PP242对人晶状体上皮细胞凋亡相关蛋白Bcl-2表达的影响

目的探讨PP242对人晶状体上皮细胞凋亡相关蛋白Bcl-2表达的影响。方法采用不同浓度PP242处理培养传代的永生系人晶状体上皮细胞系SRA01/04。采用MTT法检测处理24、48 h后的细胞生长抑制率,采用实时定量RT-PCR和免疫印迹法检测不同浓度PP242处理48 h后Bcl-2 mRNA和蛋白表达水平的变化情况。结果 100、250、500、750、1 000、1 500 nmol/L PP242对人晶状体上皮细胞SRA01/04作用24、48 h后,细胞生长抑制率24 h组分别为7.55%、9.43%、16.98%、22.64%、26.42%、30.19%,48 h组分别为11.11%、23.81%、36.51%、42.86%、49.21%、63.49%,与对照组(0 nmol/L)比较,差异均有统计学意义(P均<0.05)。免疫印迹法检测结果显示:在相同作用时间内,随着PP242药物浓度的增加,Bcl-2蛋白的表达水平逐步下降,与对照组(0 nmol/L)比较,差异有统计学意义(P<0.05)。实时定量RT-PCR检测结果显示:在相同作用时间内,随着PP242药物浓度的增加,Bcl-2 mRNA表达水平亦逐步下降;m RNA相对表达量分别为0.723±0.039,0.517±0.028,0.353±0.052,0.167±0.046,与对照组(0 nmol/L)比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 PP242能够抑制体外培养的人晶状体上皮细胞的生长,呈浓度和时间依赖性。人晶状体上皮细胞中存在Bcl-2的表达,PP242可下调其表达。     

Thapsigargin对人晶状体上皮细胞系SRA01／04增殖抑制的作用机制

 【目的】研究thapsigargin（TG）对体外培养的人品状体上皮细胞系SRA01／04增殖的影响，并探讨其分子机制。【方法】不同浓度TG处理SRA01／04细胞72h，噻唑蓝比色法（MTT）检测细胞增殖；流式细胞仪（PI法）检测细胞周期改变；透射电镜观察细胞超微结构变化；TUNEL法检测细胞核中DNA的断裂情况；激光共焦显微镜和流式细胞仪检测Caspase3活性亚单位（17／19ku）的表达及阳性细胞表达率。【结果】MTT法测得TG为0．325～5μmol／L时，细胞增殖抑制率变化显著，IC50大约为0．8μmol／L；透射电镜显示TG处理SRA01／04细胞膜皱缩，染色体浓缩、边集、核膜裂解、凋亡小体形成；流式细胞仪（PI法）及TUNEL法检测TG浓度为0，0．1，0．5，1，10μmol／L分别处理SRA01／04细胞72h，细胞凋亡率随浓度的增加而增加，呈浓度依赖性；TG处理后细胞Caspase3阳性表达率也呈浓度依赖性增加，TG为10μmol／L时，几乎每个细胞浆内Caspase3都被激活。【结论】Thapsigargin可能通过激活Caspase3为诱导体外培养的人晶状体上皮细胞系SRA01／04细胞凋亡而抑制其增殖，TG为预防后发性白内障的药物研究提供了基础。     

Thapsigargin对人晶状体上皮细胞系SRA01／04增殖抑制的作用机制

【目的】研究thapsigargin（TG）对体外培养的人品状体上皮细胞系SRA01／04增殖的影响，并探讨其分子机制。【方法】不同浓度TG处理SRA01／04细胞72h，噻唑蓝比色法（MTT）检测细胞增殖；流式细胞仪（PI法）检测细胞周期改变；透射电镜观察细胞超微结构变化；TUNEL法检测细胞核中DNA的断裂情况；激光共焦显微镜和流式细胞仪检测Caspase3活性亚单位（17／19ku）的表达及阳性细胞表达率。【结果】MTT法测得TG为0．325～5μmol／L时，细胞增殖抑制率变化显著，IC50大约为0．8μmol／L；透射电镜显示TG处理SRA01／04细胞膜皱缩，染色体浓缩、边集、核膜裂解、凋亡小体形成；流式细胞仪（PI法）及TUNEL法检测TG浓度为0，0．1，0．5，1，10μmol／L分别处理SRA01／04细胞72h，细胞凋亡率随浓度的增加而增加，呈浓度依赖性；TG处理后细胞Caspase3阳性表达率也呈浓度依赖性增加，TG为10μmol／L时，几乎每个细胞浆内Caspase3都被激活。【结论】Thapsigargin可能通过激活Caspase3为诱导体外培养的人晶状体上皮细胞系SRA01／04细胞凋亡而抑制其增殖，TG为预防后发性白内障的药物研究提供了基础。     

