Expression of TGF-β2 mRNA and PCNA, FN Protein in Lens Epithelial Cells in Age-related Nuclear and Cortex Cataract

By using RT-PCR and immunohistochemistry, the expressions of transforming growth factor β2 (TGF-β2) mRNA, proliferating cell nuclear antigen (PCNA) and fibronection (FN) protein in lens epithelial cells (LECs) of age-related nuclear and cortex cataract were detected and compared. The results of RT-PCR revealed that the expression of TGF-β2 mRNA was higher in cortex cataract than in nuclear cataract. Immunohistochemistry demonstrated that the expression of PCNA protein was lower and the expression of FN protein was higher in cortex cataract than in nuclear cataract. It was suggested that TGF-β2, PCNA and FN might take important parts in the process of age-related cataract. Cortex cataract was related to the transdifferentiation of LECs, and nuclear cataract to the proliferation of LECs.     

转化生长因子β1和基质金属蛋白酶2在糖尿病性白内障大鼠晶状体上皮细胞中的表达及意义

目的 探讨糖尿病性白内障大鼠晶状体上皮细胞(lens epithelial cells,LECs)中转化生长因子β1(transforming growth factor β1,TGF-β1)和基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinase-2,MMP-2)的表达情况及其意义。 方法 将28只SD大鼠随机分为白内障组和对照组,建立糖尿病性白内障大鼠模型,观察2组大鼠LECs变化,测定2组大鼠LECs中TGF-β1和MMP-2表达情况。 结果 HE染色:白内障组大鼠LECs形态异常,排列紊乱,核大小不均匀,胞质疏松;对照组大鼠LECs正常。白内障组大鼠2周末和4周末LECs中TGF-β1蛋白和MMP-2蛋白平均光密度(0.045±0.002、0.075±0.006;0.028±0.003、0.055±0.006)均高于对照组(0.006±0.001、0.006±0.002;0.000、0.000,均P＜0.05),白内障组大鼠4周末LECs中TGF-β1蛋白和MMP-2蛋白平均光密度高于2周末(P＜0.05)。白内障大鼠LECs中TGF-β1蛋白和MMP-2蛋白呈正相关(r=0.915,P=0.004)。 结论 糖尿病性白内障的发生发展可能和LECs中TGF-β1蛋白、MMP-2蛋白水平升高有关,糖尿病性白内障LECs中TGF-β1蛋白和MMP-2蛋白呈正相关。      

Expression of TGF-β2 mRNA and PCNA, FN Protein in Lens Epithelial Cells in Age-related Nuclear and Cortex Cataract

Summary： By using RT PCR and immunohistochemistry, the expressions of transforming growth factor 132 （TGF-β2） mRNA, proliferating cell nuclear antigen （PCNA） and fibronection （FN） protein in lens epithelial cells （LECs） of age-related nuclear and cortex cataract were detected and compared. The results of RT-PCR revealed that the expression of TGF-β2 mRNA was higher in cortex cataract than in nuclear cataract. Immunohistochemistry demonstrated that the expression of PCNA protein was lower and the expression of FN protein was higher in cortex cataract than in nuclear cataract. It was suggested that TGF-β2 , PCNA and FN might take important parts in the process of age-related cataract. Cortex cataract was related to the transdifferentiation of LECs, and nuclear cataract to the proliferation of LECs.     

晶状体上皮细胞(LECs)凋亡及凋亡相关基因caspase-3表达与老年性白内障

目的 探讨晶状体上皮细胞(LECs)凋亡及凋亡相关基因caspase-3表达与老年性白内障发生的关系.方法 选择32例老年性白内障患者晶状体前囊膜标本(白内障组),同时收集高度近视患者晶状体前囊膜标本28例(高度近视组).采用免疫组化法检测两组的晶状体前囊膜组织中凋亡相关基因caspase-3的表达,并应用TUNEL法检测两组LECs的凋亡情况.结果 白内障组LECs中凋亡细胞百分率(30.4±3.7)％,明显高于高度近视组LECs中凋亡细胞百分率[(0.27±0.12)％],差异有统计学意义(P＜0.05).白内障组LECs中caspase-3蛋白的阳性表达率为84.38％,明显高于高度近视组LECs中caspase-3蛋白的阳性表达率(10.71％),差异有统计学意义(P＜0.05).等级Logistic回归分析显示:老年性白内障患者的LECs中caspase-3蛋白的表达明显高于高度近视组(P＜0.01).结论 LECs的凋亡及caspase-3的表达在老年性白内障的发生发展过程中起重要作用.     

