应用荧光偏振技术检测HBV DNA

目的建立一种简便、灵敏、特异的DNA检测方法.方法用荧光偏振技术检测102例乙型肝炎患者血清中的HBV DNA,并与多聚酶链反应-酶联免疫吸附试验(PCR-ELISA)方法作比较.结果该方法可以检测出1×101拷贝的HBV DNA模板,CV为6.44%,对102例乙型肝炎患者的血清进行检测,HBsAg(+)、HBeAg(+)、抗HBc(+)血清HBV DNA阳性率为100%(40/40);HBsAg(+)、抗HBe(+)、抗HBc(+)血清HBV DNA阳性率为81.8%(27/33);HBsAg(+)、抗HBc(+)血清HBV DNA阳性率为72.4%(21/29),其余为阴性.30例非乙型肝炎患者血清中HBV DNA的检测结果均为阴性.结论该方法简单、灵敏、特异,适用于临床进行大样本核酸检测.     

荧光偏振检测血清中HBV 多聚酶基因突变

目的建立简便、多重HBV 多聚酶基因序列中拉米呋啶耐药性相关的基因突变的检测方法.方法采用终点终止法和偏振光检测技术进行点突变的检测.对HBV多聚酶基因进行PCR扩增,然后用特异探针与扩增产物中待测核苷酸的下游序列杂交,使探针的3′可以在DNA聚合酶的作用下,依据其互补链上的待测核苷酸连接上一个标有特定荧光素的ddNTP,然后检测该3′端带有荧光素的探针,根据检测到的荧光素种类和偏振光的强度判定待测点是何种核苷酸.结果该方法可以检测出HBV 多聚酶基因序列中特定位置的核苷酸类型,能检测1×101个拷贝的模板量.对30例经过6个月以上拉米呋啶治疗的患者血清进行检测,检测出其中有3例是甲硫氨酸(M)密码子ATG中的A→G变异;2例是ATG中的G→C变异;1例是ATG中的G→T.结论该技术可以对血清中HBV 多聚酶基因序列中点突变以及其他基因突变进行检测.     

聚合酶链反应荧光偏振技术在乙型肝炎病毒DNA检测中的应用及价值

目的　探讨聚合酶链反应荧光偏振技术 (PCR FP)检测乙型肝炎病毒 (HBV)DNA的临床应用价值。方法　将PCR扩增得到的HBVDNA特定片段 ,与荧光素标记探针和PCR产物中的一条DNA链杂交 ,形成特异杂交体 ,用荧光偏振光检测仪检测特异杂交体 ,最终判断HBVDNA是否存在。并对对 10 2份乙型肝炎患者和 30份非乙型肝炎患者血清进行检测结果比较。结果　PCR FP检测HBVDNA的最低检测限为 1× 10 1拷贝 ,在 4 0份乙型肝炎表面抗原 (HBsAg)、乙型肝炎e抗体 (HBeAg)和抗乙型肝炎核心抗原 (抗HBc)均阳性患者血清标本中检出HBVDNA阳性率为 10 0 % ;33份HBsAg、抗乙型肝炎e抗体 (抗Hbe)和抗HBc均阳性患者血清HBVDNA阳性率为 81 8% ;2 9份HBsAg和抗HBc阳性患者血清HBVDNA阳性率为 72 4 % ;14份乙型肝炎患者和 30份非乙型肝炎患者血清均为阴性。方法的灵敏性和特异性分别为 86 %和 10 0 %。结论　PCR FP操作简单、灵敏、特异 ,适用于临床HBV基因检测。     