αB-晶状体蛋白促进体外培养人RPE细胞的增殖

目的 测定αB-晶状体蛋白在体外培养人视网膜色素上皮细胞(retinal pigment epithelial cell,RPE)中的表达,探讨αB-晶状体蛋白对体外培养人RPE细胞增殖的影响.方法 传代培养人A-RPE19细胞系,免疫荧光技术检测αB-晶状体蛋白在RPE细胞中的表达.用不同稀释浓度(体积比分别为1/102、1/103、1/104、1/105、1/106)的αB-晶状体蛋白以及其抗体干预各组(对照组、蛋白组、抗体组)细胞,MTT方法检测不同时间点各组细胞光密度值,流式细胞术检测各组细胞不同时间点的周期及凋亡情况.结果 αB-晶状体蛋白在体外培养人RPE细胞质中表达;在48 h,浓度为1/104～1/102时,3组细胞的光密度值差异有统计学意义(P＜0.05);蛋白组与对照组相比,0～48 h蛋白组的G1期比例减小,S、G2期比例增加,抗体组与对照组相比,G1期比例增加,S、G2期比例减少(P＜0.05,P＜0.01);48 h时3组之间凋亡细胞的构成比差异有统计学意义(P＜0.05).结论 αB-晶状体蛋白在体外培养人RPE细胞质中表达,并对体外培养人RPE细胞增殖起明显促进作用.     

人良性脑膜瘤细胞热敏感性的实验研究

目的 探讨人良性脑膜瘤细胞的热敏感性及其机制.方法 15例人脑膜瘤原代培养细胞进行温水加热体外实验.采用Western blot法检测HSFl蛋白表达;免疫组织化学法检测HSF1、HSP27、HSP70和HSP90蛋白表达;MTT法检测细胞增殖抑制率、TUNNEL法检测细胞凋亡率.结果 15例人良性脑膜瘤在44℃温水加热60 min后细胞增殖抑制卒仅为(8.33±0.18)%,凋亡率(%)为(2.4±0.16)%.温水加热后,人脑膜瘤增殖能力没有受到抑制,没有诱导细胞凋亡或细胞坏死(P＞0.05).在热刺激下,HSFI蛋白发生活化,由单体(80kD)转化为三聚体(260kD).加热后6h出现HSP27、HSP70与HSP90表达明显增加,持续24h高表达,显著高于加热前对照组(P＜0.05).结论 人脑膜瘤热敏感性低,单纯温水加热(42～44℃)无抑制细胞增殖和增加细胞凋亡的作用.其机制可能是在加热刺激下,人脑膜瘤细胞HSF1蛋白发生三聚体活化,诱导型HSP27、HSP70和HSP90在加热后24 h内持续高表达.保护和修复了热损伤的人脑膜瘤细胞.     

miR-146a-5p靶向调控Notch2促进人晶状体上皮细胞线粒体损伤诱导的细胞凋亡

目的 探讨miR-146a-5p在人晶状体上皮细胞线粒体损伤中的调控作用,以及miR-146a-5p靶向调控Notch2表达对细胞凋亡的影响。方法 采用实时定量PCR (qRT-PCR)检测miR-146a-5p在白内障患者晶状体上皮中的表达。将miR-146a-5p模拟物转染人晶状体上皮细胞系SRA01/04,流式细胞术检测细胞凋亡。Western blotting检测凋亡相关蛋白caspase 9和caspase 12、线粒体损伤相关蛋白基质金属蛋白酶（MMP）-2和MMP-9、细胞色素c的表达。qRT-PCR检测NDUFS8、COX5b和ATP5a1 mRNA的表达。免疫荧光检测活性氧（ROS）释放。荧光素酶报告基因实验检测miR-146a-5p和Notch2的3’非翻译区靶向结合。Western blotting检测Notch2下游蛋白。结果 miR-146a-5p增加了SRA01/04细胞ROS的产生,诱发凋亡。miR-146a-5p过表达通过激活caspase 9,阻断线粒体能量代谢,促进线粒体介导的细胞凋亡。Notch2被确认为miR-146a-5p的靶点。结论 miR-...     

