金黄色葡萄球菌诱导人脐静脉内皮细胞凋亡的观察

目的观察人脐静脉内皮细胞株ECV．304对金黄色葡萄球菌（S．aureus）感染的反应。方法常规方法制备金黄色葡萄球菌悬液,以1：1、1：10和1：100的感染复数感染ECV．304细胞1、3、6、12h和24h后,估算细胞吞噬细菌数,采用Hoechst33258染色,DNAladder及细胞凋亡相关因子RT．PCR检测细菌感染后细胞凋亡情况。结果金黄色葡萄球菌感染复数越高,细胞内吞噬的活细菌数越多。金黄色葡萄球菌感染导致ECV-304细胞发生凋亡,凋亡具有时间依赖性,随着感染时间的延长,凋亡小体增多,DNA片段也随之增多。抗凋亡细胞因子Bcl2mRNA表达量随着感染时间的延长下降,而促凋亡细胞因子Bax和Caspase．3表达量增多。结论金黄色葡萄球菌感染ECV-304细胞后,通过下调抗凋亡细胞因子Bcl2、上调促凋亡细胞因子Bax和Caspase-3诱导细胞凋亡。金黄色葡萄球菌感染内皮细胞的可能致病机制为临床治疗提供了实验依据。     

EDA-A1基因突变体对人脐静脉内皮细胞 ECV304增殖及细胞周期的影响

目的：研究少汗型外胚层发育不良症 EDA‐A1基因突变体对人脐静脉内皮细胞（ECV ）周期和增殖活性的影响。方法构建 EDA‐A1基因编码序列（CDS）突变体和野生型的真核表达载体 pcDNA3．1（‐）‐EDA‐A1‐M /W ,转染人脐静脉内皮细胞,逆转录 PCR（RT‐PCR）扩增 EDA‐A1基因,蛋白免疫印迹法（Western blot）法检测 EDA‐A1蛋白表达,M TT 法、流式细胞术检测EDA‐A1基因突变体对 ECV 细胞增殖和细胞周期的影响。结果 RT‐PCR 、Western blot 结果显示,野生型组和突变体组 ECV细胞表达 EDA‐A1基因及其蛋白,而空质粒转染组[pcDNA3．1（‐）]和空白对照组细胞无表达。与对照组（空质粒租）相比,突变体组 ECV 细胞增殖活性下降,生长抑制率为45．70％（P＜0．01）,野生型细胞增殖活性无明显改变（P＞0．05）。突变体组中有更多细胞进入 G0/G1期、S 期;野生型组 S 期细胞增多,G2/M 期细胞明显减少（P＜0．05）。结论突变体和野生型 EDA‐A1基因对 ECV 细胞增殖和细胞周期有不同的生物学功能。     

单核细胞趋化蛋白-1对人脐静脉内皮细胞凋亡的影响

目的 研究单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemotactic protein-1, MCP-1)对人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells, hUVEC)凋亡的影响.方法 培养并鉴定人脐静脉内皮细胞;用不同浓度MCP-1(0.1、1.0、10、100 μg/L)对其作用24、48 h;先用MTT比色法观察细胞存活率、流式细胞技术检测细胞DNA含量及细胞周期观察其对hUVEC凋亡的影响.结果 单核细胞趋化蛋白-1能诱导人脐静脉内皮细胞的凋亡(P＜0.05),其效应随浓度和时间的增加而增强:MTT明显减低;细胞DNA含量减少,出现明显亚G0/G1峰(凋亡细胞峰).结论 单核细胞趋化蛋白-1能诱导人脐静脉内皮细胞凋亡.     

EA.HY926人脐静脉内皮细胞株与原代细胞生物特性的比较研究

目的比较培养EA．HY926人脐静脉内皮细胞株与原代脐静脉内皮细胞（HUVECs）的优缺点及生物学特性。方法通过倒置显微镜、透射电镜形态学鉴定、Ⅷ因子相关抗原免疫组织化学检查及生长曲线测定,比较2种脐静脉内皮细胞的形态、生长喵线等差异。结果透射电镜观察到原代HUVECs中发现较多Webel—Palade小体,而EA．HY926细胞株较少见。免疫组织化学染色ImageProPlus6．0软件进行分析EA．HY926人脐静脉内皮细胞株与原代HUVECs平均光密度值分别为（2234．02±78．78）、（4138．80±594．01）。原代HUVECs的染色程度明显较EA．HY926细胞株高,差异有统计学意义（Pd0．01）。EA．HY926人脐静脉内皮细胞株生长曲线较原代HUVECs稳定。结论培养原代HUVECs耗时长,生长期较短,易出现杂细胞的污染,细胞的增殖能力有限,花费昂贵。EA．HY926细胞株虽生物特性较差,但其操作简便,具有一定程度的原代HUVECs所具有的生物特性,细胞均一以及增长旺盛,可用于较复杂、细胞创伤较大的体外内皮细胞的研究。     