胰岛素样生长因子-1对人晶状体上皮细胞增殖的影响

目的探讨胰岛素样生长因子-1(IGF-1)对人晶状体上皮细胞增殖的影响。方法对永生化人晶状体上皮细胞系B-3(HLEB-3)进行培养及传代,应用不同浓度的IGF-1(5、10、20、30、40、50、60μg.L-1)作用于HLEB-3细胞,在不同时间点采用四甲基偶氮唑盐比色(MTT)法检测IGF-1对HLEB-3细胞增殖的影响。采用蛋白质印迹(West-ern blotting)方法检测晶状体上皮α-肌动蛋白(α-actin)的表达。结果 IGF-1在5μg.L-1时就对HLEB-3细胞有明显的促增殖作用(P<0.05),且随着IGF-1浓度的升高,促增殖作用增加,即促增殖效应具有浓度依赖性;同时也可上调α-actin蛋白的表达,与对照组比较,各浓度组IGF-1均可显著促进α-actin蛋白表达上调(P<0.01),且随着IGF-1浓度的增加,α-actin蛋白含量逐渐升高。结论 IGF-1具有促进人晶状体上皮细胞增殖的作用,其作用强度呈浓度依赖性。     

老年核性与皮质性白内障晶体上皮细胞密度及增殖细胞核抗原表达

目的 :检测老年核性白内障和皮质性白内障晶体上皮细胞密度和增殖细胞核抗原 (proliferatingcellnucle arantigen ,PCNA)表达 ,了解这两种白内障晶体上皮细胞增殖状态。方法 :用SP免疫组化染色方法染色两组病例中央区晶体上皮铺片。用计算机图像分析系统计算上皮铺片的细胞密度。结果 :核性白内障晶体上皮细胞密度为(5 0 38± 2 6 2 .0 3)个 /mm2 ,30张铺片中PCNA阳性 2 5张。皮质性白内障晶体上皮细胞密度为 (4 2 5 0 .6 3± 2 75 .0 5 )个 /mm2 。PCNA阳性 4例。结论 :老年核性白内障晶体上皮细胞密度高于皮质性白内障。PCNA阳性率高。提示老年核性白内障晶体上皮细胞增殖状态较为活跃 ,而皮质性白内障晶体上皮细胞退行性改变明显。     

人晶状体上皮细胞凋亡时细胞外信号调节激酶表达的变化

目的研究紫外线B引起培养的人晶状体上皮细胞凋亡时细胞外信号调节激酶(ERK)蛋白表达水平的变化。方法以人晶状体上皮细胞系为研究模型,其中实验组用紫外线B照射后与对照组继续培养12h,然后通过蛋白印迹(Westernblot)法检测两组ERK酶表达的量。结果试验组上样品量明显少于对照组,而两组ERK1/2表达的量相等,故说明实验组实际ERK1/2表达量强于对照组。结论人晶状体上皮细胞在紫外线照射下发生凋亡,此时ERK1/2表达量随之增强。该研究为进一步深入研究ERK1/2在白内障和后发障形成过程中的作用打下良好基础。     

Effects of rapamycin on expression of Bcl-2 and Bax in human lens epithelial cells and cell cycle in rats

