前列腺特异性抗原启动子增强子调控重组质粒的构建及鉴定

目的:利用前列腺特异性抗原(pros-tate-specific antigen,PSA)组织特异性表达的特点,克隆出其上游增强子(prostate-specific antigen enhancer,PSAE)和启动子(prostate-specificantigen promoter,PSAP)片断,并对其表达效率和组织特异性表达进行初步研究。方法:从前列腺癌组织提取基因组DNA,并采用PCR方法分别扩增PSA增强子和启动子序列;利用报告基因pEGFP-1,分别构建含不同调控序列的表达载体;脂质体介导基因转染不同细胞并观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达情况。结果:成功构建质粒pPSAE-EGFP、pPSAP-EGFP和pPSAE-PS-AP-EGFP;转染结果显示,pPSAE-PSAP-EGFP在前列腺癌细胞PC-3中的荧光强度明显高于pPSAP-EGFP,pPSAE-EGFP同样观察到荧光表达,说明PSA增强子能显著提高PSA启动子的转录能力,并具有单独调控基因表达的能力。结论:PSA增强子和启动子的共同调控可以提高基因表达的有效性和细胞特异性,为前列腺癌的临床基因治疗提供实验依据。     

增强子对基因表达调控的研究进展

增强子是能够增强启动子转录活性的DNA顺式作用序列,生物信息学的诞生为其研究带来了极大的便利.利用增强子修饰的肿瘤特异性启动子使治疗或效应基因在特定的组织、细胞或器官中表达,实现对肿瘤靶向性治疗,是一种非常有意义的基因治疗途径.     

hTERT启动子克隆及其肿瘤细胞特异性的研究

目的:探讨克隆人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子对肿瘤细胞特异性的意义.方法:全基因合成hTERT启动子核心序列TP258,克隆入T载体,构建pUCmT-TP258测序;Sal Ⅰ BamH Ⅰ酶切pUCmT-TP258,将其片断插入pGL3-Basic/Xho I Bgl Ⅱ位点,构建pGL3-TP258质粒载体.将pGL3-Basic、pGL3-control和pGL3-TP258转染培养的人结肠癌细胞株(CaCo-2)、人乳腺癌细胞株(MCF-7)、原代肾癌细胞(RCC)和人正常成纤维细胞(UFC、BJ、MRC-5),测定Luciferase活性,计算其相对活性.结果:在端粒酶阳性的肾癌细胞RCC、结肠癌细胞CaCo-2和乳腺癌细胞MCF-7中,TP258启动子相对活性很高,分别为32.40±15.32、37.70±6.38和12.80±7.28;而在正常的UFC、BJ和MRC-5细胞中,TP258活性很低,分别是0.40±0.14、0.26±0.13和0.38±0.05,两组闻差异有统计学意义,P=0.003 5.结论:hTERT核心启动子TP258在肿瘤细胞中活性明显高于在正常细胞中的活性,具有肿瘤特异性.TP258可以介导基因在肿瘤中的定向表达,实现基因表达的靶向性.     

肺癌组织细胞中CHFR基因表达水平及其启动子甲基化状态

目的：探讨CHFR（checkpoint with FHA and ring finger）基因表达水平及其启动子CpG岛甲基化状态与肺癌发生发展的关系。方法：实时定量PCR法检测CHFRmRNA在45例肺癌组织、23例癌旁组织与去甲基化剂5-氮杂-2′-脱氧胞苷处理前后A549细胞株中的表达,同时用甲基化特异性PCR检测CHFR启动子CpG岛甲基化状态。结果：CHFRmRNA在癌旁组织中全部表达,在肺癌组织中表达缺失率为15．56％（7／45）,且表达量低于正常肺组织,F=9．156,P〈0．01;但在不同年龄、性别、肿瘤大小、恶性程度和肿瘤分类中的差异无统计学意义,P〉0．05。CHFR基因启动子在肺癌组织中发生甲基化的频率为22．22％（10／45）,在癌旁组织未发生甲基化,χ^2=5．992,P〈0．05。10例启动子区甲基化的肺癌标本中,7例同时伴有mRNA表达缺失。结论：CHFR启动子甲基化可在肺癌发生和发展中起一定作用。     

人端粒酶逆转录酶启动子介导的靶向性肿瘤基因治疗

由于人端粒酶逆转录酶（hTERT）启动子区域已被克隆，其特点也已被鉴定，hTERT启动子介导的靶向性肿瘤基因治疗成为研究的热点。现综述hTERT启动子介导的靶向性肿瘤基因治疗最新研究进展。     

构建以hTERT、Cox-2启动子调控的肿瘤特异增殖腺病毒

目的 应用同源重组的方法构建以hTERT和Cox-2启动子调控增殖的肿瘤特异性增殖腺病毒.方法 将hTERT和Cox-2启动子从人类白细胞基因组中亚克隆出来,并将启动子分别插入到腺病毒穿梭载体pd306上的E1A和E1B基因前,使hTERT和Cox-2启动子分别调控腺病毒必须基因E1A和E1B的表达,再将构建后的pd306和腺病毒的骨架质粒BHGE3在Ad293细胞内进行同源重组,并用重组后的病毒感染Hela细胞检测病毒对肿瘤细胞的杀伤力.结果 成功构建了hTERT和Cox-2启动子,并将两个启动子连接入腺病毒载体,产生了具有感染力的可增殖腺病毒.结论 经hTERT和Cox-2启动子调控增殖的肿瘤特异性增殖腺病毒对Hela细胞具有杀伤力,为进一步研究病毒在体内、外对各种肿瘤细胞的特异性杀伤力、安全性奠定了基础.     

