模拟微重力培养骨髓间充质干细胞定向诱导复合改良纤维蛋白原支架修复兔关节软骨缺损

背景:模拟微重力培养系统通过模拟细胞生存的体内微重力环境,使细胞承受较低的剪切力, 提高细胞内外、细胞间物质传递效率,从而提高细胞分化质量.目的:观察微重力培养环境在构建组织工程模块修复关节软骨缺损中的作用.设计,时间及地点:体外实验采用自身对照;体内实验采用随机分组比较,于2007-12/2008-06在广东省构建与检测实验室及南方医院动物实验中心进行.材料:3周普通级龄新西兰兔1只用于骨髓间充质干细胞培养;3月龄新西兰兔48只用于体内验证实验.方法:以纤维蛋白胶粉、凝血酶、氯化钙、抑肽酶、氨甲环酸制备纤维蛋白原支架.体外培养新西兰大白兔骨髓间充质干细胞3周,使之吸附于改良纤维蛋白原支架上在微重力环境下三维立体培养3周.48只兔做软骨钻孔制备软骨缺损动物模型,每只兔4孔.实验分为4组,每组48孔,微重力培养组在孔内植入微重力培养下的软骨细胞组织模块;普通培养组在孔内植入普通培养下的软骨细胞组织模块;单纯支架组在孔内植入空白支架;空白组孔内不植入任何材料,分别于2,6,12周处死动物,取相应标本.主要观察指标:通过生长曲线、倒置相差显微镜、组织学检测微重力培养环境在三维立体培养对软骨细胞增殖及功能的影响,以及用组织工程学评分检测微重力环境下培养的软骨模块对缺损的修复效果.结果:模拟微重力培养条件下构建的模块体外培养3周,细胞数量明显增多,并分泌较多的细胞基质,包裹在软骨细胞周围.组织工程学评分显示微重力培养组修复软骨缺损的效果明显好于其他组.结论:模拟微重力培养环境对三维立体培养软骨细胞模块有比较良好的效果.     

骨髓间充质干细胞定向诱导移植修复关节软骨

背景:骨髓间充质干细胞在不同诱导条件下具有向中胚层组织细胞如成骨细胞、成软骨细胞、肌细胞、脂肪细胞等分化的能力.目的:验证用组织工程方法诱导分化骨髓间充质干细胞修复兔关节软骨损伤的效果.设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2005-05-03/2007-12-30在沈阳医学院临床中心实验室完成.材料:20只两三月龄的健康新西兰白兔,雌雄不限.方法:①诱导分化体外培养的兔骨髓间充质干细胞.实验组加入地塞米松、碱性成纤维细胞生长因子、维生素C培养1周,再将转化生长因子β替换碱性成纤维细胞生长因子培养3周;以不加诱导剂细胞做对照.②取20只兔.建立膝关节软骨缺损模型,随机分为3组.实验组10只膝关节内植入经诱导的骨髓间充质干细胞;对照组植入未经诱导的骨髓间充质干细胞:空白对照组植入生理盐水.分别于术后2,4,6,8周时处死实验组处死2只,对照组和空白对照组各处死1只进行各项指标检测.主要观察指标:①细胞形态学.②碱性磷酸酶活性的测定.③大体标本观察.④X射线观察.⑤组织切片观察.结果:①经诱导的骨髓间充质干细胞,细胞形态发生明显变化,逐渐由长梭形变为多角形,类似于软骨细胞样形态.②骨髓间充质干细胞经诱导4周后,其碱性磷酸酶活性明显增强(P＜0.05).③术后8周,实验组标本修复组织表面光滑,与周围软骨间界限模糊不清:X射线表现为关节间隙变宽,软骨下骨质囊变得到改善:组织切片观察显示与正常软骨细胞基本上一致.结论:自体间充质干细胞移植可修复关节软骨损伤.     

