携带尤文肉瘤EWS-FLI-1结合序列的DTA表达载体构建及其对尤文肉瘤细胞杀伤作用的研究

目的研究尤文氏肉瘤EWS-FLI-1融合蛋白的特异结合序列与DTA基因融合后的表达及对尤文肉瘤细胞的杀伤作用,为肿瘤基因治疗探索新的治疗方法.方法构建含有EWS-FLI-1特异结合序列和白喉毒素A链基因的表达载体pS2-DTA.转染尤文肉瘤细胞以及对照细胞后检测DTA表达及其对细胞的杀伤作用.结果表达载体pS2-DTA在尤文肉瘤细胞系中高表达并产生强烈的杀伤作用.结论 pS2-DTA可以对尤文肉瘤细胞产生选择性杀伤作用,抑制其生长,对尤文肉瘤的治疗有潜在的应用价值.     

EWS-FLI 1介导DTA基因在尤文肉瘤移植瘤裸鼠模型体内特异表达研究

目的观察EWS-FLI1介导的白喉毒素A链基因(diphtheria toxin A chain gene,DTA)在尤文肉瘤裸鼠移植瘤模型体内特异表达情况.方法采用尾静脉注射给药,将含有EWS-FLI1特异结合序列ACCGGAAGT和白喉毒素A链基因的真核表达载体pS2-DTA导入尤文肉瘤裸鼠移植瘤模型体内,通过免疫组化及RT-PCR检测DTA的表达情况.结果DTA在肿瘤组织中有高表达,肝组织中有弱表达,心肌组织中表达结果为阴性.结论EWS-FLI1介导的DTA可在尤文肉瘤裸鼠移植瘤内特异表达.     

含人乳癌DF3/MUC1启动子转录调控序列和白喉毒素A链基因表达载体的构建

目的：构建含人乳癌DF3／MUC1启动子转录调控序列和白喉毒素A链(DTA)基因的重组表达载体。方法：利用PCR技术从人乳癌细胞MCF-7中扩增出DF3／MUC1启动子的转录调控序列并克隆入pMD18T载体中,再从pMD18T-DF3重组质粒中切下DF3／MUC1启动子的转录调控序列并亚克隆入pGL3-Basic载体,构建重组质粒pGL3-DF3。从质粒pIBI30-DTA中切下DTA片断,以DTA基因替换重组质粒pG13-DF3中的虫荧光素酶基因,构建重组质粒pGL3-DF3-DTA。结果：构建了含人乳癌DF3／MUC1启动子转录调控序列和DTA的表达载体,酶切和测序结果与预期完全相符。结论：重组质粒pGL3-DF3-DTA构建成功。     

白喉毒素A基因转染对人肺腺癌细胞体内外生长的影响

目的:探讨白喉毒素A(DTA)基因在肺腺癌基因治疗中的作用.方法:①体外细胞毒试验:对转染DTA基因的人肺腺癌细胞A549(A549/DTA)、转染空载体的人肺腺癌细胞A549(A549/DTA-)和野生型A549,采用MTT法测定四环素作用72 h后的细胞存活率.②动物实验:将1.2×107的A549细胞接种于裸鼠皮下,当肿瘤长至约350 mg时,随机分组:转DTA基因治疗组,荷瘤裸鼠每次给予含DTA基因的病毒上清0.4 ml瘤体注射;空载体组给予0.4 ml含空载体的病毒上清;对照组给予0.4 ml生理盐水,均2 d 1次,连续3周;从开始注射病毒上清之日起,每周2次测量肿瘤大小,按公式计算肿瘤相对质量.3周后处死动物,瘤组织作病理分析.结果:①细胞存活率:转空载体的A549与野生型A549形态无明显改变,而转染DTA基因的A549细胞体积明显缩小,并有细胞碎片.②瘤体注射DTA基因的病毒上清可使皮下肿瘤显著缩小,从注射之日起至21 d,肿瘤体积缩小,而空载体组、对照组在相同时间内肿瘤体积增加.转DTA基因治疗的瘤组织出现了细胞坏死和凋亡,而空载体组及对照组瘤组织无坏死及细胞凋亡征象.结论:四环素调控白喉毒素A基因对肺腺癌有一定的治疗作用.     

