多种分离纯化大鼠胰岛细胞的实验方法比较

目的：采用不同的分离或消化方法，探讨如何提高大鼠胰岛细胞分离纯化后的收获量和质量。方法：将25只供体SD雄性大鼠依胰腺分离或消化的方法不同随机地分为5组；（1）A组：胆总管灌注胶原酶P；（2）B组：胆总管灌注Hanks液；（3）C组：胆总管不灌注液体；A，B，C＜3组胰腺直接分次消化；（4）D组：胆总管不灌注，胰腺剪碎后分次消化；（5）对照组：胆总管灌注胶原酶P，胰腺直接单次消化，将分离的且经岛沉淀物用Ficoll-400纯化并培养，再把胰细胞移植于糖尿病裸鼠受体腹腔内。结果：纯化后的胰岛细胞在收获量上A和B组明显多于对照组或C组，而D组最低；A，B和D3组的纯度均高于对照组或C组；在胰岛成活率方面，A，B，C3组均高于对照组或D组，移植于糖尿病裸鼠受体内的大鼠胰岛细胞均可逆转高血糖状态。结论：经胆总管灌注胶原酶后的大鼠胰腺用分次消化的方法可提高胰岛细胞的收获,纯度和活性。     

大鼠胰岛分离与纯化的实验研究

0　引言　目前临床胰岛移植的效果仍不理想 ,提供理想的胰岛或胰岛细胞是发展胰岛移植的基础 .长期以来收获高纯度和高活力的胰岛或胰岛细胞是人们研究的目标 .本文采用胶原酶分次消化与葡聚糖间断密度梯度离心法来探讨大鼠胰腺胰岛的分离与纯化 .1　材料和方法1.1　胰岛分离　 SD大鼠 ,共 10只 ,不分雌雄 ,体质量 16 0～2 0 0 g.颈椎脱位法处死后 ,在无菌状态下迅速取出胰腺 ,置于4℃ Hanks液中 ,去除胰腺周围的结缔组织 ,冲洗后剪成 1mm3的碎块 ,加入 3m L预温的 1g· L- 1 的胶原酶 (IV型 ,Sigma)消化液中 ,置 38℃水浴箱中 10 min,…     

成年猪和大鼠胰岛分离纯化的实验研究

目的 选择最佳猪、鼠胰岛的制备方法。方法 采用不贩 胶原酶消化法及不连续密度梯度纯化法。结果 选出了制备适合猪、鼠胰岛的最佳方法。结论 由于猪、鼠胰腺结构的不同，制备胰岛细胞应采取不同的消化及纯化方法。     

对大鼠胰岛两种不同分离纯化方法的实验研究

目的 选择最佳鼠胰岛的制备方法。方法 采用不同的胶原酶消化法及不连续密度梯度纯化法。结果 Dextran法和Ficoll法分离纯化出胰岛细胞成活率无明显差异，且价格相差数十倍。结论 可以用Dextran纯化液替代Ficoll纯化液。     

大鼠胰岛的分离和纯化

目的：改进分离与纯化方法，以获得较高纯度和活力的大鼠胰岛。方法：用改良的酶法分离、Ｄｅｘｔｒａｎ梯度法纯化大鼠胰岛。用ＤＴＺ法判定胰岛纯度；用ＡＯ／ＰＩ法判定胰腺存活率；用大鼠胰岛移植于ＳＴＺ糖尿病小鼠法判定其功能。结果：雌、雄性ＳＤ和Ｗｉｓｔａｒ大鼠间胰岛形态无明显差异。Ⅴ型和Ⅺ型胶原酶对大鼠胰岛分离效果相似；分离以０．１％胶原酶分次消化、作用３０ｍｉｎ为宜，细胞存活率达９０％。纯化用２２％—１６％—１４％—９％梯度所获得胰岛的纯度＞９０％。胰岛移植于糖尿病小鼠可使其血糖从移植前的（２６．７０±２．５３）ｍｍｏｌ／Ｌ降低至（１３．９８±３．９２）ｍｍｏｌ／Ｌ，维持２～３ｄ。结论：所改进的制备方法可获得较高纯度和活力的大鼠胰岛。     