The effects of rapamycin on the expression of Bcl-2 and Bax protein in in vitro cultured human lens epithelial cells(LECs) and cell cycle were investigated in order to provide the theoretical basis for the development of new inhibitory drugs for clinical prevention and treatment of after-cataract.The cultured LECs of second and third passages were collected and treated with rapamycin.The LECs were transferred into 96-well culture plates and divided into 6 groups,and each group was set to have 8 duplicate wells.In the negative control group,the LECs were given culture medium only,and in the blank control group,only culture medium was given.In the four rapamycin-treated groups,different concentrations(20,40,60 and 80 ng/mL) of rapamycin were given.After treatment for 24,48 and 72 h,the absorbance(A) values in each well were determined by MTT assay.The cell cycles of all groups were detected by using flow cytometry.Real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction(RFQ-PCR) and Western blot were used to detect the mRNA and protein expression of Bcl-2 and Bax respectively.MTT assay showed that rapamycin could inhibit proliferation of LECs in a time-and dose-dependent manner.Flow cytometry revealed that rapamycin could block the conversion of LECs from G1 phase to S phase,resulting in the increase of cells in G1 phase and the decrease of the cells in S phase.RFQ-PCR indicated that rapamycin could down-regulate the expression of Bcl-2 mRNA,but up-regulate the expression of Bax mRNA,suggesting it could induce apoptosis of LECs.Western blot demonstrated that rapamycin could suppress the expression of Bcl-2 protein,but promote the expression of Bax protein.It is concluded that rapamycin could inhibit proliferation of LECs probably not only by blocking the progression of cell cycle,but also by promoting the induction of apoptosis.     

MMP-3,OPN和TIMP-1在白内障形成中的作用

目的：研究基质金属蛋白酶-3（matrix metalloproteinase-3，MMP-3）、骨桥蛋白（osteopontin，OPN）和金属蛋白酶组织抑制因子-1（tissue inhibitor of metalloproteinase-1，TIMP-1）在白内障晶状体上皮细胞中的表达及意义。方法：采用免疫组织化学方法测定MMP-3，OPN和TIMP-1在31例前囊下性白内障，28例核性白内障和12例正常晶状体上皮细胞中的表达。结果：MMP-3在前囊下性白内障的表达高于核性白内障、正常晶状体（Χ^2=31．49，34．479；均P=0．000），而在核性白内障与正常晶状体中无明显差剐（f=2．449，P=0．118）；OPN在前囊下性白内障的表达高于核性白内障和正常晶状体（0=29．450，15．889；均P=0．000）；TIMP-1表达在3组晶状体上皮细胞中差异均无统计学意义（P〉0．05）；前囊下性白内障MMP-3和OPN的表达水平相关（r=0．381，P=0.035），而MMP-3和OPN与TIMP-1的表达水平不相关（r=0.121，-0．289；P=0．516，0．114）。结论：MMP-3和OPN的表达增强及MMP-3／TIMP-1的表达失衡可能与前囊下性白内障的形成密切相关。     

人脑膜瘤bFGF的表达与血管生成和细胞增殖能力的关系

目的:探讨人脑膜瘤碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的表达与肿瘤血管生成和细胞增殖能力的关系.方法:应用免疫组织化学方法检测了38例脑膜瘤组织bFGF表达,分析其与肿瘤微血管形成及细胞增殖能力的关系.结果:bFGF阳性表达率和表达强度在良性、非典型和间变型脑膜瘤间均无明显差异(P>0.05).良性与非典型脑膜瘤微血管密度(MVD)值差异不显著,而间变型脑膜瘤MVD值明显高于前二者(P<0.01).bFGF表达阳性与表达阴性肿瘤的MVD值差异无显著意义.三类脑膜瘤bFGF表达分值与MVD值及与PCNA LI均不相关(P>0.05).结论:未发现脑膜瘤bFGF表达与血管生成存在明显的关系,在脑膜瘤血管生成和细胞增殖能力中bFGF的作用可能是不明显的.     

未折叠蛋白应答在晶状体上皮细胞凋亡中的作用

目的探讨内质网应激中未折叠蛋白应答在晶状体上皮细胞(hLECs)凋亡中的作用及其与白内障发病机制的关系。方法将hLECs分为对照组和实验A、B、C、D组,分别用0、1、2、5、10mmol／L的同型半胱氨酸(Hcy)作用细胞24h,应用MTT法检测不同浓度药物对细胞的增殖抑制率;应用Hoechst33258荧光染色检测细胞凋亡率;应用活性氧荧光探针DCFH-DA检测刺激后细胞中活性氧产物(ROS);应用GSH试剂盒检测刺激后细胞中还原型谷胱甘肽(GSH)的含量;应用Western blot技术检测刺激后细胞中的GRP78和Caspase-12的表达。结果不同浓度的Hcy刺激晶体上皮细胞后,细胞活力呈浓度依赖性下降,其中5mmol／L,10mmol／L Hcy可使细胞活性下降48.3％,57.7％,与对照组相比,差异具有统计学意义(P<0.01),并且能诱导细胞的明显凋亡;与对照组相比,C、D组细胞中ROS水平呈浓度依赖性升高,GSH含量减少, GRP78和Caspase-12表达显著升高(P均<0.05)。结论高浓度的内质网刺激因子可刺激晶体上皮细胞产生内质网应激,并通过未折叠蛋白应答导致晶状体上皮细胞凋亡,产生白内障。     