人端粒酶逆转录酶启动子介导的靶向性肿瘤基因治疗

由于人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子区域已被克隆,其特点也已被鉴定,hTERT启动子介导的靶向性肿瘤基因治疗成为研究的热点.现综述hTERT启动子介导的靶向性肿瘤基因治疗最新研究进展.     

肝细胞肝癌上皮型钙黏素基因表达和启动子甲基化研究

目的 探讨上皮型钙黏素(E-cad)基因表达和启动子CpG岛甲基化与肝细胞肝癌(HCC)的关系.方法 用甲基化特异性PCR技术检测36例HCC肿瘤组织及其癌旁非肿瘤组织中,E-cad基因启动子CpG岛甲基化状况,E-cad mRNA表达用RT-PCR技术检测.结果 癌旁组织中E-cad mRNA表达水平显著高于肿瘤组织(P<0.001),Ⅲ～Ⅳ期肿瘤组织中的表达水平显著低于Ⅰ～Ⅱ期肿瘤(P=0.025),较大肿瘤(>5 cm)组织中的表达水平显著低于较小肿瘤(P=0.035),包膜完整的肿瘤组织中E-cad mRNA表达水平显著高于包膜不完整的肿瘤(P=0.001);E-cad基因在HCC肿瘤组织中的甲基化率显著高于癌旁组织(P=0.035),在包膜完整的肿瘤中的甲基化率显著低于包膜不完整的肿瘤(P=0.015);E-cad甲基化阳性的肿瘤组织中,其mRNA表达水平显著低于E-cad非甲基化阳性的肿瘤(P<0.000).结论 E-cad基因表达下降可能与HCC进展相关,其启动子甲基化是该基因表达下降的重要原因之一.     

肝细胞肝癌hTERT和PTEN基因表达与临床病理特征关系的研究

目的:研究hTERT和PTEN基因在肝细胞肝癌中的表达情况,探计其在肝细胞肝癌发生发展中的作用及意义.方法:应用免疫组化(SP法)和半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR),同步检测78例肝细胞肝癌及对应癌旁组织和12例正常肝组织中hTERT蛋白和mRNA、PTEN蛋白和PTEN mRNA表达情况.分析hTERT和PTEN基因表达及肝细胞肝癌临床病理参数的关系.结果:hTERT蛋白主要定位于肝癌细胞胞质内,偶见核内染色.hTERT蛋白和mRNA在肝细胞肝癌中的阳性率分别为84.62％(66/78)和78.21％ (61/78),均高于癌旁肝组织的阳性率10.26％(8/78)和8.97％ (7/78),差异有统计学意义,P＜0.01.hTERT蛋白及其mRNA在12例正常肝组织均未见表达.PTEN蛋白明确定位于肝细胞胞质内.PTENmRNA和蛋白在肝细胞肝癌中的阳性率分别为41.03％ (32/78)和43.59％(34/78),明显低于癌旁肝组织的阳性率100.00％ (78/78),差异有统计学意义,P＜0.01.统计学分析显示,在肝细胞中hTERT基因的表达与肿瘤分期分级、门静脉有无癌栓、血清中甲胎蛋白表达水平、是否合并HBV感染等因素有关,P＜0.05;与患者年龄、性别、肿瘤大小等因素无关.相关分析显示,PTEN与hTERT在肝细胞肝癌中的表达呈负相关,P＜0.05.结论:hTERT和PTEN表达呈负相关,提示PTEN可能在肝细胞肝癌的发生发展过程中对hTERT的活化起着调控作用,其表达有望成为肝细胞肝癌的重要分子生物学指标.     