大鼠胰岛分离与纯化的实验研究

本实验经胰管注射胶原酶、胰腺静止消化方法。分离成年Wistar大鼠胰岛,葡聚糖密度梯度离心纯化。大鼠胰腺消化后,胰岛收获量为710～1015个/胰腺,纯化后胰岛收获量为610—820个/胰腺,纯度达92%。纯化胰岛形态结构完整,内分泌细胞超微结构保持良好;对葡萄糖刺激反应,胰岛素释放量是基础分泌水平的8倍;异体移植可逆转实验性糖尿病小鼠的高血糖达一周。     

多种分离纯化大鼠胰岛细胞的实验方法比较

【目的】采用不同的分离或消化方法 ,探讨如何提高大鼠胰岛细胞分离纯化后的收获量和质量。【方法】将 2 5只供体SD雄性大鼠依胰腺分离或消化的方法不同随机地分为 5组 :①A组 :胆总管灌注胶原酶P ;②B组 :胆总管灌注Hanks液 ;③C组 :胆总管不灌注液体 ;A、B、C 3组胰腺直接分次消化 ;④D组 :胆总管不灌注 ,胰腺剪碎后分次消化 ;⑤对照组 :胆总管灌注胶原酶P ,胰腺直接单次消化。将分离的胰岛沉淀物用Ficoll 4 0 0纯化并培养 ,再把胰岛细胞移植于糖尿病裸鼠受体腹腔内。【结果】纯化后的胰岛细胞在收获量上A和B组明显多于对照组或C组 ,而D组最低 ;A、B和D 3组的纯度均高于对照组或C组 ;在胰岛成活率方面 ,A、B、C 3组均高于对照组或D组。移植于糖尿病裸鼠受体内的大鼠胰岛细胞均可逆转高血糖状态。【结论】经胆总管灌注胶原酶后的大鼠胰腺用分次消化的方法可提高胰岛细胞的收获量、纯度和活性。     

半自动纯化法分离纯化成年猪胰岛细胞的实验研究

目的探索大规模猪胰岛细胞分离纯化的方法.方法采用胶原酶消化法和Ficoll液不连续密度梯度离心进行分离纯化;采用双硫腙染色、AO-PI染色、胰岛素释放试验检测胰岛的纯度和活性.结果消化后平均获取的胰岛细胞团数量为（4 387±617）IEQ/g胰腺组织;纯化后平均为（3 192±756）IEQ/g胰腺组织;获取的猪胰岛细胞平均纯度为（60.15±2.35）%,活率为（80.00±0.47）%.结论所获得的胰岛细胞有较好的纯度和良好的生物活性,显示半自动纯化法分离纯化成年云南小耳猪胰岛细胞是成功可行的,可以满足进一步异种移植的研究需要,可为大规模分离纯化猪胰岛细胞提供技术支持.     

腺病毒介导外源基因转染大鼠胰岛移植物的实验研究

目的探讨携带外源基因的腺病毒在体外有效感染大鼠胰岛及外源基因在胰岛中的表达。方法用携带人血红素氧合酶-1基因(hHO-1)及绿色荧光蛋白基因(GFP)的腺病毒在体外以不同MOI感染大鼠胰岛,荧光显微镜观察GFP的表达及Western检测hHO-1蛋白来确定转染结果,并观察外源基因表达持续的时间。结果腺病毒载体在体外能将外源基因有效转入到大鼠胰岛细胞,转染的基因能稳定表达。结论腺病毒载体在体外可以有效感染大鼠胰岛,为基因修饰胰岛移植物以提高胰岛移植效果奠定了实验基础。     

大鼠胰岛分离和纯化

目的观察胶原酶消化法对大鼠胰岛的分离结果.方法用胶原酶法分离、Ficoll400 密度梯度离心法纯化胰岛.用DTZ法判定胰岛的纯度;用AO/PI法判定胰岛存活率;用胰岛素释放试验和移植糖尿病大鼠法判定胰岛功能.结果纯化后的胰岛收获量为(500-700)个/每只胰腺,胰岛纯度大于85%,活度大于95%,胰岛细胞体外培养液中胰岛素含量在基础相和刺激相为(18.32±3.57)mu/L、(32.25±3.74)mu/L,差异有显著性(P＜0.05),胰岛移植后,实验组2天后血糖浓度降至正常,对照组无改变,实验组正常血糖维持时间(5.1±2.4)d.结论胶原酶消化、Ficoll400密度梯度离心法可获得高纯度和活力的大鼠胰岛.     