羟基红花黄色素A抑制异常增殖血管内皮细胞的机制研究

目的研究羟基红花黄色素A(HSYA)抑制异常增殖血管内皮细胞的作用机理。方法建立人结肠腺癌细胞LS180上清液和人脐静脉内皮细胞ECV304体外共培养模型,通过实时荧光定量PCR检测ECV304细胞中血管内皮生长因子(VEGF)及其受体(KDR)、碱性成纤维细胞生长因子(b FGF)及其受体(b FGFR)、HSPG2、p53、c-myc mRNA水平的表达;ELISA法检测细胞培养上清VEGF、VEGFR(KDR)、b FGF、b FGFR蛋白的表达。结果在共培养细胞模型中,0.66、0.33 mg/L浓度的HSYA对血管生成促进因子VEGF及其受体KDR、b FGF及其受体b FGFR和癌基因c-myc及与细胞增殖相关蛋白多糖HSPG2的mRNA表达具有抑制作用;对抑癌基因p53 mRNA的表达具有促进作用。0.66、0.33 mg/L浓度的HSYA对血管生成促进因子VEGF及其受体KDR、b FGF及其受体b FGFR的蛋白表达具有抑制作用。结论 HSYA抑制新生血管的生成、抑制共培养模型中血管内皮细胞的异常增殖,其可能的作用机理是通过调控VEGF及其受体、b FGF及其受体、HSPG2、c-myc和野生型p53的表达发挥抗肿瘤作用,揭示HSYA可能是潜在的肿瘤血管生成抑制剂。     

PTTG和bFGF在非小细胞肺癌组织中的表达

目的探讨非小细胞肺癌（NSCLC）中垂体肿瘤转化基因（PTTG）和碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）的表达和意义。方法采用免疫组化SABC法检测PTTG和bFGF在61例非小细胞肺癌组织和20例正常肺组织中的表达。结果61例非小细胞肺癌组织中PTTG和bFGF的阳性表达率分别为68．85％（42／61）和73．77％（45／61），显著高于正常肺组织中的表达（分别为10％和15％，P〈0．05），PTTG和bFGF的表达与肿瘤细胞的分化程度和有无淋巴结转移、TNM分期显著相关，与患者年龄、性别和肿瘤组织类型无相关性；PTTG和bFGF的表达呈正相关（P〈0．05）。结论非小细胞肺癌存在PTTG和bFGF蛋白高表达，提示PTTG可能通过激活bFGF表达促进微血管的形成，在肺癌发生发展中起重要作用．PTTG基因有望成为肺癌新的肿瘤分子标记和基因治疗的靶点．     

不同浓度bFGF对体外培养人牙髓细胞增殖的影响

目的：探讨不同浓度碱性成纤维细胞生长因子(bFGF) 对体外培养人牙髓细胞增殖的影响，为寻求最佳影响浓度提供参考依据。方法：以常规组织块培养法体外获得牙髓细胞,随机分为5组，实验组分别加入bFGF，使其终浓度为0.1、1.0、10.0及100.0 μg•L^-1，无bFGF组作为阴性对照。采用MTT法分别测定各组吸光度A值，计算细胞相对增殖率（RGR），观察bFGF对牙髓细胞的增殖作用。结果：人牙髓细胞在不同浓度bFGF的作用下，除0.1 μg•L^-1bFGF组外，其他实验组RGR均高于对照组 (P<0.01)；组间比较显示10.0 μg•L^-1 bFGF组RGR最高，与1.0 μg•L^-1bFGF组比较差异有显著性(P<0.01)，但与100.0 μg•L^-1bFGF 组比较差异无显著性(P>0.05)。结论：bFGF能促进人牙髓细胞的增殖，bFGF的最小显效浓度是1.0 μg•L^-1，最佳增殖浓度是10.0 μg•L^-1。       

