸化水平和PTK活性降低(P＜0.01),三羟异黄酮和VEGF同时处理时,细胞周期主要仍被阻止在G2/M期,但凋亡率下降,VEGFR磷酸化水平和PTK活性与VEGF单独处理组相比降低.结论三羟异黄酮能下调ECV304细胞VEGFR的磷酸化水平及PTK活性,从而阻断胞外生长刺激信号向胞内转导的级联反应,阻遏血管内皮细胞生长,抑制肿瘤血管生成.     

诺帝对体外内皮细胞三维成型的抑制作用

目的 观察自行研制的抗肿瘤制剂诺帝(Nordy)对三维胶原体外培养条件下恶性胶质瘤细胞诱导ECV304细胞血管生成的抑制作用.方法 采用不同浓度、不同时相点给药;观测在恶性胶质瘤细胞系SHG-44诱导 ECV304细胞生长和小管样结构形成的过程中,ECV304细胞增殖周期、凋亡率以及小管样结构形成数目、大小等指标.比较诺帝对SHG-44细胞诱导ECV304细胞形成小管样结构作用的差异.结果 诺帝对SHG-44细胞诱导的体外三维培养ECV304细胞小管形成具有明显的抑制作用,主要表现在细胞增殖周期、凋亡率以及小管样结构形成数目、大小等指标都有不同程度的改变.结论 诺帝通过对细胞核增殖的抑制和诱导部分凋亡作用来抑制小管结构的形成,是一种具有抗体外血管生成作用的良好制剂.     

生脉成骨胶囊对血管内皮细胞增殖及分泌VEGF功能的影响

目的探讨生脉成骨胶囊兔血清对人脐静脉血管内皮细胞株（ECV304细胞）增殖及分泌血管内皮生长因子（VEGF）功能的影响.方法以MTT法测定体外培养的ECV304细胞增殖,采用ELISA法检测培养液上清中VEGF浓度,应用透射电镜技术观察药物血清作用12 h后细胞显微结构.结果不同剂量生脉成骨胶囊兔血清在作用12 h和36h后对ECV304细胞增殖无促进作用,中剂量和高剂量兔血清在36h表现出抑制ECV304细胞增殖的作用（P＜0.01）,低剂量兔血清作用1 h后可显著促进ECV304细胞分泌VEGF（P＜0.01）.结论生脉成骨胶囊兔血清对ECV304细胞增殖无促进作用,低剂量生脉成骨胶囊兔血清可促进ECV304细胞分泌VEGF,提示这可能是生脉成骨胶囊促进血管生成的主要作用机制之一.     

加味小陷胸汤对氧化低密度脂蛋白致血管内皮细胞增殖和凋亡的影响

目的：探讨加味小陷胸汤拮抗氧化低密度脂蛋白(OX-LDL)对血管内皮细胞(ECV304)增殖和凋亡的影响。方法：采用10μg／ml的OX-LDL刺激培养的人脐静脉内皮细胞株ECV304,诱导细胞凋亡;观察不同浓度小陷胸汤对抗细胞凋亡的作用。结果：10μg／ml的OX-LDL在作用一定时间后可明显抑制内皮细胞增殖并诱导其凋亡,加味小陷胸汤含药血清对该细胞毒性有明显拮抗作用,并显示了效果与药物浓度有关。结论：加味小陷胸汤可通过提高内皮细胞生长活性并抑制其凋亡、保护血管内皮细胞。     

CXCR4在胶质瘤血管内皮细胞和ECV304细胞中的表达及其意义

目的检测人胶质瘤血管内皮细胞以及体外培养的血管内皮样细胞系ECV304趋化因子受体CXCR4的表达,观察其配体SDF-1对血管内皮样细胞迁移的影响,以探讨趋化因子受体CXCR4在肿瘤血管生成中的可能作用及其机制.方法通过免疫组化方法检测人胶质瘤血管内皮细胞CXCR4蛋白的表达,采用RT-PCR、免疫细胞化学方法检测血管内皮样细胞系ECV304上CXCR4 mRNA和CXCR4蛋白的表达,并采用48孔趋化板观察SDF-1诱导体外培养血管内皮样细胞的迁移作用.结果在胶质瘤血管内皮细胞和血管内皮样细胞系ECV304上均检测到趋化因子受体CXCR4的表达,体外实验显示SDF-1能诱导血管内皮样细胞发生明显的迁移.在30、50 ng/ml的实验浓度范围内,诱导血管内皮样细胞的迁移作用呈明显量效关系.结论胶质瘤血管内皮细胞和血管内皮样细胞系ECV304上存在CXCR4表达,CXCR4激活能诱导内皮细胞的迁移.