人MUC4启动子驱动的HSV—TK重组腺病毒靶向杀伤SGC-7901胃癌细胞的实验研究

目的：构建人粘蛋白（MUC4）启动子驱动下的单纯疱疹胸苷激酶基因（HSV-TK）重组腺病毒,研究其对SGC一7901胃癌细胞的靶向杀伤作用。方法：克隆MUC4启动子区625bp活性序列,构建重组荧光素酶报告基因载体pGL3MUC4,检测其在sGD790l胃癌细胞及NIH3T3成纤维细胞中的转录活性。以AdEasy。”腺病毒系统为载体,构建Muc4启动子驱动下的HsV—TK重组腺病毒rAdeno—MUC4一TK,感染SGC7901及NIH3T3,经更昔洛韦（GCV）处理,MTT法检测细胞活力,TUNEL法检测细胞凋亡。结果：成功扩增出大小为625bp的MUC4启动子序列。pGL3一MUC4在SGC一790l细胞中具有强转录活性,转录活性高于强启动子SV406．6倍,而NIH3T3成纤维细胞系中几乎无转录活性。构建重组腺病毒rAdeno—MUC4一TK,MTT法和TUNEI。检测结果显示,其与GCV联合能够诱导SGC-7901细胞凋亡,产生靶向细胞毒作用。结论：人MUC4启动子驱动下的HSV—TK重组腺病毒联合GCV对SGC一7901胃癌细胞具有靶向杀伤作用,MUC4启动子可以作为胃癌靶向基因治疗的工具。     

人MUC4启动子驱动的HSV-TK重组腺病毒靶向杀伤SGC-7901胃癌细胞的实验研究

目的:构建人粘蛋白( MUC4)启动子驱动下的单纯疱疹胸苷激酶基因(HSV-TK)重组腺病毒,研究其对SGC-7901胃癌细胞的靶向杀伤作用.方法:克隆MUC4启动子区625 bp活性序列,构建重组荧光素酶报告基因载体pGL3-MUC4,检测其在SGC-7901胃癌细胞及NIH3T3成纤维细胞中的转录活性.以AdEasyTM腺病毒系统为载体,构建MUC4启动子驱动下的HSV-TK重组腺病毒rAdeno-MUC4-TK,感染SGC-7901及NIH3T3,经更昔洛韦(GCV)处理,MTT法检测细胞活力,TUNEL法检测细胞凋亡.结果:成功扩增出大小为625 bp的MUC4启动子序列.pGL3-MUC4在SGC-7901细胞中具有强转录活性,转录活性高于强启动子SV40 6.6倍,而NIH3T3成纤维细胞系中几乎无转录活性.构建重组腺病毒rAdeno-MUC4-TK,MTT法和TUNEL检测结果显示,其与GCV联合能够诱导SGC-7901细胞凋亡,产生靶向细胞毒作用.结论:人MUC4启动子驱动下的HSV-TK重组腺病毒联合GCV对SGC-7901胃癌细胞具有靶向杀伤作用,MUC4启动子可以作为胃癌靶向基因治疗的工具.     

乙肝病毒衣壳运载体甲胎蛋白启动子驱动的白细胞介素-2在肝癌细胞中的靶向表达

目的 利用乙肝病毒衣壳（HBVE）和人甲胎蛋白（AFP）启动子的双重靶向性,观察白细胞介素-2（IL-2）基因是否可以在肝癌细胞中靶向表达.方法 体外培养HepG2、L02、HepG2.2.15细胞,PEG8000浓缩法提取HBVE作为基因运载体,聚合酶链反应（PCR）法制备人AFP启动子-IL-2重组基因,瞬时转染HepG2细胞与L02细胞,反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）观察IL-2 mRNA表达,Western blot观察IL-2蛋白表达情况.结果 以HBVE为基因的运载体,包裹人AFP启动子-IL-2重组基因后转染HepG2细胞和L02细胞,RT-PCR和Westem blot检测到HepG2细胞有IL-2的表达,而对照组L02细胞无IL-2的表达.结论 以HBVE为基因运载体,可以使AFP启动子驱动的IL-2基因在AFP阳性的肝癌细胞靶向表达,从而提高了外源基因导入肝癌细胞的安全性.     

Cx43基因启动子去甲基化与乳腺癌MDA-MB231细胞上皮间质转换的相关性研究

目的:探讨乳腺癌细胞中连接蛋白43(Cx43)基因启动子甲基化与乳腺癌上皮间质转化(EMT)的关系.方法:甲基化PCR检测Cx43启动子甲基化的频度;5-氮杂脱氧胞苷(5-Aza-Dc)培养乳腺癌MD-MBA-231细胞后,反转录PCR(RT-PCR) 乳腺癌细胞中Cx43 Mrna,免疫荧光、蛋白质印迹法检测E-cadherin、波蛋白(vimentin)及Cx43蛋白表达,甲基化PCR检测启动子甲基化的变化.结果:在应用5-Aza-Dc处理前,MD-MBA-231Cx43基因呈甲基化状态,将4.0 μmol/L的5-Aza-Dc作用48 h后,乳腺癌细胞Cx43基因甲基化逆转;Cx43 Mrna表达水平增加,为对照组的6.5倍.蛋白质印迹检测结果显示,Cx43蛋白相对灰度值为4.3±0.2,明显高于对照组.处理组细胞E-cadherin表达增加,vimentin表达下调.结论:5-Aza-Dc能逆转乳腺癌细胞MD-MBA-231的Cx43基因异常甲基化,促进Cx43基因的再表达,在一定程度上逆转乳腺癌MDA-MB231细胞EMT.