线粒体靶向性肽SS-31对H2O2诱导人晶状体上皮细胞凋亡的保护作用

目的 研究线粒体靶向性肽SS-31在H₂O₂诱导的人晶状体上皮细胞凋亡中的保护作用及其分子机制.方法 体外培养人晶状体上皮细胞系SRA01/04,选取相同代次的SRA01/04细胞进行实验,应用100 μmol/L H₂O₂ 构建凋亡模型,随机分为正常对照组、H₂O₂处理组、3个不同浓度的SS-31预处理组.应用MTT法检测各组细胞存活率;流式细胞术检测各组细胞凋亡率;Western blotting检测各组凋亡蛋白Bcl-2、Bax、Cleaved-Caspase-3的表达.结果 H₂O₂处理24 h后,细胞存活率降低,凋亡率升高,促凋亡蛋白Bax的表达升高,抗凋亡蛋白Bcl-2的表达降低,Bax/Bcl-2比率升高,Cleaved-Caspase-3的表达升高.SS-31预处理能明显提高细胞的存活率,且与浓度呈正相关.同时,SS-31还能减少细胞的凋亡率,下调Bax的表达,上调Bcl-2的表达,减少Cleaved-Caspase-3的激活,从而发挥抗凋亡作用.结论 SS-31能在H₂O₂诱导的人晶状体上皮细胞凋亡中有效地发挥保护作用,但能否应用于白内障治疗有待深入研究.     

硫酸锌对过氧化氢诱导鼠晶状体上皮细胞HSP27表达的影响

目的:探讨硫酸锌(ZnSO4)在H2O2诱导的大鼠晶状体上皮细胞热休克蛋白27(HSP27)表达中的作用。方法:离体培养大鼠晶状体,阴性对照组培养液中不加H2O2;阳性对照组加H2O2;实验组同时加入H2O2和Zn-SO4。光学显微镜下观察3组晶状体混浊程度的改变。用免疫组织化学方法检测表达情况,统计比较各组差异。结果:实验组晶状体的混浊程度较阳性对照组轻。H2O2刺激后晶状体上皮细胞中HSP27表达显著增加。随作用时间的延长阳性对照组HSP27阳性细胞数较同时段实验组明显减少。结论:ZnSO4能促进鼠的晶状体上皮细胞中HSP27表达,从而可能对晶状体的保护起重要作用。     

SUMO蛋白在体外培养的人晶状体上皮细胞内的表达及对氧化应激的调控作用

目的观察小泛素相关修饰物(SUMO)在体外正常培养的人晶状体上皮细胞系(SRA01/04)内的表达以及由高糖诱导的氧化应激条件下SUMO的变化,探讨其对氧化应激的调控作用。方法通过免疫细胞化学染色法,检测SUMO1,2/3,4蛋白在正常培养的SRA01/04内的表达及分布;通过RT-PCR法,观察不同浓度和时间高糖处理时SUMO 1~4 mRNA的表达变化。按浓度实验分组:葡萄糖浓度分别为5.5、12.5、25、50 mmol/L作用24 h。按时间实验分组:葡萄糖浓度50 mmol/L作用0、6、12、24 h。将GFP-SUMO2质粒转入细胞后通过CCK8检测法和AV/PI双染流式细胞仪检测高糖(50 mmol/L)处理后,转染与非转染组的细胞存活率和细胞凋亡率。结果免疫细胞化学染色结果 ,SUMO 1~4蛋白在SRA01/04细胞内主要分布于细胞核,SUMO 2/3同时少量分布于胞质;RT-PCR结果可见,与低糖组比较,高糖组随着糖浓度增加SUMO1~SUMO4 mRNA表达增加(P<0.05);与50 mmol/L高糖处理0 h比较,随着处理时间增加SUMO1~SUMO4 m RNA表达增加(P<0.05)。与非转染组比较,转染GFPSUMO2的SRA01/04经高糖处理后存活率增加,凋亡率降低(P<0.05)。结论 SUMO蛋白在SRA01/04内阳性表达,一定程度高糖诱导的氧化应激影响SUMO mRNA表达。     