碱性成纤维生长因子单克隆抗体联合伊立替康抑制小细胞肺癌H223细胞的增殖

目的 探讨碱性成纤维生长因子(bFGF)单克隆抗体与伊立替康联合应用体外对抑制小细胞肺癌细胞株增殖和凋亡的作用及可能机制.方法 CCK8检测bFGF单克隆抗体联合伊立替康对小细胞肺癌株H223增殖的抑制作用.AnneginV-FITC/PI染色流式细胞仪检测新型bFGF单克隆抗体联合伊立替康对小细胞肺癌株H223凋亡的影响.Western blotting分析bFGF-mAb联合CPT-11对AKT和ERK1/2磷酸化水平的影响.结果 bFGF单克隆抗体、伊立替康剂量依赖性抑制小细胞肺癌株H223的增殖,bFGF单克隆抗体组、伊立替康组及bFGF单克隆抗体联合伊立替康组对小细胞肺癌株H223的增殖抑制率分别为18.73%、21.96%、54.30%,联合用药组抑制率明显高于单药组(P<0.05).bFGF单克隆抗体、伊立替康剂量依赖性诱导小细胞肺癌株H223的凋亡,bFGF单克隆抗体组、伊立替康组及bFGF单克隆抗体联合伊立替康组诱导小细胞肺癌株H223的早期凋亡率分别为2.7%、4.3%、6.5%,联合用药组凋亡率明显高于单药组(P<0.05).bFGF单克隆抗体组、CPT-11组及bFGF单克隆抗体联合CPT-11组可明显抑制p-AKT蛋白和p-ERK1/2蛋白的水平,差异有显著性,而对AKT、ERK1/2蛋白则影响不大.bFGF抗体联合CPT-11一方面通过抑制p-AKT蛋白和p-ERK1/2蛋白的水平来抑制肿瘤细胞的增殖和转移.结论 bFGF单克隆抗体联合伊立替康对小细胞肺癌株H223具有协同抑制作用,其机制与抑制细胞增殖和促进细胞凋亡有关.信号通路分析结果表明bFGF单克隆抗体联合伊立替康能有效阻断与bFGF相关的MAPK/ERK和PI3K/AKT信号通路.     

乙酰肝素酶和碱性成纤维细胞生长因子在口腔鳞癌中的表达

目的: 通过实验对比口腔鳞癌(OSCC)和口腔正常黏膜中乙酰肝素酶(Hpa)、碱性成纤维细胞生长因子(Factor,bFGF)的表达和微血管密度(MVD)的关系,从而了解OSCC中Hpa在肿瘤血管生成中的作用,为OSCC的研究及其治疗提供理论依据.方法:选用正常人口腔黏膜组织10例,经手术切除及活检的OSCC标本48例,采用免疫组织化学的方法检测Hpa、bFGF的表达,用CD31抗体进行血管内皮染色,计数微血管密度,分析Hpa、bFGF在不同组织中的表达、其相互关系及二者与MVD和OSCC组织分化程度、浸润深度、淋巴结转移的关系.结果:(1)在OSCC组织中Hpa、bFGF的阳性表达分别为35例(72.92%)、38例(79.17%),均显著高于在正常口腔黏膜组织中的表达(P＜0.05);(2)Hpa表达与肿瘤的淋巴结转移和浸润深度密切相关(P＜ 0.05), bFGF蛋白表达与淋巴结转移相关(P＜0.05);(3)Hpa、bFGF阳性表达的OSCC组织中MVD显著高于阴性表达组(P＜0.05).Hpa和bFGF的表达显著相关(P＜0.001),且两者的表达都与MVD呈显著相关(P均＜0.001).结论:Hpa与bFGF在OSCC中同时表达,与血管生成密切相关,对OSCC的生长、浸润和转移有促进作用,Hpa可作为反映OSCC生物学行为的客观指标.     