Secretory expression of recombinant diphtheria toxin mutants inB. Subtilis

Summary Three diphtheria toxin (DT) mutants CRM-197, DT-del (148) and DT-EH8S-K516A-F530A were cloned inB. Subtilis plasmid PSM604 under the subtilisin signal sequence. The expression was effective in both SMS300 and SMS118, but higher yield of 7. 1 mg/L was observed in SMS300 compared with 2. 1 mg/L in SMS118. Western blot showed that the recombinant protein could be effectively secreted into the culture medium as a 58 ku peptide, and could be degraded into two peptides of 37ku and 21ku.     

重组质粒PGL3-DF3-DTA对乳腺癌荷瘤裸鼠的治疗研究

目的 探讨重组质粒PGL3-DF3-DTA对乳腺癌移植模型的治疗作用.方法 裸鼠皮下接种MCF-7人乳腺癌细胞,建立人乳腺癌移植模型.用质粒PGL3-DF3-DTA,质粒PGL3-DF3和生理盐水分别给裸鼠移植瘤瘤内多点注射.观察肿瘤大小和组织形态学变化,并用流式细胞仪检测肿瘤细胞凋亡改变.结果 重组质粒PGL3-DF3-DTA组裸鼠乳腺癌生长受到明显抑制,抑制率为50.08%,肿瘤细胞的凋亡率增加.结论 重组质粒PGL3-DF3-DTA对裸鼠人乳腺癌移植瘤的生长具有明显抑制作用,为乳腺癌基因治疗提供了新的方法.     

含EWS-FLI1结合序列的DTA载体对报告基因表达抑制的研究

目的 研究含尤文家族肿瘤EWS-FLI1结合序列的DTA载体对报告基因表达的抑制作用.方法 构建含有EWS-FLI1结合序列和白喉毒素A链基因的表达载体pS2-DTA.共同转染不同剂量梯度的pS2-DTA和pS2到尤文肉瘤细胞和对照细胞,检测荧光强度.结果 每增加一个pS2-DTA剂量梯度,在尤文肉瘤细胞中都可以检测到虫荧光素酶的表达显著降低,而在对照细胞中这种作用却不明显;在同一个pS2-DTA剂量梯度下,虫荧光素酶在尤文肉瘤细胞的表达都显著高于非尤文肉瘤细胞.结论 pS2-DTA转染可以抑制尤文肉瘤细胞内其它基因表达.     

艰难梭茵毒素基因3''''末端重复区域基因片段的PCR克隆

目的探寻一种简单、快速、灵敏的检测艰难梭菌的方法.方法以艰难梭菌毒素A和毒素B基因3'末端高度保守重复区分别设计一对引物,进行PCR反应,同时在同一体系相同反应条件下使用相同引物分别以大肠杆菌和乳杆菌DNA为模板进行扩增,比较二者结果.结果从艰难梭菌成功克隆了毒素A基因3'端重复区域960 bp的基因片段及毒素B基因3'端重复区域1851 bp的基因片段,不同来源的菌株出现了相同的2条电泳带,并通过测序鉴定;而对照的大肠杆菌和乳杆菌株无特异电泳带出现.结论从艰难梭菌毒素A、毒素B基因3'末端重复区域克隆的基因片段具有保守性,可以作为基因探针在临床上进行艰难梭菌检测,该方法简便、灵敏,可直接用粪便标本进行检测.此外,这些基因编码的多肽具有较高的疏水性并存在着膜受体结合区域,可以此为基础进行基因工程蛋白质疫苗的研究.     

