人干燥综合征B抗原在巴斯德毕赤酵母菌中的高效分泌表达研究

目的：通过基因克隆在巴斯德毕赤酵母菌中表达人干燥综合征B（SS—B）抗原。方法：PCR扩增SS—B基因，与酵母菌表达载体pPIC9k重组，构建表达质粒pPIC9k—SS—B。用电穿孔法转化酵母菌SMD1168，在MD平板上筛选重组克隆，用G418快速筛选高拷贝转化子，阳性克隆经甲醇诱导表达后，培养上清用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS—PAGE）和免疫酶斑点法鉴定。结果：PCR产物约为1200bp，与预期1224bp接近；pPIC9k—SS-B重组阳性克隆测序结果与GenBank核酸数据库报道完全一致，双酶切鉴定正确。表达产物SS-B的相对分子质量约48000，高拷贝毕赤酵母菌转化菌显著高于低拷贝的表达水平，表达量占分泌总蛋白的60％以上，产物浓度为800～900mg／L。免疫酶斑点法证实表达产物具有天然SS—B分子的免疫原性。阴性对照菌未见目的表达条带。结论：SS—B存巴斯德毕赤酵母菌中获得高效分泌表达，为下一步研究打下了基础。     

人TALL-1基因在毕赤酵母中的分泌表达与鉴定

目的 研究在毕赤酵母(Pichia Pastoris)系统中人TALL-1基因的分泌表达,获得具有生物活性的重组TALL-1.方法 将人TALL-1基因插入含AOX1启动子和α分泌信号肽序列的酵母表达载体pPIC9K中,用Sac Ⅰ将重组质粒线性化,电转化Pichia Pastoris GS115感受态细胞,筛选阳性整合子并进行甲醇诱导表达,采用MTY对表达产物进行初步的生物活性检测.结果 经过诱导表达条件的优化,人TALL-1在酵母培养基BMMY中实现了分泌表达;免疫印迹和酶联免疫检测结果显示,重组产物可以结合其特异抗体;生物学活性检测证实其可抑制Hela细胞增殖.结论 在毕赤酵母系统中实现了人TALL-1的分泌表达,具有生物学活性的重组TALL-1分子可以用于进一步的结构与功能研究.     

重组sCR1在毕赤酵母细胞中的表达、纯化及鉴定

目的:酵母细胞SMD 1168表达人sCR1,并对重组蛋白进行纯化。方法:从人外周血中提取总RNA,应用RT-PCR获得人sCR1全长cDNA,将其克隆入真核表达载体pPIC9K,构建含人sCR1的重组质粒(pPIC9K-sCR1);经测序鉴定正确后,将重组质粒转化入毕赤酵母菌细胞SMD 1168中,经甲醇诱导,表达产物经SDS-PAGE分析及W estern b lot鉴定,并通过N i2+-NTA agarose亲和层析纯化。结果:经甲醇诱导的含pPIC9K-sCR1的酵母细胞表达出重组人sCR1的融合蛋白,48~72 h sCR1融合蛋白表达量最高。此蛋白在凝胶上表现为M r大于31 KDa的蛋白区带,在W estern b lot分析中可被sCR1的CD35单克隆抗体(mAb)识别。经N i2+-NTA agarose亲和层析纯化后得到较纯的sCR1融合蛋白。结论:人sCR1融合蛋白在酵母细胞表达系统中的高水平表达,并且有与人体天然蛋白相同的抗原活性。     

重组人HBNF的表达和提纯及其生物活性的测定

目的 通过酵母表达系统表达重组人亲肝素性促轴突生长因子(heparin—binding neuritepromoting factor，HBNF)蛋白并检测其生物活性。方法 将重组表达质粒pPIC9k／HBNf通过电穿孔法转入酵母表达系统GSI15，利用G418筛选高拷贝子用于大量表达HBNF、蛋白，再检测其生物活性。结果 通过G418筛选出抗性大于2mg／mL的高拷贝子，大量表达、提纯后获得相对分子质量约18000蛋白，Western—blot证实为HBNF蛋白，生物活性检测显示提纯HBNF有显著的神经营养作用。结论 通过酵母表达系统获得的重组人HBNF有一定的生物活性。     

