BTG2基因重组慢病毒载体的构建及其在肺癌A549细胞中的表达与功能

目的 构建重组慢病毒载体pCDH-BTG2,并检测其转染肺癌A549细胞后的表达与功能. 方法 通过PCR技术以含B细胞转位基因(BTG2)的cDNA克隆质粒(HsCD00330081)为模板获得BTG2基因片段,将此片段克隆至慢病毒载体pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro,形成pCDH-BTG2,转染PC3细胞检测BTG2的表达;将重组慢病毒载体质粒pCDH-BTG2包装成重组慢病毒颗粒,感染肺癌A549细胞后,通过蛋白免疫印迹法检测BTG2的表达,细胞计数法检测BTG2对A549细胞生长的影响. 结果 pCDH-BTG2重组质粒构建成功,转染PC3细胞后可检测BTG2蛋白的表达,pCDH-BTG2包装成慢病毒感染A549细胞后,显著抑制A549细胞的生长. 结论 成功构建了重组慢病毒载体pCDH-BTG2,并发现BTG2抑制A549细胞的生长,为研究BTG2的功能奠定了基础,同时为肺癌的药物研究提供了靶点.     

vasostatin在毕赤酵母中的表达及其抗血管生成的研究

目的:用酵母表达系统表达具有生物活性的vasostatin,并检测其抗血管生成活性.方法:将vasostatin基因克隆入酵母诱导型表达载体pPIC9K中,经过Sac Ⅰ线性化、电转化毕赤酵母蛋白酶缺陷菌株Pichia pastoris KM17、筛选阳性克隆、PCR鉴定和DNA序列分析,获得了vasostatin基因重组到酵母染色体中的阳性重组子,阳性重组子经甲醇诱导和分离纯化,获得了重组vasostatin蛋白,CAM实验检测重组蛋白抑制血管新生活性.结果:酵母表达的重组vasostatin产量达12 mg·L-1,CAM实验表明重组vasostatin能够显著抑制新生血管生成.结论:酵母表达系统能高效表达具有抑制新生血管生成活性的重组vasostatin蛋白.     

重组人血小板因子4的表达、纯化及活性鉴定

目的: 用基因工程手段去获取有活性的重组人血小板因子4(rhPF4),为下一步的基础理论研究和临床应用奠定基础.方法: 用PCR手段获得人PF4的编码序列,克隆入质粒pRSET,构建融合表达载体pRSET-PF4,转化大肠杆菌,以IPTG诱导表达融合的人PF4蛋白,经镍柱亲和层析纯化,用SDS-PAGE分析所表达的目的蛋白及纯化后蛋白,用鸡胚绒毛膜尿囊膜实验(CAM)验证rhPF4的活性.结果: 成功构建了表达载体pRSET-PF4,DNA序列测定结果与预期结果一致.IPTG诱导表达的rhPF4融合蛋白部分以可溶形式存在,占菌体总蛋白量的11%.亲和层析纯化后目的蛋白纯度为84%.CAM实验表明,经纯化获得的rhPF4对鸡胚血管形成具有抑制作用.结论: 成功地获得了具有高度生物学活性的rhPF4蛋白.     

人类髓样分化蛋白-2的原核表达

目的：在大肠杆菌DH-5α中表达人类髓样分化蛋白-2(human myeloid differentiaton protein-2,hMD-2)与谷胱甘肽巯基转移酶(glutathione-s-transferase,GST)的融合蛋白(GST／hMD-2),并对融合蛋白进行免疫学鉴定及初步的变性复性处理．方法：建立GST／hMD-2表达菌,在不同温度下以不同浓度IPTG诱导不同时间后采样,用SDS-PAGE分析各种组合条件下融合蛋白的表达量和溶解性;用Western-Blot鉴定融合蛋白免疫性;用尿素变性和透析法对融合蛋白进行初步纯化．结果：在37℃经0．4mmol/L IPTG诱导4h后,GST／hMD-2可获最高表达量(约占菌体总蛋白的20％),未见可溶性表达;Western-Blot证实GST／hMD-2能与抗MD-2单克隆抗体特异性结合;GST／hMD-2溶于8mol/L尿素,梯度透析后纯度提高至40％．结论：hMD-2可在大肠杆菌DH-5α中与GST融合表达．     