尼古丁对人脐静脉内皮细胞凋亡及坏死的影响

目的不同浓度尼古丁对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)凋亡及坏死的影响。方法用CD34以免疫组织化学法鉴定HUVECs。通过3种不同浓度的尼古丁(3、30、300 ng/ml)刺激HUVECs 24 h后,用流式细胞仪检测其凋亡及坏死率。结果低浓度尼古丁促进细胞凋亡最强,而随着尼古丁浓度的增加,细胞凋亡率反而逐渐降低,各组差异具有统计学意义(P<0.05);此外,随着尼古丁浓度增加,细胞坏死率也日益增多,各组差异具有统计学意义(P<0.05)。细胞坏死率与尼古丁浓度呈正相关(r=0.675)。结论尼古丁对HUVECs凋亡的影响具有浓度依赖性,细胞坏死率与尼古丁浓度呈正相关。     

丙氨酰谷氨酰胺二肽对人脐静脉内皮细胞ECV304缺氧缺糖损伤的保护作用

目的 观察丙氨酰谷氨酰胺二肽（丙谷二肽）对人脐静脉内皮细胞ECV304缺氧缺糖损伤的保护作用,并探讨其可能的作用机制。方法 在以低氧低糖培养人脐静脉内皮细胞ECV304为细胞损伤模型的基础上,以噻唑蓝（MTT）比色法优化丙谷二肽的最佳作用浓度,显微镜观察细胞形态变化,流式细胞术检测线粒体膜电位。自动生化分析仪测定乳酸脱氢酶（LDH）活性,比色法检测谷胱甘肽（GSH）、丙二醛（MDA）的浓度,RT-PCR方法检测细胞内肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-6 (IL-6)、热休克蛋白70 (HSP70)、葡萄糖调节蛋白78 (GRP78) 和缺氧诱导因子-1α (HIF-1α) mRNA的表达。结果 丙谷二肽能够使细胞在缺氧缺糖应激下存活率增加,线粒体损伤减轻,LDH分泌降低,GSH产生增加,HSP70和HIF-1α mRNA的表达增加。结论 丙谷二肽对细胞缺氧缺糖损伤有明显的保护作用,这种保护作用可能与保护线粒体、维持细胞膜结构完整、上调细胞中应激基因HSP70和HIF-1α的表达有关。     

人参皂甙Rg1对同型半胱氨酸诱导人脐静脉内皮细胞凋亡的逆转作用

目的人参皂甙Rg1对同型半胱氨酸(homocy steine,Hcy)诱导人脐静脉内皮细胞(HUVECs)凋亡的逆转作用。方法体外培养HUVECs,采用台盼蓝染色方法筛选人参皂甙Rg1最适浓度。将细胞分为对照组(无任何诱导物)、Hcy组(10μmol·L-1Hcy)、Hcy+Rg1组(10μmol·L-1Hcy和40mg·L-1Rg1)和Rg1组(单独用40mg·L-1Rg1处理的细胞),作用时间为24h。琼脂糖凝胶电泳和末端脱氧核糖核苷酸转移酶介导的缺口末端标记法(TUNEL)染色检测细胞凋亡情况。结果台盼蓝染色结果显示:人参皂甙Rg1的最适浓度40mg·L-1。琼脂糖凝胶电泳结果显示:对照组和Rg1组未见凋亡条带,Hcy组可见清楚的细胞凋亡特征性的"梯状"条带,而Hcy+Rg1组可见不明显的细胞凋亡特征性的"梯状"DNA断裂条带。TUNEL染色结果显示:与对照组和Rg1组相比,Hcy组细胞凋亡数量显著增加(P<0.01);与Hcy组相比,Hcy+Rg1组细胞凋亡数量显著减少(P<0.01),凋亡百分比由33.733%下降至9.200%,但仍高于对照组和Rg1组(P<0.01)。结论 40mg·L-1人参皂甙Rg1可一定程度逆转Hcy诱导的HUVECs凋亡。     