荧光定量聚合酶链反应检测肝病患者HBV DNA

目的探讨荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)法的临床应用价值.方法采用酶联免疫吸附试验(ELISA)和FQ-PCR法对240例不同的肝病患者及108例健康体检者进行乙型肝炎病毒标志物(HBVM)以及HBV DNA定量检测.结果不同临床类型(急慢性乙肝患者、肝硬化和肝癌)患者血清中HBV DNA的阳性检出率的差异具有显著性(x2=9.40,P<0.05);不同人群血清中HBV DNA阳性检出率的差异亦具有显著性(x2=125.31,P<0.001).ELISA检测结果为"HBsAg(+)HBeAg(+)HBcAb(+)"和"HBsAg(+)HBeAb(+)HBcAb(+)"的HBV感染者,体内HBV DNA含量显著高于HBVM阴性者;e抗原阳性和阴性者体内HBV DNA含量的差异亦具有显著性.HBV、HCV重叠感染者血清HBV DNA含量明显低于单纯HBV感染者(P<0.05).结论 FQ-PCR法检测HBV DNA具有灵敏度高、特异性好、结果可靠的优点,可反映HBV真实感染和低复制状态,对于乙肝的临床诊断、治疗方案选择和预后判断具有重要的指导意义.     

斑点核酸杂交和荧光定量聚合酶链反应检测HBV DNA方法比较

目的评价斑点杂交(DH)和荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)检测乙型肝炎病毒核酸(HBV DNA)的临床应用价值.方法用DH和FQ-PCR分别检测乙型肝炎患者血清239例和健康体检者血清41例的HBV DNA.乙型肝炎血清学标志物用ELISA测定.结果用DH和FQ-PCR检测HBV DNA阳性率分别为HBeAg(+)组78.07%和100%(P<0.01);抗HBe(+)组18.18%和77.27%(P<0.01);HBeAg(-)、抗HBe(-)组11.86%和44.07%(P<0.01).健康体检者两法均为阴性.结论 FQ-PCR对乙型肝炎诊断、传染性的判断和抗病毒药物疗效评价方面比DH更具有临床应用价值.     

斑点核酸杂交和荧光定量聚合酶链反应检测HBV DNA方法比较

目的　评价斑点杂交 (DH)和荧光定量聚合酶链反应 (FQ PCR)检测乙型肝炎病毒核酸 (HBVDNA)的临床应用价值。方法　用DH和FQ PCR分别检测乙型肝炎患者血清 2 39例和健康体检者血清 4 1例的HBVDNA。乙型肝炎血清学标志物用ELISA测定。结果　用DH和FQ PCR检测HBVDNA阳性率分别为 :HBeAg( )组 78.0 7%和 10 0 % (P <0 .0 1) ;抗HBe( )组 18.18%和 77.2 7% (P <0 .0 1) ;HBeAg( )、抗HBe( )组11.86 %和 4 4 .0 7% (P <0 .0 1)。健康体检者两法均为阴性。结论　FQ PCR对乙型肝炎诊断、传染性的判断和抗病毒药物疗效评价方面比DH更具有临床应用价值。     

在HBV DNA检测中使用的若干新PCR改良技术

自1988年PCR技术被成功地应用于检测血清HBV DNA以来,因其具有灵敏度高、速度快、简便,被广泛应用于临床HBV DNA的检测,并在使用过程中不断的被改进,该文介绍了目前国内外使用较多的几种新PCR改良技术。     

PCR在检测HBV DNA中的应用

ＰＣＲ在检测ＨＢＶＤＮＡ中的应用汤继光，黄立东，范友谊，李玉强，杨爱民，徐云，周光炎目前，国内文献报道用聚合酶链反应技术（ＰＣＲ）检测乙肝病毒（ＨＢＶ）ＤＮＡ，大多集中在方法学上［１，２］。我们用ＰＣＲ技术和酶联免疫试验（ＥＬＩＳＡ）同时检测了６１２...     

荧光偏振检测HBVDNA前C区nt1896位点突变

目的　建立简便的HBVDNA前C区nt1896位点突变的检测方法。方法　采用终点终止法和偏振光检测技术进行点突变的检测。首先对HBVDNA前C区基因进行PCR扩增 ,然后用特异探针与扩增产物中待测核苷酸的下游序列杂交 ,使探针的 3’端可以在DNA聚合酶的作用下 ,依据其互补链上的待测核苷酸连接上一个标有特定荧光素的ddNTP ,然后检测该 3’端带有荧光素探针的偏振光值 ,根据检测得到的荧光素种类及其偏振光的强度可以判定待测点是何种核苷酸。结果　该方法可以检测出HBV基因序列中nt1896的核苷酸类型 ,最低可检出的突变模板量为 1× 10 1拷贝。结论　该技术可以对血清中HBVDNA前C区nt1896位点突变以及其他基因突变进行检测。     