Effects of Sodium Salicylate on the Expression of HSP27 Protein during Oxidative Stress in Tissue-cultured Human Lens Epithelial Cells

The lens is avascular and has no innervation, and must derive nutrients from the aqueous humor[1]. Heat shock protein (HSP) was discovered by Ritossa in 1962 as a special group of heat shock biosynthetic proteins with various forms. Although stress responses include all of the processes that organisms have developed to sur-vive when they are exposed to environmental challenges, such as heat stress, desiccation, chemical stress, or star-vation, the effector proteins are almost all referred to …     

杏丁注射液对血管内皮细胞HSP 72表达的影响

目的:观察杏丁注射液对紫外线照射后血管内皮细胞热休克蛋白72(heat shock protein 72,HSP 72)表达的影响.方法:采用体外培养的猪主动脉血管内皮细胞,以含浓度分别为0.1、0.5、1.0、5.0、10 mg/ml的杏丁注射液的培养基培养72 h后,用紫外线分别照射细胞30 min,以Western-blot方法检测内皮细胞中的HSP 72表达.结果:正常情况下检测不到HSP 72表达,紫外线照射后血管内皮细胞HSP 72有较强表达,杏丁注射液在0.1 mg/ml浓度即有很明显的促进HSP 72表达的作用,1.0 mg/ml浓度时其作用达到高峰,再增加浓度并不能增加HSP 72表达.结论:杏丁注射液能通过促进HSP 72表达而保护血管内皮细胞在应激状态下免受损伤,这可能是其防治心脑血管疾病的重要机制之一.     

Effects of mitogen-activated protein kinase signal pathway on heat shock protein 27 expression in human lens epithelial cells exposed to sodium salicylate in vitro

The roles of mitogen-activated protein kinase （MAPK） signal pathway in sodium salieylate-induced expression of heat shock protein 27 （HSP27） in human lens epithelial cells （HLECs-B3） in vitro were investigated. HLECs-B3 were incubated in the fresh media containing sodium salicylate at different concentrations for different durations, and allowed to be recovered in fresh medium without sodium salicylate for different durations with or without pretreatment with p38MAPK inhibitor （SB203580）, ERK1/2 inhibitor （PD98059） and JNK/SAPK inhibitor （SP600125）. The expression of P38MAPK, ERK1/2, JNK/SAPK, phosphorylated P38MAPK, phosphorylated ERK1/2, phosphorylated JNK/SAPK and HSP27 was detected by Western blot. The expression of HSP27 mRNA and protein was detected by RT-PCR and immunohistochemistry respectively. It was found there was only weak expression of HSP27 in normal HLECs. The expression of HSP27 was not detectable in HLECs-B3 that were exposed to sodium salicylate （55 retool/L） for 1-5 h. It was indicated that recovery from sodium salicylate （〉35 mmol/L） significantly increased the synthesis of HSP27. The expression of HSP27 was up-regulated in HLECs-B3 under sodium salicylate recovery for 3 h, reached the peak level for 6 h, and returned to the level of control cells by 24 h. Activation of P38MAPK from sodium salicylate stimulation occurred at 30th rain, and increased significantly at 1st h, then declined and renamed to baseline level at 3rd h under sodium salicylate recovery. Activation of ERK1/2 occurred at 1st h and reached the peak level at 6th h under sodium salicylate recovery. However, JNK/SAPK was inactivated by sodium salicylate. The expression of HSP27 could be down-regulated with the pretreatment of SB203580 and PD98059 jointly. It is concluded that sodium salicylate can induce the expression of HSP27 in HLECs-B3. The effects are mediated, at least in part, through the activation of P38MAPK and ERK1/2 signaling pathway.     