人组织因子在毕赤酵母中的表达和纯化

 目的 制备具有凝血活性的重组人组织因子（recombinant tissue factor, r-TF） 用于构建 PT 试剂盒。 方法 将人组织因子胞外区编码基因与酵母表达载体重组，构建酵母表达质粒 pPIC9K-TF，利用电穿孔法转化宿主菌 Pichia pastoris GS115，转化子经 G418 抗性筛选后，获得高表达克隆。工程菌在摇瓶中经甲醇诱导，表达 r-TF，表达产物经纯化后，鉴定生物活性。 结果 SDS-PAGE 证实表达产物的分子量为 37000-45000,Western-Blot证明其为人组织因子衍生物，纯化后，r-TF 经脂化后，具有促凝血活性，为研制凝血活酶时间测定试剂盒及研究 TF 的构效关系创造条件。 结论 用毕赤酵母高效表达具有活性的rTF，表达量达到182mg/L。纯化工艺简便易行，蛋白回收率高，纯化后的rTF可用于组装PT测定试剂盒。     

人EGFR配体结合区在Pichia酵母中的表达

目的采用基因工程方法构建基因工程菌制备人EGFR配体结合区蛋白。方法 自人肿瘤细胞SK中获取人EGFR cDNA,构建pPIC9K酵母表达栽体,采用Piehia酵母真核表达系统表达目的蛋白。结果SDS-PAGE及Western-blot结果显示目的蛋白已成功表达。结论在Piehia酵母中成功表达人EGFR配体结合区蛋白。     

人溶菌酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

目的：利用巴斯德华赤（Pichia pastoris）酵母真核表达系统,构建真核表达载体pPIC9K与人溶菌酶基因（humanlysozyme,hLY）的重组质粒pPIC9K-hLY,表达出具有活性的人溶菌酶。方法：此项研究在本实验室构建的人溶菌酶（hLY）基因与pUC19的重组质粒pUC19-hLY的基础上,通过设计一对引物,用多聚酶链式反应（PCR）扩增出人溶菌酶全基因片段后,将其克隆到巴斯德毕赤酶母分泌型表达载体pPIC9K中,构建重建质粒pPIC9K-hLY,经Bg1Ⅱ酶切线性化后,用电穿孔法将其转入毕赤酵母细胞内。通过G418筛选,选到的高拷贝转化子经PCR检测人溶菌基因与毕赤酵母染色体是否稳定整合,阳性克隆经甲醇诱导进行表达。结果：序列测定,经PCR扩增后的人溶菌酶基因与献发表的序列相比,缺失4个碱基。我们决定采用重组PCR法予以纠正,经序列测定结果正确。用PCR检测,人溶菌酶基因与毕赤酵母染色体稳定整合。用甲醇诱导表达并以SDS－PAGE分析,在Mr为15000左右出现一条蛋白带,表达量约占上清总蛋白的0．47。Western Blot证实表达产物具有天然人溶菌酶的抗原性。用黄色小球菌平板溶圈法鉴定表态产物具有人溶菌酶的活性。结论：成功的构建了重组质粒pPIC9K-hLY并在毕赤醇母中表达了人溶酶基因。     

Expression of Human Vascular Endothelial Growth Factor Receptor Flt—1 Extracellular Domain 1—3 Loop cDNA in Pichia pastoris,Purification of the Expressed Product and Detection of Its Biological Acti