自杀基因联合细胞因子的癌症治疗

INTRODUCTION The transfer of suicide genes into tumor cells is currently being used in a variety of clinical gene therapy trials for the treatment of cancer, and suicide gene therapy is the transduction of a gene that transforms a non-toxic into a toxic substance[1].     

Relationship between the expression of connexin43 and bystander effect of suicide gene therapy in ovarian cancer

heHSV TKbystandereffecthasbeendefinedtodescribetheGCV mediateddeathofHSV TKex pressingcellsandadjacentHSV TKnegativecells .Thiseffectisconsideredaprerequisiteforthethera peuticefficacyofHSV TK /GCVtherapyowingtothecurrentlowefficiencyofdeliveryvectorstota…     

双自杀基因系统诱导乳腺癌细胞凋亡的体内外实验研究

目的探讨VEGF启动子驱动的双自杀基因体系对人乳腺癌细胞MCF-7靶向治疗作用以及该体系能否诱导体内外MCF-7细胞的凋亡。方法选择表达VEGF的MCF-7细胞和不表达VEGF的原代培养的乳腺上皮细胞，用重组腺病毒Ad—VEGFP—CD／TK感染之，荧光显微镜观察其感染效率。R．T—PCR．方法检测受感染细胞目的基因的表达，给予前药GCV和5-FC后于倒置显微镜观察，采用流式细胞仪检测细胞内DNA含量的变化。建立荷人乳腺癌的裸鼠动物模型，观察各治疗组的治疗效果，应用透射电镜观察移植瘤细胞超微结构。结果携带双自杀基因和报告基因（GFP）的重组腺病毒载体，感染复数为100时，95％以上的受感染MCF-7和乳腺上皮细胞中有GFP表达。RT—PCK检测发现MCF-7细胞有目的基因的表达。而乳腺上皮细胞无表达。倒置显微镜下观察用药组细胞出现凋亡征象；用流式细胞仪测定用药组出现典型的凋亡峰。在MCF-7裸鼠移植瘤模型中，治疗组裸鼠移植瘤的生长明显受到抑制，其余各组肿瘤生长情况无明显差别；在透射电镜下可见治疗组多量的凋亡细胞。结论体内外实验均表明VEGF启动子可调控双自杀基因体系靶向性诱导人乳腺癌细胞MCF-7细胞凋亡。     

抗大肠癌噬菌体人单链抗体的初步鉴定及序列分析

目的 :对抗大肠癌细胞的单克隆噬菌体单链抗体进行初步鉴定和测序分析。方法 :采用细胞ELISA ,免疫组化 ,DNA序列测定和计算机分析方法 ,对 5个单克隆噬菌体抗体 (CH2 73,CH2 0 5 ,CH2 0 9,CHA12 ,CH72 3)进行初步鉴定和序列分析。结果 :5个抗体均对人大肠癌细胞、人胚肾上皮细胞和其它某些人肿瘤细胞反应 ,也与人正常肝细胞有弱阳性反应 ,但不与鼠源性的癌细胞和正常细胞反应。细胞免疫组化进一步证实了ELISA结果的正确性。大肠癌免疫组化对大肠癌组织有特异性的结合反应 ,而不与正常大肠组织反应。测序结果为CH2 73ScFv全长 732bp ;V ,D ,J分别属于VH3 30 D1 2 6 JH3 linker V1 13 JL2 ,GenBank序号为AY0 2 8777和AY0 2 8996 ;CH2 0 5全长 36 6bp ,V ,D ,J分别VH1 4 6 D6 13 JH3,GenBank序号为AF35 936 5 ;CH2 0 9,CHA12和CH72 3的ScFv基因完全相同 ,全长 72 3bp ,其VH DH JH与CH2 73ScFv基因中的VH DH JH 完全一致 ,V ,D ,J分别属于VH3 30 D1 2 6 JH3 linker L2 Jκ2 ,GenBank序号为AF36 3774。结论 :噬菌体抗体具有结合人大肠癌组织和细胞的活性 ,为进一步开发临床应用人源抗肿瘤抗体和小分子抗体片段奠定基础     