不同血清学标志血清中HBV DNA和HCV RNA的分析研究

应用聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术检测４８１例乙肝血清学五项指标至少一项阳性血清中ＨＢＶＤＮＡ和ＨＣＶＲＮＡ，结果显示ＨＢＶＤＮＡ的检出率为９１．５％，ＨＣＶＲＮＡ的检出率为１５．４％，并提示（１）当乙肝患者血清中抗ＨＢｅ阳性甚至抗ＨＢｓ阳性时，仍有相当部分的ＨＢＶ存在且仍在复制；（２）ＨＢＶ和ＨＣＶ感染可相互增加其易感性；ＨＢｓＡｇ阳性与否与抗ＨＣＶ可能有一定关系；（３）ＰＣＲ检测ＨＢＶＤＮＡ、ＨＣＶＲＮＡ具有较高的敏感性。     

乙型肝炎病毒表面大蛋白与HBV DNA检测的对比研究

目的 探讨检测乙型肝炎病毒表面大蛋白（LHBs）用于临床乙型肝炎诊断的实验价值及与乙肝病毒DNA定量的相关性。方法 采用酶联免疫吸附实验（ELISA）和荧光定量PCR法对600例HBeAg阳性血清标本进行LHBs及HBV DNA平行检测。结果 ①在600例HBsAg阳性血清中HBV DNA阳性率为76．17％（457／600），LHBs的阳性率为77．33％（464／600），二者无显著差异（Х^2=0．696，P〉0．05）；②300份HBeAg阳性血清中，HBV DNA、LHBs阳性率分别为95．0％（285／300）、96．0％（288／300）；300份HBeAg阴性血清中，HBV DNA、IMBs阳性率分别为57．33％（172／300）、58．67％（176／300），二者差异均无统计学意义（Х^2=0．725，P〉0．05；Х^2=0．253，P〉0．05）。③LHBs含量与HBV DNA拷贝数呈正相关性，相关系数r=0．948。结论 定量检测LHBs有助于了解乙型肝炎病毒复制情况。     

慢性乙肝患者血清趋化因子MCP-1浓度与病毒载量关系的研究

目的 研究慢性乙型肝炎(CHB)患者外周血清中单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)的表达水平与HBV DNA载量之间的相关性.方法 用ELISA检测CHB患者和健康对照者血清中的MCP-1 蛋白浓度,以实时荧光定量PCR检测CHB患者血清中HBV DNA拷贝数.结果 CHB组血清中MCP-1浓度是157±80 ng/L,健康对照组MCP-1浓度是265±44 ng/L,CHB组血清中MCP-1浓度显著低于健康对照组,t=5.355,P＜0.001,差异有统计学显著性意义;CHB患者血清中MCP-1浓度与血清中HBV DNA拷贝数呈负相关(r=-0.602,P＜0.001).CHB患者血清中MCP-1的浓度是降低的,MCP-1浓度与血清中HBV DNA 载量之间呈负相关(r=-0.602,P＜0.001).结论 乙肝病毒与宿主细胞相互作用下调机体MCP-1表达,可能对HBV致病机理的研究提供一个新的视点.     

HBV DNA含量与前S1蛋白抗原和HBV血清学标志物的相关性分析

目的 探讨HBV DNA检测、前S1蛋白抗原与乙型肝炎血清标志物的相关性.方法 采用PCR法检测HBVDNA;ELISA法检测前S1蛋白抗原及乙型肝炎血清学标志物:HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb.结果 644例HBV DNA≥1.0×103Copies/m乙肝患者血清中A组:HBsAg、HBeAg、HBcAb阳性占50.47%(325/644);B组:HBsAg、HBeAb、HBcAb阳性占38.82%(250/644);C组:HBsAg、HbcAb阳性占10.71%(69/644).Pre-S1阳性532例.占82.6%.结论 Pre-S1抗原与HBVDNA、HBeAg有较好的一致性和互补性.可作为乙肝病毒存在和复制的观察指标,对病情的预后及疗效判断具有指导意义.     