Objective:to express human vascular endothelial growth factor receptor Flt-1 extracellular domain 1-3 loop cDNA in Pichia.pastroris,and to purify the expressed product and detect its biological activity.Methods:By inserting human Flt-1(1-3 loop)cDNA coding 316 amino acid residues into Pichia pastoris expression vector pPIC9K containing AOX1 promoter and the sequences of α secreting signal peptides,a recombinant expression plasmid pPIC9K/Flt-1(1-3) was constructed and transformed to yeast host strain GS115,then His^ Muts phenotype transformant was screened out and cultured in flasks,and Flt-1(1-3) was expressed under the induction of 1% methanol.Results SDS-PAGE showed that after being induced with 1% methanol for 4d ,the expressed product existed in supernatant in the form of soluble molecule and contained 60% of total protein expresses.Western blot showed good antigenicity and specificity of expressed product.After being purifed by CM-Sepharose FF and Sephacry1 S-100 chromatography,the purity of the expressed product reached obove 90%,Biological assay proved that the expressed product could bind to hVEGF165 and inhibit the proliferation of HUVEC stimulated by hVEGF165.Conclusion:Human vascular endothelial growth factor receptor Flt-1 exracellular domian 1-3 loop was successfully expressed.The study lays f foundation for further application of the expressed product in the troduct in the treatment of vasoformation related diseases,such as tumor and diabetic retinopathy.     

人α-防御素5在毕赤酵母中分泌表达的研究

目的 探索人α-防御素5成熟肽(mHD5)在酵母中高效分泌表达的可行性.方法 PCR扩增获得酵母菌偏好的mHD5密码子序列,应用基因重组方法构建表达质粒,电击转化酵母菌株GS115,应用G418浓度梯度、表型和PCR技术筛选高拷贝转化株.经摇瓶发酵和甲醇诱导,Tricine-SDS-PAGE分析重组mHD5(rmHD5)表达量,并采用Western blot鉴定.选用琼脂扩散法检测rmHD5的抑菌活性.结果 构建了pPIC9K-mHD5酵母表达质粒.筛选得到3株His /Mut 表型,且耐受8 mg/ml G418的多拷贝转化酵母菌株,成功获得表达量约120 mg/L的发酵上清.rmHD3对大肠杆菌(EC25922)和金黄色葡萄球菌(SA25923)2种标准菌株均具有明显的抑菌活性.结论 防御素基因可以在毕赤酵母中实现分泌型离表达,此策略可能是抗菌肽工业化开发的有效途径之一.     

人补体受体1型活性片段SCR15-18在毕赤酵母中的表达、纯化及活性鉴定

目的 实现人补体受体1型(complement receptor type 1,CR1)活性片段SCR15-18在毕赤酵母中的分泌表达.方法 用PCR从原核表达质粒pET32a-sCR1-SCR15-18上扩增CR1-SCR15-18的编码基因,并克隆到毕赤酵母分泌表达质粒pPIC9,构建重组质粒pPIC9-CR1-SCR15-18,鉴定后测序;重组质粒电转化整合到毕赤酵母GS115基因组中,菌落PCR技术筛选阳性转化株;经摇瓶发酵和甲醇诱导,SDS-PAGE和Western blot鉴定目的蛋白的表达;Ni2*-NTA agarose亲和层析纯化目的蛋白,并用体外抑制补体溶血反应实验测定目的蛋白的生物活性.结果 成功构建重组表达质粒pPIC9-CR1-SCR15-18;SDS-PAGE和Western blot证实目的基因在毕赤酵母中成功分泌表达;表达产物经镍柱快速纯化后,能够明显抑制补体的体外溶血.结论 在毕赤酵母中成功实现了CR1-SCR15-18蛋白的分泌表达,该蛋白具有较高的抑制补体溶血的生物活性.     

重组融合蛋白rTMP-GH在巴斯德毕赤酵母中表达的研究

目的 实现TPO模拟肽(thrombopoietin mimetic peptide,TMP)与人生长激素(human growth hormone,hGH)的重组融合蛋白rTMP-GH在巴氏毕赤酵母中的高效表达.方法 以含有rTMP-GH核苷酸序列的原核质粒为模板,PCR方法获得rTMP-GH的编码序列,并亚克降至载体pPIC9K中,将所构建pPIC9K-rTMP-GH表达质粒转化酵母宿主细胞GS115,MD/MM平板及G418抗性筛选高表达株,然后进行试管补料分批表达,Western blot对表达产物进行鉴定,通过巨核细胞集落形成能力对其,圭物学活性进行初步检测.结果 成功构建pPIC9K-rTMP-GH表达质粒,筛选到高表达rTMP-GH重组融合蛋白的巴氏毕赤酵母细胞株,初步证实所表达产物具有刺激巨核细胞集落形成的能力.结论 成功实现了rTMP-GH融合蛋白在巴氏毕赤酵母中的高效表达.     