编码霍乱肠毒素B亚单位基因植物表达载体的构建

目的构建含霍乱肠毒素B亚单位(CTB)基因的植物双元表达载体。方法采用高保真PCR方法调出CTB基因,定向克隆到中间载体pRTL2,经测序证实核酸序列正确后,再亚克隆到含植物双元表达载体pBI121上;采用电击法,将含CTB的植物表达载体转入根癌农杆菌中,并进行酶切证实。结果PCR扩增的CTB片断亚克隆到中间载体,得到pRCTB和pRCTBK,测序证实CTB核酸序列正确;再与根癌农杆菌双元载体pBI121连接,获得含CTB基因的植物双元表达载体pBI-CTB和pBI-CTBK,转入根癌农杆菌的载体,酶切证实正确。结论采用正确技术路线,构建了含CTB基因的植物表达载体,为下一步的转基因植物表达研究打下了坚实的基础。     

HMGB1 B盒编码序列的克隆和大肠杆菌表达

目的：克隆小鼠高迁移率族蛋白1(high mobility group box 1,HMGB1)B盒编码序列并在大肠杆菌中表达GST—B盒融合蛋白．方法：从新生小鼠肺组织提取总RNA,经RT—PCR获得HMGB1 B盒编码序列．将酶切后PCR产物克隆到pGEX-4T-2载体的BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ位点之间,经双酶切鉴定后测序证实．用pGEX-4T-2-B转化BI21(DE3)感受态细胞,在30℃经IPTG诱导表达5h后进行SDS-PAGE分析．结果：测序结果证实成功获得了小鼠HMGB1 B盒编码序列,其序列与GenBank中报道序列完全一致．SDS-PAGE分析表明,在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达了GST-B盒蛋白,表达量约占菌体总蛋白的30％,结论：成功克隆小鼠HMGB1 B盒编码序列并在大肠杆菌中获得了高效表达。     

c-Myc基因在人非小细胞肺癌中的表达及基因沉默抑制H1299细胞效果的实验研究

目的:分析人非小细胞肺癌(non-small cell carcinoma,NSCLC)组织中c-Myc基因的表达,探讨沉默c-Myc基因在非小细胞肺癌基因治疗中的前景?方法:应用实时荧光定量PCR法检测84例非小细胞肺癌组织及其相应癌旁组织中c-Myc基因mRNA的表达情况?通过脂质体LipofactAMINE2000将c-Myc基因siRNA瞬时转染至非小细胞肺癌H1299癌株细胞中,顺铂(Cisplatin,cis)药物毒性实验验证c-Myc基因沉默对肿瘤细胞的抑制效果?应用RT-PCR检测H1299细胞中c-Myc基因RNA的表达,CCK-8法检测抑制细胞的效果?结果:非小细胞肺癌组织中c-Myc基因mRNA的表达水平高于相应的癌旁组织,差异有统计学意义(P < 0.05)?c-Myc siRNA瞬时转染后的H1299细胞中,c-Myc基因mRNA的表达水平显著下降(P < 0.05)?将c-Myc基因沉默和顺铂联合使用,还可以显著提高顺铂对H1299细胞增殖的抑制效果(P < 0.05)?结论:c-Myc基因在非小细胞肺癌组织中的表达水平明显高于相应癌旁组织,沉默c-Myc基因能显著提高顺铂抑制非小细胞肺癌H1299 细胞增殖的作用,c-Myc基因有可能成为NSCLC基因治疗的新靶点?     

基于“伏毒”学说的扶正祛毒法防治恶性肿瘤转移的理论探讨

肿瘤干细胞存在于肿瘤组织中,其自我更新及分化等生物学特性使之在恶性肿瘤的形成与转移过程中发挥着不容忽视的作用.由于恶性肿瘤在临床中含有起病隐匿,易转移,预后差等特点,具有伏而发病,病情深重和病势易变的“伏毒”特征,故将中医伏毒学说与恶性肿瘤及肿瘤干细胞病理特性相结合进行理论阐释,结合正虚毒结的临床常见证型及历代医家学术总结,提出扶正祛毒法作为防治恶性肿瘤转移的基本治则,为进一步科学论证提供理论支持.     