香烟烟雾凝聚物通过AP-1探针调节肺泡上皮细胞γ-GCS限速酶的表达

目的探讨香烟烟雾凝集物(CSC)对肺泡上皮细胞(CCL149)表达限速酶r-GCS的影响与机制。方法用不同浓度的CSC处理CCL149细胞1、4、8、12、24、48 h后,采用反向聚合酶链反应和W est印记法在CSC作用不同时间点检测CCL149细胞表达r-GCS的mRNA和蛋白的水平;脂质体转染及荧光素酶活性检测法测定CSC对大鼠gamm a-GCS重链(GCLC)基因5′-端启动子区域功能的影响;用EMSA法测定AP-1探针的结合水平。结果CSC可刺激CCL-149细胞表达gamm a-GCS,在一定浓度时(>1μg/m l),CCL149细胞用CSC处理后1、4、8 h组-γGCS mRNA的表达水平未见到有明显的差别;而12、24、48 h组-γGCS mRNA的表达水平较对照组明显增高(1.71±0.12 vs.0.67±0.06,P<0.05)。CSC亦能使带有GCLC 5′-端全长的荧光素酶报道基因的荧光素酶的活性增强,与无启动子的空载体对照组比较,CSC刺激后12、24、48 h组荧光素酶的活性均明显增强,其γ-GCS的活性均有升高(0.63±0.24 vs.1.75±0.27,P<0.05)。CSC尚促进AP-1与GCLC的DNA结合水平。结论CSC通过激活氧化应激敏感的转录因子AP-1上调CCL-149细胞内r-GCS的表达。     

茶多酚对低剂量烟草悬凝物诱导人支气管上皮细胞氧化损伤及凋亡的影响

目的:研究茶多酚对低剂量烟草悬凝物诱导人支气管上皮细胞氧化损伤及凋亡的影响.方法:制备烟草悬凝物(cigarette smoke condensate, CSC),采用四甲基偶氮唑盐[3-(4,5-dimethyl thiazoly)2,5-diphenyl-tetrazolium bromide,MTT]法测定人支气管上皮细胞株(HBE135-E6E7)的生长情况;荧光-化学发光仪测定细胞内氧自由基(reactive oxygen species,ROS)水平;DNA ladder 法检测HBE135-E6E7凋亡;反转录-多聚酶链式反应 (RT-PCR)法检测Bcl-2和Bax mRNA表达.结果:CSC组与CSC+茶多酚组细胞内ROS水平均明显高于对照组(P＜0.01),CSC+茶多酚组细胞内ROS水平则明显低于CSC组.CSC组出现明显的DNA断裂拖尾带,CSC+茶多酚组仅出现少量的断裂拖尾带.RT-PCR结果显示:与对照组相比, CSC组Bcl-2 mRNA表达降低 (P＜0.01), Bax mRNA表达升高 (P＜0.01);与CSC组相比, CSC+茶多酚组Bcl-2 mRNA表达升高 (P＜0.01), Bax mRNA表达降低 (P＜(0.01)),CSC组与(CSC+)茶多酚组 Bcl-2 mRNA/Bax mRNA值明显低于对照组(P＜0.01).结论:茶多酚可拮抗CSC诱导人支气管上皮细胞凋亡,其机制可能是通过有效清除ROS,促进Bcl-2 mRNA表达和抑制Bax mRNA表达实(现的).     

格尔德霉素对乳腺癌细胞HSP、突变型p53和CDK4表达的影响

目的 探讨格尔德霉素(geldanamycin,GA)对乳腺癌MDA-MB- 435s细胞中HSP(HSP90、HSP70、HSP27)和癌蛋白(突变型p53、CDK4)表达的影响.方法 采用MTT法检测GA对乳腺癌MDA-MB-435s细胞的生长抑制作用,RT-PCR检测GA作用后细胞内HSP90、HSP70、HSP27 mRNA表达变化,用Western blot检测GA作用后细胞内HSP90、HSP70、HSP27、突变型p53和CDK4蛋白质表达变化.结果 不同浓度GA对MDA-MB-435s细胞有生长抑制作用,呈时效量效依赖关系.400 nmol/L GA处理细胞48 h后,细胞内HSP90、HSP70、HSP27 mRNA表达和蛋白表达均增高,以HSP70增高最明显,而突变型p53和CDK4蛋白表达明显减少.结论 GA通过下调突变型p53和CDK4表达抑制乳腺癌MDA-MB-435s细胞的增殖,同时GA可诱导细胞内HSP90、HSP70和HSP27表达参与细胞应激保护.     