解脲脲原体诱导脐静脉内皮细胞凋亡的研究

目的：研究解脲脲原体（Ureaplasmaurealyticum,uu）能否诱导脐静脉内皮细胞（humanumbilicalveinendothelialcells,HUVEC）凋亡,并探讨其凋亡机制。方法：UU感染HUVEC2、4、8、12h后,用流式细胞术检测细胞凋亡率。并检测uu感染HUVEC8h后TNF—d、caspase-3及caspase-8产生量,同时检测加入TNF—d抗体、caspase-3和caspase-8抑制剂后的细胞凋亡率。结果：UU可以诱导HUVEC发生凋亡,与对照组差异有统计学意义（P〈0．01）;感染8h后TNF—α、caspase-3、caspase-8的产生量均高于对照组（P〈0．01）;加入TNF-α抗体、caspase-3和caspase-8抑制剂后凋亡率均明显低于对照组（P〈0．01）。结论：uu可以诱导HUVEC凋亡,并存在明显的时间效应关系,其凋亡机制可能是通过TNF-α介导的caspase-8及caspase-3激活的外源性死亡因子受体途径。     

人脐静脉内皮细胞的原代培养

目的建立一种能大量分离人脐静脉内皮细胞(HUVEC)且操作方便的体外培养方法。方法采用不同浓度的Ⅱ型胶原酶(0.05%,0.1%和0.2%)对HUVEC进行灌注,并分别孵育不同的时间(10min,13min,15min和18min)进行消化,观察细胞的形态、数量以及生长融合情况。结果采用0.1%的胶原酶消化10-13min为最佳条件,经光学显微镜观察培养的细胞数量较多,生长、繁殖状态良好,培养3d左右细胞可达到融合状态。结论本实验建立的胶原酶法消化HUVEC培养方法简便,细胞获得量较多且生长状态良好。     

人脐静脉内皮细胞体外培养方法

目的探索人脐静脉内皮细胞体外培养方法和注意事项。方法采用0.1%I型胶原酶分离脐静脉内皮细胞,于RPMI-1640和20?S内培养,待细胞80%融合后,以0.25%胰蛋白酶和0.02?TA消化传代,并以倒置光显微镜观察内皮细胞生长情况,以免疫组化方法对内皮细胞进行鉴定。结果原代培养细胞在接种4 h后开始贴壁生长,5~7 d后融合成单层,倒置光显微镜下观察细胞呈鹅卵石状排列,有接触抑制现象,免疫组化显示细胞胞浆内Ⅷ因子相关抗原阳性。结论用胶原酶灌注消化脐静脉是获得内皮细胞的一种较可靠的方法,成活率较高,培养的多个环节均需关注。     

原代人脐静脉内皮细胞分离和培养方法的改进

目的建立一套高效、方便、可靠的脐静脉内皮细胞的体外分离和培养方法。方法取剖腹产新生婴儿脐带,加入Ⅰ型胶原酶消化分离人脐静脉内皮细胞,内皮专用培养基EGM-2培养传代。应用相差显微镜观察细胞形态。DiL-Ac-LDL染色证实细胞具有内皮功能。免疫荧光染色证明新分离细胞表达FⅧ相关抗原。流式细胞仪检测细胞表面表达CD31。结果原代培养细胞培养10～15d左右长成单层,细胞呈多角形,铺路石样排列。DiL-Ac-LDL染色阳性,证实细胞具内皮吞噬功能。免疫荧光检测证明细胞特异性表达FⅧ相关抗原。流式细胞仪检测证明细胞表面高表达CD31。结论通过酶灌注法消化脐静脉血管获得细胞,操作简便、高效,EGM-2培养基可保证内皮细胞具有较高纯度,细胞形态学观察和细胞生物学鉴定证明获得人脐静脉血管内皮细胞。     

非诺贝特对LPC诱导的人脐静脉内皮细胞增生、凋亡、NO生成及XIAP mRNA表达的影响

目的:探讨非诺贝特对LPC诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)增生、凋亡、NO生成及X连锁凋亡抑制蛋白(XIAP)mRNA表达的影响.方法:体外培养HUVECs株CRL-1730,分为正常对照组、LPC组、低浓度非诺贝特组(10 μmol/L)、中浓度非诺贝特组(50 μmol/L)、高浓度非诺贝特组(100 μmol/L).分别观测内皮细胞增生、凋亡、NO生成及XIAP mRNA表达的变化.结果:与正常对照组比较,LPC抑制CRL-1730细胞增生,促进凋亡,降低NO浓度,减弱XIAP mRNA的表达.非诺贝特干预后,CRL-1730细胞增生增强,凋亡减少,NO浓度升高,XIAP mRNA表达增强,且其作用呈时间-效应、浓度-效应依赖关系.结论:非诺贝特可通过促进XIAP表达,干预LPC对HUVECs的影响,使内皮细胞增生增强,凋亡减少,NO浓度升高,从而起到抗动脉硬化作用.     