A new combination of RNA-mediated DNA ligation and on-chip elongation for detecting viral RNA

We describe a novel method that combines RNA-mediated DNA ligation and on-chip elongation for detecting viral RNA. These virus species-specific detection probes (DPs) were designed to match sequences of the "target" virus and then chemically synthesized into 2 parts. If the target virus exists, 2 parts of the DP can be ligated by T4 DNA ligase. The ligated DP was hybridized to its corresponding capture probe (CP) on a DNA array. Then, an on-chip DNA polymerization (including Cy3-dUTP) was performed using the ligated DP as a template and the CP as a primer, which resulted in a reporting fluorescent signal. If the target virus does not exist in a sample, no fluorescence signal is produced. Four common tobacco viruses, tobacco mosaic virus, cucumber mosaic virus, potato virus Y, and potato virus X in single and mixed infections were successfully detected by this method. The sensitivity of the detection limit of this assay is 10 times higher than that of ELISA. The minimum dilution detection limit of this assay was 10(-4) (infected sap/healthy sap). The method has the potential to detect any viral RNA from animal, germs, or fungi where the sequence is known.     

荧光定量PCR测定HBV DNA测量不确定度的评定与应用探讨

目的 探讨荧光定量聚合酶链式反应(PCR)测定乙型肝炎病毒核酸(HBV DNA)测量不确定度的评定与临床应用价值。方法 采用批内不精密度和批间不精密度数据评定A类不确定度,采用参加卫生部临床检验中心的室间质评(EQA)数据评定B类不确定度; 根据A类和B类不确定度结果确定合成不确定度和扩展不确定度; 利用不确定度进行HBV DNA检测结果的比较,并建立不确定度报告模型。结果 采用EQA靶值评定偏移引入的不确定度U_bias,以偏移与偏移的标准差评定偏移的不确定度,扩展不确定度U₁(k=1.96,n=2)在检测值为10³和10⁶ IU/ml时分别为0.330 2和0.249 6,而以方法和实验室偏移评定偏移的不确定度,扩展不确定度U₂分别为0.307 6和0.239 4; 采用同方法组均值评定U_bias,U₁分别为0.315 9和0.230 4,U₂分别为0.292 2和0.219 3。如前后两次检测结果均在本实验室测量,取U为0.330 2,两者差值≥0.46(LOG值),差异具有统计学意义。结论 荧光定量PCR测定HBV DNA引入扩展不确定度使结果具有可比性,有助于临床对患者体内病毒复制水平及抗病毒疗效的评价。     

乙型肝炎病毒核酸定量与血清标志物模式及肝功能的关系探讨

目的　探讨乙型肝炎患者病毒核酸定量检测与血清标志物模式 (HBV M )及肝功能的关系。方法　31 5例乙型肝炎患者血清分别用酶联免疫吸附试验 (ELISA)、荧光定量聚合酶链反应 (FQ PCR)检测HBV M、HBVDNA含量 ,并对其中 1 1 5例慢性乙型肝炎 (CHB)患者的丙氨酸氨基转移酶 (ALT)水平作统计分析。结果　血清HBVDNA含量与HBV M有关 ,模式Ⅰ (HBsAg阳性 +HBeAg阳性 +抗HBc阳性 )与HBeAg阴性的各种模式比较 ,模式Ⅱ (HBsAg阳性 +抗HBc阳性 )、Ⅲ (HBsAg阳性 +抗HBe阳性 +抗HBc阳性 )与HBsAg阴性的各种模式比较 ,差异有显著性 (P <0 .0 1 )。对于CHB患者 ,随着病毒在体内的活动 ,血清HBVDNA含量和ALT水平相应升高。结论　HBeAg与HBVDNA含量明显相关 ;HBeAg阴性或HBeAg/抗 HBe血清转换 ,不表示病毒停止复制 ;CHB患者肝功能状态与血清HBVDNA含量有关