腺病毒介导的碱性成纤维细胞生长因子对人骨关节炎软骨细胞的作用

目的:探讨腺病毒介导的人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对体外培养的人骨关节炎(OA)软骨细胞的转染及其作用。方法:人OA软骨细胞分为3组:OA对照组、绿色荧光蛋白(EGFP)对照组及bFGF转染组。采用含bFGF的腺病毒载体转染人OA软骨细胞,48 h后通过流式细胞术分析腺病毒转染软骨细胞的效率,绘制转染效率曲线。6 d后检测培养基中bFGF的浓度及软骨细胞增殖;观察软骨细胞蛋白多糖及Ⅱ型胶原的表达。结果:腺病毒介导的bFGF可高效转染人OA软骨细胞并在细胞外表达。与OA对照组相比,bFGF转染后可明显促进软骨细胞的增殖(P<0.05);同时增加了软骨细胞蛋白多糖和Ⅱ型胶原的生物合成(P<0.05)。结论:腺病毒介导的bFGF可促进OA软骨细增殖,增强细胞基质的合成,对软骨细胞表型的维持具有重要作用。     

骨骼肌卫星细胞的体外培养

目的:探讨GH,HGF,bFGF,TGF,IGF-Ⅰ等多种生长因子联合使用对体外培养人骨骼肌卫星细胞增殖能力的影响。方法:选取临床手术切取的儿童肌肉活检标本20例,实验分为4组:TGF+IGF-Ⅰ组(5例);bFGF+TGF-β组(5例);GH+HGF组(5例);GH,HGF,bFGF,TGF,IGF-Ⅰ组(5例)。进行体外骨骼肌卫星细胞的培养,然后在培养基中分别加GH,HGF,bFGF,TGF,IGF-Ⅰ等生长因子,采用MTT法测TGF+IGF-Ⅰ、bFGF+TGF-β、GH+HGF及GH,HGF,bFGF,TGF,IGF-Ⅰ对骨骼肌卫星细胞增殖的影响。结果:在体外培养过程中,GH,HGF,bFGF,TGF,IGF-Ⅰ联合使用促进骨骼肌卫星细胞增殖的作用明显高于TGF+IGF-Ⅰ组、bFGF+TGF-β组及GH+HGF组,差异有显著性(P<0.01);而TGF+IGF-Ⅰ组与bFGF+TGF-β组;TGF+IGF-Ⅰ组与GH+HGF;bFGF+TGF-β组与GH+HGF组骨骼肌卫星细胞的增殖能力比较,差异无显著性(P>0.05)。结论:TGF+IGF-Ⅰ组;bFGF+TGF-β组及GH+HGF组作用对体外培养大鼠骨骼肌卫星细胞有增殖作用,但其作用较弱,而GH,HGF,bFGF,TGF,IGF-Ⅰ联合使用对骨骼肌卫星细胞增殖作用明显。本实验为体外对骨骼肌卫星细胞的增殖能力提供了重要的实验依据。     

碱性成纤维细胞生长因子在P物质诱导肉芽组织成纤维细胞增殖中的作用

目的探讨感觉神经肽P物质(substance P, SP)对碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)表达的调控作用及其在SP促离体培养的肉芽组织成纤维细胞增殖中的作用.方法采用MTT法测定SP对原代培养的肉芽组织成纤维细胞的促增殖作用;采用RT-PCR和Western blotting方法检测SP对成纤维细胞bFGF基因和蛋白表达的调控作用,观察时间及剂量-效应关系.结果 10-9～10-5mol/L的SP在体外对原代培养的肉芽组织成纤维细胞均具有明显的促增殖作用(P<0.01),且具有明显的剂量依赖性(r=0.594,P<0.01),bFGF抗体只能部分抑制这一作用(与对照组比较,P<0.01; 与10-7mol/L SP组比较, P<0.05).10-7mol/L SP可诱导成纤维细胞bFGF mRNA的表达,在作用后3,6 h与对照组相比,差异有非常显著性意义(P<0.01);12 h后可检测到bFGF蛋白明显表达增强(P<0.01),24 h达高峰,48 h后逐渐有所回落.SP在10-9～10-5mol/L范围内可显著促进成纤维细胞bFGF mRNA表达,在10-8～10-5mol/L范围可诱导bFGF蛋白的表达,均在10-7 mol/L剂量点达到峰值(P<0.01).结论 SP对肉芽组织成纤维细胞具有明显的促增殖作用,这种作用与其诱导内源性 bFGF表达有关.