平阳霉素对人脐静脉内皮细胞株EA.hy926的作用及其机制

目的:观察平阳霉素(PYM)对人脐静脉内皮细胞株EA.hy926的作用及可能机制。方法:采用甲基三氯硅烷(MTS)比色法检测PYM对EA.hy926细胞体外生长的作用;流式细胞术测定PYM作用细胞24h后细胞凋亡、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)-3表达、线粒体膜电位的变化;免疫印迹(Western-blot)法检测PYM对EA.hy926细胞中Caspase-8、Caspase-9蛋白表达水平的影响。结果:PYM可明显抑制EA.hy926细胞的增殖,且生长抑制率具有浓度时间依赖性;流式细胞术检测结果显示PYM各浓度作用24h后,细胞凋亡百分率随药物浓度增加而增高,活化Caspase-3表达在PYM各浓度组均增强,线粒体膜电位在各浓度组均下降;Western-blot法检测结果显示PYM作用EA.hy926细胞后,Caspase-8、Caspase-9蛋白均可出现明显的剪切带。结论:PYM能抑制EA.hy926细胞的增殖,这种抑制作用是可通过诱导细胞凋亡实现的,Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9参与了PYM诱导EA.hy926细胞凋亡的过程。     

羟基红花黄色素A对肿瘤上清诱导的人脐静脉内皮细胞周期及凋亡的影响

目的研究羟基红花黄色素A(HSYA)对人肝癌细胞株HepG2培养上清液诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)细胞周期及凋亡的影响。方法原代培养HUVEC,传至第3~6代进行实验。用流式细胞术检测HSYA作用下HepG2培养上清液刺激后异常增殖的内皮细胞细胞周期及凋亡情况的改变,并以ELISA法检测与凋亡有关的细胞因子TNF-α表达情况。结果HUVEC经肿瘤上清液刺激后G0/G1期细胞比例明显减少(P<0.05),S期细胞的比例明显增加(P<0.01),凋亡细胞的比例明显减少(P<0.05)。经HSYA作用后,细胞周期各期细胞所占比例与模型组比较无显著性差异,凋亡细胞比例明显增多(P<0.05)。同时,TNF-α在肿瘤上清液刺激后表达明显减少(P<0.05),经HSYA作用后又明显升高(P<0.05)。结论HSYA可以有效促进肿瘤上清液刺激后的人脐静脉内皮细胞的凋亡,其机制之一是通过提高凋亡相关因子TNF-α的表达来实现的。     

银杏二萜内酯对缺氧处理人脐静脉内皮细胞凋亡和血管生成的影响及机制

目的 探讨银杏二萜内酯对缺氧处理的人血管内皮细胞株凋亡和血管生成的影响及分子机制。方法 在低氧状态下培养人血管内皮细胞株HUVEC 24 h,然后分别以低剂量(6.25mg/L)、高剂量(25.00 mg/L)银杏二萜内酯对HUVEC 进行处理。MTT法检测细胞活性情况;流式细胞术(FCM)检测各组细胞的凋亡情况;Transwell小室实验检测细胞的迁移能力;荧光实时定量RT-PCR(qPCR)和蛋白印迹法(Western blot)检测缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)、P53、Bcl-2、Bax、血管内皮生长因子(VEGF)、转化生长因子-β(TGF-β)的mRNA和蛋白表达。结果 低氧培养后HUVEC细胞的活性明显低于正常氧培养组(P<0.05);低氧培养的HUVEC细胞凋亡率明显高于正常氧培养组,HIF-1α表达明显高于正常氧培养组(P<0.05)。银杏二萜内酯处理组的细胞活性明显高于对照组(低氧处理组),高剂量组的细胞活性高于低剂量组(P<0.05)。银杏二萜内酯处理组的细胞凋亡率明显低于对照组(低氧处理组),高剂量组的凋亡率低于低剂量组(P<0.05)。银杏二萜内酯处理组的细胞迁移能力明显高于对照组(低氧处理组),高剂量组的迁移能力高于低剂量组(P<0.05)。qPCR和Western blot结果显示,银杏二萜内酯处理组的细胞HIF-1α、Bax的mRNA和蛋白表达低于对照组,Bcl-2、VEGF、TGF-β的mRNA和蛋白表达高于对照组;高剂量组上述各基因表达变化程度比低剂量组更为明显(P<0.05)。结论 银杏二萜内酯能通过调控相关基因表达而改善缺氧处理的HUVEC细胞的凋亡及血管生成情况,可能成为治疗缺氧性血管疾病的新型药物。     