抗乙酰胆碱受体单链抗体与人血清白蛋白融合基因真核表达载体的构建

[目的]构建真核表达体系,提高抗人乙酰胆碱受体单链抗体(ScFv 637)与人血清白蛋白(HSA)融合基因(ScFv 637-HSA)的蛋白表达质量.[方法]扩增ScFv 637-HSA融合基因,经酶切处理后,克隆至真核载体pPIC9 K,线性化处理后,电穿孔入毕赤酵母GS 115.[结果]经电泳观察可见相对分子质量为2.6 kbp的融合蛋白ScFv 637-HSA基因和真核表达载体pPIC9 K基因片段.[结论]ScFv637-HSA基因已准确地整合到毕赤酵母染色体基因组中.     

Expression of Human Vascular Endothelial Growth Factor （VEGF165）in pichia pastoris and Its Biological Activity

Objective :To express human vascular endothelial growth factor(hVEGF165) cDNA in Pichia pastroris,purify the expressed product and detect the biological activity of it.Methods:By inserting hVEGF165 cDNA coding 165 amino acid esidues into Pichia pastoris expression vector pPIC9K containing AOX1 promoter and the sequences of α secreting signal peptides,a recombinant expression plasmid pPIC9K/hVEGF165 was constructed and transformed to yeast host strain KM71,then multiple-copy insert transformants were screened out and cultured in flasks,and hVEGF165 was expressed under the induction of 1% methnol.Results:SDS-PAGE showed that after being induced with 1% methanol for 4d,the expressed product existed in supernatant in the form of soluble molecule and contained 60% of total protein expressed.Western blot showed good antigenicity and specificity of expressed product.After being purified by Heparin-Sepharose CL6B affinity chromatography,the purity of expressed product reached above 90%,Biological assays proved that the expressed product could stimulate the proliferation of HUVEC.Conclusion:hVEGF165 was successfully expressed.The study opened up a wide prospect for the application of VEGF165 in the prevention and treatment of ischemic heart disease and other tissue ischemic diseases such as secondary arterial occlusion in limbs.     

人类TAP2基因克隆及真核表达质粒的构建

目的 克隆抗原处理相关转运体亚基TAP2基因片段并构建真核表达载体。方法 从EB病毒刺激的人B淋巴母细胞系(B-LCL)中提取总RNA,用RT-PCR从中扩增出TAP2 cDNA。将TAP2 cDNA插入表达载体pcDNA3．1／VS-His-TOPO中,构建重组表达载体pcDNA3．1／V5-His-TOPO-TAP2,并进行测序分析。结果 经RT-PCR和测序鉴定,成功地克隆了人TAP2 cDNA。结论 获得了人TAP2 cDNA并构建了重组真核表达载体,对TAP2基因产物在体外表达、进一步研究TAP2分子在肿瘤基因治疗方面的作用具有重要的意义。     

SARS病毒S蛋白N端片段真核载体的构建及酵母表达菌株的建立

目的：构建SARS冠状病毒S蛋白N端1～501bp的真核表达载体,并分析其在毕赤酵母GS115中的表达情况.方法： 用PCR方法从质粒pGEX-6P-1＋SARS-S上扩增出S编码基因片段,克隆至真核表达载体pPIC9上,构建重组质粒pPIC9＋SARS-S.重组质粒经酶切鉴定和核苷酸测序鉴定后,转化毕赤酵母GS115,用甲醇诱导重组S蛋白片段表达.结果： 酶切鉴定及核苷酸序列测定表明重组真核表达质粒的构建完全正确.对甲醇诱导后重组毕赤酵母培养上清行SDS-PAGE电泳分析,在相对分子量约为41 000处有重组蛋白的表达.结论： SARS冠状病毒S蛋白N端1～167aa在毕赤酵母中获得了高效、分泌性表达.     