大鼠胰岛分离纯化实验研究

目的介绍一种大鼠胰岛分离纯化方法。方法SD大鼠和Wistar大鼠共10只,以0.05%Ⅴ型胶原酶胆管灌注,经消化后用葡聚糖(dextran)不连续密度梯度法纯化胰岛。DTZ和AO/PI染色检测纯度及活性。结果胰岛收获量为(930±168)个,Ⅴ型胶原酶灌注及不连续密度梯度法可获得纯度高、活性好胰岛。结论以0.05%的胶原酶胆管灌注消化的方法可得纯度高、活性良好的胰岛。     

新生期小鼠胰岛分离纯化方法的研究

目的:探讨新生期小鼠胰岛分离纯化方案?方法:采用胰腺局部充盈?胶原酶Ⅴ消化,对比不同消化时间及单纯显微镜下手挑胰岛或Histopaque-1077纯化对胰岛得率的影响,并通过胰岛素/胰高血糖素双染后流式细胞术检测胰岛β和α细胞构成比例?结果:在1 mg/ml酶浓度下,1周和3周小鼠胰岛的最适消化时间分别为23 min(胰岛/胰腺38.11 ± 2.78)和25 min(胰岛/胰腺66.06 ± 2.61)?1周以直径< 50 μm胰岛居多(P < 0.01),而3周以50~99 μm者居多(P < 0.01)?单纯手挑组胰岛得率显著高于Histopaque-1077纯化组(P < 0.05)?所得胰岛存活率和纯度均> 90%,且存在β和α细胞构成比例的动态变化(P < 0.05)?结论:胰腺局部充盈?胶原酶Ⅴ消化后镜下手挑胰岛是一种较好的新生期小鼠胰岛分离纯化方法,消化时间和纯化方法是其重要影响因素?     

两种不同方法纯化大鼠胰岛细胞的比较

目的探讨理想的大鼠胰岛制备方法。方法采用胆总管逆行胶原酶Ⅴ原位灌注法消化胰腺分离胰岛,不同的胰岛纯化方法:Ficoll间断密度梯度离心法(A组,n=12)和滤网过滤法(B组,n=12)。结果纯化后B组胰岛的收获量(494±56)个和活性[(94.7±1.9)%]远远高于A组[(352±33)和(88.8±1.7)%](P<0.01);纯化时间B组(10±2)min明显比A组快[(18±2)min,P<0.01)。结论运用滤网过滤法纯化胰岛可以获得更多数量和更高质量的胰岛。     

连续和不连续密度梯度法纯化人胰岛的效果比较

目的 使用COBE 2991细胞处理器比较连续和不连续密度梯度纯化法纯化人胰岛的效果.方法 胰腺消化产物使用COBE 2991细胞处理器分别采用不连续和连续密度梯度法进行离心纯化,并对纯化后得到的胰岛取样检测其数量、纯度.换算为胰岛当量(IEQ),计算胰岛回收率,比较两种纯化方法的效果.结果 连续密度梯度纯化法得到的胰岛产量(55 000 IEQ vs 206 000 IEQ,P=0.000)、纯度(58.0%±8.O% vs 33.5%±10.3%,P=0.000)优于不连续密度梯度纯化法,胰岛活性没有明显差异.结论 连续密度梯度法纯化效果优于不连续密度梯度法.     