苦豆碱对缺氧/复氧诱导人脐静脉内皮细胞凋亡的影响

目的：探讨苦豆碱对缺氧/复氧诱导的人脐静脉内皮细胞凋亡的影响。方法：培养人脐静脉内皮细胞,随机分为对照组、缺氧/复氧组、苦豆碱（20、50和100 mg/L）预处理组和苦豆碱预处理+LY294002组,并进行相应处理。MTT法检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡,比色法检测Caspase?3活性,Western blot法检测Bax、Bcl?2、Akt和p?Akt蛋白表达。结果：苦豆碱可提高缺氧/复氧抑制的人脐静脉内皮细胞增殖（P < 0.05）,显著减少缺氧/复氧诱导的细胞凋亡（P < 0.05）,逆转缺氧/复氧引起的Caspase?3活性和Bax表达的增加、Bcl?2表达的降低,提高Bcl?2/Bax值（P < 0.05）。此外,苦豆碱预处理可明显上调缺氧/复氧降低的p?Akt蛋白表达（P < 0.05）,而PI3K/Akt抑制剂LY294002明显逆转苦豆碱抗缺氧/复氧诱导的凋亡作用（P < 0.05）。结论：苦豆碱通过激活PI3K/Akt通路抑制缺氧/复氧诱导的人脐静脉内皮细胞凋亡。     

一种改进的人脐静脉内皮细胞的培养方法

目的:建立稳定的人脐静脉内皮细胞分离和培养的方法. 方法:采用胰蛋白酶/胶原酶(1∶1)混合酶液消化法培养人脐静脉内皮细胞,简化完全培养液组分(不添加血管内皮细胞生长因子、肝素等辅助因子),当原代培养细胞80%以上汇合后用胰蛋白酶消化传代;用形态学、免疫细胞化学法进行鉴定. 结果:种植在培养瓶中的内皮细胞4h贴壁生长,48～96 h生长最快,7～10 d汇合. 内皮细胞呈单层铺路石样外观,Ⅷ因子相关抗原(Ⅷ:Ag)和内皮细胞生长因子受体2(KDR)鉴定内皮细胞纯度达95%以上. 结论:用混合酶液灌注脐静脉消化内皮细胞是获取内皮细胞的一种好方法,可靠性大,成功率高,可以构建体外研究血管内皮细胞的模型.     

益心定悸方含药血清对人脐静脉内皮细胞VEGF表达影响的研究

[目的] 通过观察益心定悸方对人脐静脉内皮细胞血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响探讨其治疗冠心病快速心律失常的作用机制, 同时为临床应用提供客观依据。[方法] 用20只雄性Wistar大鼠制备含药血清, 将内皮细胞接种在两种血清培养基上, 采用免疫组化方法测定VEGF的表达。[结果] 含药血清组细胞边界和核结构清晰细胞核颜色深染, 正常血清组VEGF仅有微弱表达。[结论] 益心定悸方能够明显促进VEGF表达, 这可能是本方治疗冠心病快速心律失常的作用机制之一。     

威麦宁对PG细胞与HUVEC黏附作用的影响

目的研究威麦宁体外对人高转移肺癌细胞(PG)与血管内皮细胞(HUVEC)黏附作用的影响,探讨其抗肿瘤转移作用机制。方法MTT法检测威麦宁对PG、HUVEC活力的影响;虎红染色法检测威麦宁对PG细胞与HUVEC黏附作用的影响,检测对肿瘤坏死因子(TNF-α)活化的HU-VEC与PG细胞黏附作用的影响。结果威麦宁(31.25、62.5 mg/L)作用PG、HUVEC 24 h后,对两种细胞的存活率即活力皆没有影响(P>0.05)。威麦宁(31.25、62.5mg/L)作用PG细胞24 h后,对HUVEC的黏附有明显抑制作用(P<0.05,P<0.01);作用HUVEC 6、12 h后,能明显降低TNF-α诱导的HUVEC对PG细胞的黏附作用(P<0.01)。结论威麦宁可能通过对PG细胞和HUVEC双重作用,抑制PG-HUVEC间的黏附,从而抑制肿瘤细胞的血道转移。