人羧肽酶A1活性中心的毕赤酵母可溶表达

目的:应用毕赤酵母表达系统表达人羧肽酶A1(carboxypeptidase A1,CPA1)活性中心蛋白.方法:从pGEX-CPA1重组质粒中扩增出CPA1活性中心基因,亚克隆入酵母表达载体pPIC9K,酵母重组表达载体pPIC9K-CPA1active center电转化入毕赤酵母SMD1168,并进行营养缺陷筛选和G418抗性筛选,对高拷贝整合的重组酵母表达菌株诱导表达.结果:构建得到酵母融合重组表达载体pPIC9K-CPA1active center,经G418浓度梯度筛选得到串联整合16个重组表达载体的重组酵母表达菌株,诱导表达后得到CPA1活性中心蛋白.结论:在毕赤酵母中成功表达了CPA1活性中心,为进一步研究CPA1活性中心在抗体导向酶-前体药物疗法中的应用打下了基础.     

东海贻贝抗菌肽Myticin A基因的克隆表达及其生物学活性

目的:在毕赤酵母表达系统中表达贻贝抗菌肽Myticin A并检测其生物学活性.方法:提取贻贝总mRNA,逆转录合成cDNA,PCR扩增得到DNA片段.PCR产物与pMD18-T连接,得到阳性重组载体pMD18-Myticin A.Myticin A基因插入载体pPIC9K中,得到的重组载体pPIC9K-Myticin A转化至宿主菌中.得到高抗性阳性菌株并进行诱导表达.发酵上清进行Tricine-SDS-PAGE分析并用CM-sepharose柱和Sephadex G-25柱纯化,Western印迹法鉴定并检测生物学活性.结果:获得重组载体pPIC9K-Myticin A.高抗性多拷贝阳性表达菌株GS115/pPIC9K-Myticin A经甲醇诱导后,Tricine-SDS-PAGE证实其相对分子质量为4 500,表达量为14%以上,纯化后纯度达到90%以上.Western印迹法证实所表达样品为Myticin A.表达样品对巨大芽胞杆菌的生长有抑制作用,对小鼠成纤维细胞(L929)、胰腺癌细胞(SW1990)、结肠腺癌细胞(LoVo)的生长均有明显抑制作用.结论:应用毕赤酵母表达系统能较好地表达抗菌肽Myticin A,生物学活性研究证实其具有抗革兰阳性菌作用,明显抑制肿瘤细胞生长.     

人胎盘生长因子2在毕赤酵母中的表达和纯化

为获得真核表达的重组人胎盘生长因子2(PIGF-2)纯化蛋白样品,采用基因工程方法构建重组人PIGF-2酵母表达载体pPIC9K-PIGF-2,电转后筛选阳性克隆,经甲醇诱导表达、肝素亲和柱色谱分离纯化得到蛋白纯化样品,经SDS-PAGE和Western blot鉴定,该蛋白为重组人PIGF-2纯化蛋白,表明该法可用于制备分泌表达的hPIGR-2。     

NDRG2蛋白的毕赤酵母可溶表达与纯化

目的：酵母表达并纯化可溶性NDRG2蛋白。方法：从pRSET-A-ndrg2重组质粒中扩增出6his-ndrg2融合基因，克隆入酵母表达载体pPIC3.5K；酵母重组表达载体pPIC3.5K-6his-ndrg2电转化入毕赤酵母GS115，并进行营养缺陷筛选和G418抗性筛选；对高拷贝整合的重组酵母表达菌株诱导表达，可溶性表达产物经Ni-NTA亲合层析纯化。结果：构建得到酵母融合重组表达载体pPIC3.5K-6his-ndrg2；经G418浓度梯度筛选得到串联整合16个重组表达载体以上的重组酵母表达菌株；诱导后表达得到6his-NDRG2融合蛋白，并成功纯化得到可溶性表达产物。结论：表达并纯化得到可溶性NDRG2蛋白，为进一步研究NDRG2的结构与功能打下了必要的基础。