Adenoviral mediated suicide gene transfer in the treatment of pancreatic cancer

Objective To determine the efficacy of adenovirus- mediated suicide gene transduction comb ined with prodrug 5- fluorocytosine (5FC) as a therapeutic protocol for pancreat ic cancer. Methods Cytosine Deaminase(CD) gene was cloned into pAdTrack- CMV- CD, pAdTrack- CMV- CD and pAdEasy- 1 were recombined in bacteria. The newly recombined adenovirus (A d)- CD containing green fluorescent protein (GFP) were packaged and propagated i n 293 cells and purified by cesium chloride gradient centrifugation. Human panc reatic carcinoma cell line- Patu8988 was infected with this virus, then 5FC was added. XTT assay was used to estimate relative numbers of viable cells. In viv o model of pancreatic cancer was established by injecting 1. 0×10[7] Patu8988 c ells subcutaneously in Balb/c nude mice. When tumors were palpable, Ad- CD was injected into each tumor and 5FC was administered. Results Positive clones were selected using endonuclease to digest the recombinants and the concentration of viral liquids containing the CD gene was 2×10[11] pfu /ml. Significant cytotoxic activity as shown for 5FC in the CD gene transduced 8988 cell line, while little effect was found in the nontransduced pancreatic ca rcinoma cells. Antitumor effect was observed in Patu8988 xenograft nude mice wi th in situ CD gene transduction. Conclusions CD gene mediated by adenovirus has high infectivity and may be useful for gene t herapy in pancreatic carcinoma. These data demonstrate the use of an enzyme pro drug strategy in experimental pancreatic cancer.     

B细胞淋巴瘤患者外周血免疫球蛋白重链基因重排检测

目的:评价B细胞淋巴瘤(B-NHL)患者外周血免疫球蛋白重链(IgH)基因重排检测的应用价值.方法:收集慢性淋巴结炎患者(10例)、健康体检者(16例)和病理活检确诊为B-NHL的患者(28例)外周血,PCR法检测IgH基因重排,观察B-NHL患者治疗前后IgH基因重排的变化.结果:B-NHL患者IgH基因重排阳性率为67.9%(19/28),高于骨髓涂片细胞形态学检查阳性率32.1%(9/28),差异有统计学意义(P＜0.05),健康体检者及慢性淋巴结炎患者均为阴性.15例外周血单克隆IgH基因重排阳性者,治疗后10例完全缓解(CR).10例CR中,9例IgH基因重排转阴.结论:外周血IgH基因重排在B-NHL辅助诊断和预后评估等方面具有重要的临床价值.     

融合自杀基因CDglyTK治疗喉癌的体外实验研究

目的 研究融合自杀基因CDglyTK治疗喉癌。方法 PCR扩增、酶切、连接、转化等构建质粒表达栽体pcDNA3．1（-）CMVCDglyTK，XhoⅠ／HindⅢ酶切鉴定，测序分析CDglyTK基因序列。建立稳定表达CDglyTK基因的Hep-2细胞株，RT—PcR及Western-blotting鉴定CDglyTK基因的表达。MTT法观察5-FC、GCV、5-FC＋GCV对表达CDglyTK基因的Hep-2细胞生长的抑制作用。结果 酶切和基因测序分析证明重组质粒含完整的CD及TK基因，RT—PCR从转染细胞总RNA中扩出707bp的预期片段。West—era-blotting检测到该基因表达的59kDa的蛋白。表达CDglyTK基因的Hep-2细胞在5一FC、GCV、5-FC＋GCV干预下生长受到抑制，5-FC与GCV联合有更强的杀伤效应。结论 CDglyTK融合自杀基因可以成为基因治疗喉癌的有效方法。