硫氧还蛋白-2 在氧化损伤的人晶状体上皮细胞中的表达及其意义

目的：探讨硫氧还蛋白-2(thioredoin-2,Trx-2)是否参与白内障的发病过程及其对过氧化氢(H2O2)诱导的 人晶状体上皮细胞氧化损伤的影响。方法：选取志愿者(因外伤行透明晶状体取出术患者)10例和行超声乳化白内 障手术患者(年龄大于60岁)30例的晶状体前囊膜,采用链霉素亲生物素蛋白-过氧化物酶标免疫组织化学法检测志 愿者和白内障患者晶状体上皮细胞中Trx-2蛋白的表达情况。体外培养SRA01/04细胞,根据不同处理分为空白对照 组、20 μmol/L H2O2组、50 μmol/L H2O2组、100 μmol/L H2O2组、阴性对照组(转染对照空pCMV6质粒并用100 μmol/L H2O2处理)和过表达Trx-2组(转染pCMV6-Trx-2过表达质粒并用100 μmol/L H2O2处理)。采用噻唑蓝[3-(4,5-dimethyl-2- thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide,MTT]法检测各组细胞活力;采用流式细胞术检测各组细胞的凋亡;采用 化学比色法检测各组细胞中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和过氧化氢酶(catalase,CAT)活性,谷胱甘肽 (glutathione,GSH)和丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量;采用Western印迹检测各组细胞中Trx-2以及B细胞淋巴瘤/白 血病-2蛋白(B-cell lymphoma 2 protein,Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax)和含半胱氨酸的天冬氨酸 蛋白水解酶-3(cysteinyl aspartate specific proteinase-3,caspase-3)的表达。结果：与志愿者相比,白内障患者晶状体上皮 细胞中Trx-2蛋白表达明显减少(P<0.05)。与空白对照组比较,20, 50,100 μmol/L H2O2组Trx-2蛋白表达量均明显降低 (均P<0.05)。与空白对照组相比,100 μmol/L H2O2组和阴性对照组细胞存活率降低、凋亡率增加,细胞内SOD和CAT 活性降低、GSH含量减少、MDA含量增加,Trx-2和Bcl-2蛋白表达降低,Bax和caspase-3蛋白表达增加(均P<0.05)。与 阴性对照组比较,过表达Trx-2组细胞存活率增加、凋亡率降低,SOD和CAT活性增加、GSH含量升高、MDA含量降 低,Trx-2和Bcl-2蛋白表达增加,Bax和caspase-3蛋白表达减少(均P<0.05)。结论：Trx-2参与白内障发病中上皮细胞的凋 亡,过表达Trx-2能够减少H2O2诱导的细胞凋亡,这可能与拮抗H2O2诱导的氧化损伤有关。     

体外培养人胚晶状体上皮细胞生长特性的研究

目的观察体外培养人胚晶状体上皮细胞的生物学特性。方法组织块贴壁法培养人胚晶状体上皮细胞,通过倒置相差显微镜、透射电子显微镜,采用免疫细胞化学法分析人胚晶状体上皮细胞的生长特性。结果体外培养的原代人胚晶状体上皮细胞在组织块贴壁48～72 h后从组织块边缘长出,具有上皮细胞的形态特点,第10天达到融合。第二代人胚晶状体上皮生长曲线近＂S＂形,经过1～2 d的潜伏期后进入对数生长期,需10 d左右达到融合,细胞形态呈六角形或椭圆形、超微结构保持正常,免疫细胞化学SABC法染色结果显示细胞浆内α-晶状体蛋白染色阳性。结论人胚晶状体上皮细胞具有增殖能力,第二代人胚晶状体上皮细胞是进行白内障相关研究的合适实验对象。