用谷胱甘肽－S－转移酶融合蛋白系统表达人肿瘤坏死因子

将人肿瘤坏死因子基因插入表达载体ｐＧＥＸ－２Ｔ的谷胱甘肽－Ｓ－转移酶基因下游，转化Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９．挑选正确克隆培养，用异丙基硫代半乳糖苷诱导后，在Ｔａｃ启动子作用下，可表达出一条４３ｋＤ（Ｍｒ４３０００）的融合蛋白，表达量占细菌总蛋白的１６．７％。用粗制凝血酶消化未经纯化的细菌蛋白，取上清可溶性组分进行活性鉴定，表明用此系统每升细菌培养可得肿瘤坏死因子活性５×１０６Ｕ．     

RNA干扰技术抑制乳腺癌SKBr3细胞HER2的表达

目的 构建含表皮生长因子受体2基因(HER2)的短发夹状双链RNA(shRNA)重组质粒,体外观察对人乳腺癌细胞SKBr3的HER2 mRNA及蛋白表达的影响. 方法 利用分子克隆技术,将含HER2的双链DNA,与经双酶切后的载体pSilencer连接,构建pSilencer-HER2重组质粒,在脂质体的介导下转染高表达HER2的乳腺癌细胞系SKBr3.RT-PCR分析HER2 mRNA的表达,Western blot检测蛋白的表达,MTT法测定细胞增殖情况. 结果 酶切鉴定证实重组质粒构建成功,转染后能明显抑制HER2 mRNA及蛋白的表达,抑制细胞的增殖. 结论 构建的pSilencer-HER2重组质粒能有效地降低人乳腺癌细胞HER2的表达,抑制细胞的增殖,为HER2高表达预后不良的乳腺癌基因治疗提供新策略.     

吗啡对胶质瘤C6细胞RNA聚合酶Ⅱ通用转录因子F基因表达的影响

目的：检测吗啡对C6胶质瘤细胞RNA合成的影响。 方法：通过RT-PCR方法检测吗啡影响C6胶质瘤细胞RNA聚合酶Ⅱ通用转录因子F(TFⅡF)基因表达的变化。 结果：吗啡作用于C6胶质瘤细胞与相应对照组相比,TFⅡF转录产物均明显减少;纳络酮能阻断吗啡对TFⅡF基因表达抑制的作用。结论：吗啡通过μ受体途径介导C6胶质瘤TFⅡF基因表达抑制的作用。     

重组人单核细胞趋化蛋白-1在大肠杆菌中表达的优化

目的：优化重组人单核细胞趋化蛋白-1（rhuMCP-1）在大肠杆菌DE3中的表达,生产rhuMCP-1。方法：应用NBS15L T.DR发酵罐,研究了诱导时不同的pH值、温度、搅拌速率、通气量和异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）浓度对表达的影响,并利用正交设计对发酵条件进行优化。结果：正交试验表明溶氧条件对rhuMCP-1表达水平的影响较显,其中搅拌速率和通气量为最大的影响因素,搅拌速率为300r/min和通气量10L/min时,表达水平最高,重组蛋白的含量可达40%以上。结论：本实验为该工程菌的中试提供了最佳的表达诱导条件,对大规模工业生产具有重要的指导意义。     

Hybrid retroviral vector with MCK enhancers inserted in LTR for stable and specific expression of human factor IX in skeletal muscle

Background Retroviral vectors have been widely used to introduce foreign into various target cells in vitro, thus showing relatively high systemic delivery efficiency of various transgene products. The authors investigated the stability and efficiency of skeletal muscle-specific hybrid retroviral vectors in expression of human factor IX (FIX) in vitro and iv vivo.Methods FIX cDNA in LIXSN vector was replaced with a FIX minigene containing splicing donor and splicing acceptor sequence of first intron of human FIX gene. Two copies of muscle creatine kinase enhancer (MCK, Me2) were inserted in forward or reverse orientation at Nhel site of 3‘ long terminal repeat (LTR), resulting in two hybrid vectors, which were designated as LMe2lXm2SN (F) and LMe2lXm2SN(R), respectively. The vectors were tested in vitro and in vivo for stability and musclespecificity of factor IX expression with SCID mice.Results Muscle cells carrying vector with Me2 expressed significantly higher levels of FIX (up to 1800 ng/106.24h) than those without Me2, thus suggesting that Me2 could specifically increase expression level of FIX in muscle cells. Myoblasts transduced with LMe2lXm2SN(R) produced much less FIX in vivo in SCID mice than LMe2lXm2SN(F). One or two copies of Me2 sequence were deleted in myoblasts transduced with LMe2lXm2SN(R) without changing the orientation of Me2.Conclusions LTR inserted with MCK enhancers can specifically increase human FIX expression in skeletal muscle cells in vitro and in vivo, and MCK enhancer should be positioned in the same orientation as that of LTR promoter.