NOD 小鼠胰岛的分离及其在体内外的生物学特性

目的 建立分离纯化非肥胖性糖尿病(NOD)小鼠胰岛的方法,并对其体内外生物学特性进行研究?方法 采用改良的胶原酶消化结合Ficoll 密度梯度离心方法,分离纯化NOD 小鼠胰岛?应用体外糖刺激实验检测分离纯化的胰岛功能,以及通过监测移植小鼠的血糖?体重变化及糖耐量实验对移植胰岛的体内生物学功能进行分析,并通过HE 染色和免疫荧光染色检测肾被膜下移植胰岛的存活情况?结果 胰岛产率为(116 ±12)个胰岛/胰腺,纯度>90%?体外糖刺激实验结果显示,NOD 小鼠胰岛的糖刺激胰岛素释放水平明显低于KM 小鼠胰岛?胰岛移植实验显示,移植胰岛能有效改善糖尿病小鼠的血糖?体重和糖耐量,但改善作用一般仅能维持2 周左右?HE 染色和免疫荧光染色结果显示,肾被膜下可见胰岛素阳性的胰岛细胞团,并且在残存的移植胰岛细胞团周围存在大量淋巴细胞浸润?结论 通过改良的小鼠胰岛分离方法可由NOD 小鼠分离得到大量较高纯度的胰岛,可用于今后探索如何阻断自身免疫损伤保护移植胰岛的研究?     

Functional stimulation of graft nerves has minor effects on insulin release from transplanted rat pancreatic islets

Abstract

Introduction. Morphological evidence for reinnervation of pancreatic islet grafts is plentiful. However, to what extent intra-graft nerves influence the endocrine functions of the islet transplant is largely unknown. We therefore aimed to directly stimulate nerves leading to islet grafts with electrodes and measure insulin secretion in response to this.

Methods. We implanted syngeneic islets under the renal capsule of rats, and examined them 1 or 7–9 months later. In anesthetized rats blood samples were collected from the renal vein and femoral artery, respectively, during electrode stimulation of the nerves leading to the islet grafts.

Results. As expected, nerve stimulation decreased renal blood flow. However, serum insulin concentrations in samples derived from the renal vein or femoral artery changed in concert with one another, both during normoglycemia and acute hyperglycemia.

Conclusion. Reinnervation which occurs after islet transplantation under the renal capsule has minor effects on graft endocrine function.     

吗啡依赖大鼠胰岛A细胞免疫组织化学研究

目的研究吗啡依赖大鼠Ａ细胞的变化,为探讨吗啡对Ａ细胞分泌功能的影响提供形态学依据。方法用皮下注射吗啡建立吗啡依赖大鼠模型,用免疫组织化学和图象分析方法观察胰岛Ａ细胞的变化。结果吗啡依赖大鼠Ａ细胞免疫反应增强（Ｐ＜０．０１）。结论吗啡可引起胰岛Ａ细胞分泌胰高血糖素的功能增强。     

大鼠胰岛与生长因子共微囊提高囊内胰岛存活率

目的 探讨微胶囊胰岛皮下移植治疗化学性糖尿病小鼠和生长因子(growth factor,GF)与大鼠胰岛共微囊对提高囊内胰岛存活率的作用.方法 选取C57BL/6雄性小鼠皮下预血管化糖尿病模型25只,行微胶囊大鼠胰岛皮下移植.随机分为5组,每组5只.①A组:GF与大鼠胰岛共微囊移植组;②B组:微胶囊大鼠胰岛移植组;③C组:GF微囊移植组;④D组:大鼠胰岛移植组;⑤E组:空囊移植组.观察受体小鼠的血糖和体重变化,移植后8周比较微胶囊内胰岛存活数.结果 移植后1周至移植后3周A组与B组间血糖均有非常显著差异(P＜0.01),移植后4周至移植后8周A组与B组间血糖无显著差异(P＞0.05),移植后1周至移植后4周B组与C组间血糖均有非常显著差异(P＜0.01).C组血糖异常升高,移植4周后小鼠陆续死亡.D组和E组移植无效.A组和B组间各实验点小鼠体重均无显著差异(P＞0.05),A组小鼠体重成模时下降,移植2周后开始上升.A组和B组胰岛存活数有非常显著差异(F=36.84,P＜0.01).结论 GF与大鼠胰岛共微胶囊移植,GF可促进胰岛的细胞增殖和再生,显著提高囊内胰岛的存活率.