自体骨膜复合骨髓间充质干细胞移植修复免关节软骨缺损

背景:自体骨髓间充质干细胞及骨膜移植等方法可促进关节软骨缺损的修复,但其各自的成软骨能力有限,治疗效果欠佳.目的:观察自体骨膜复合向软骨细胞诱导的骨髓间充质干细胞移植修复软骨缺损的疗效.设计、时间及地点:随机分组对照动物实验,于2005-08/2007-03在山西医科大学第二医院骨科实验室完成.材料:6～8月龄新西兰白兔18只,按随机数字表法分为3组,即骨膜复合骨髓间充质干细胞组、单纯骨膜组及空白对照组,每组6只12个膝关节标本.方法:骨膜复合骨髓间充质干细胞组采用胰酶消化法采集骨髓间充质干细胞进行贴壁培养,加入转化生长因子β1向软骨细胞进行诱导分化,同时进行PKH-26细胞膜免疫荧光标记.在全部兔双侧股骨内侧髁造成直径3 mm,深度3 mm的全层软骨缺损,骨膜复合骨髓间充质干细胞组、单纯骨膜组取同侧胫骨上段内侧骨膜,骨膜生发层朝向骨髓腔覆盖软骨缺损,骨膜复合骨髓间充质干细胞组先期缝合3针,向缺损区注入1×109L-1骨髓间充质干细胞细胞悬液20μL,植入细胞后缝合最后1针.单纯骨膜组只进行单纯骨膜覆盖缺损处理;空白对照组只钻孔不作任何处理.主要观察指标:术后6,12周时,对缺损部位进行大体观察、组织学观察、Wakitani评分以及Ⅱ型胶原免疫组化及原位杂交检测.结果:所有缝合骨膜未发现脱落,骨膜复合骨髓间充质干细胞组6周时,软骨缺损已由透明软骨样修复组织填充,12周时修复组织进一步改建,且修复组织中细胞主要为带有PKH-26荧光标记的植入细胞.单纯骨膜组缺损区修复组织为乳白色,表面光滑稍微凹陷,与周围正常软骨组织之间界限清晰;空白对照组缺损区多数比较凹陷,或缺损部位形状不规则,周围软骨组织断裂.术后6,12周时,骨膜复合骨髓间充质干细胞组Wakitani组织学评分均优于单纯骨膜组和空白对照组(P＜0.05),单纯骨膜组的评分优于空白对照组(p＜0.05).同时,骨膜复合骨髓间充质干细胞组修复组织内细胞周围基质Ⅱ型胶原免疫组化及原位杂交染色阳性,证实修复组织内的细胞为植入细胞.结论:自体骨膜复合向软骨细胞诱导的骨髓间充质干细胞移植可形成透明软骨样修复组织修复关节软骨缺损.     

骨髓间充质干细胞复合多肽凝胶及成软骨生成因子修复兔关节软骨缺损

背景：多肽水凝胶因为其具有良好的可塑型性,能够与损伤部位很好的无缝隙结合,所以采用该材料作为支架是骨、软骨组织工程中一种可行的探索。目的：骨髓间充质干细胞联合新型可注射多肽凝胶及成软骨生成因子修复兔关节软骨缺损,观察其修复效果。方法：首先分离培养兔骨髓间充质干细胞,兔左侧膝关节处制备直径5 mm,深3 mm的全层骨-软骨缺损模型;右侧造模后空置作为对照。实验分为3组,单纯自组装多肽凝胶移植组,自组装多肽凝胶+成软骨因子组和自组装多肽凝胶+成软骨因子+骨髓间充质干细胞组。采用的成软骨因子包括转化生长因子β1,地塞米松和胰岛素样生长因子1,三者混合后加入到自组装多肽凝胶或骨髓间充质干细胞中。于处理后12周时处死动物行大体及组织学观察、X射线摄片、免疫组织化学法进行组织学评分评估修复情况。结果与结论：单纯自组装多肽凝胶移植在12周后显示出非常好的修复效果,可见番红O染色,Ⅱ型胶原蛋白免疫组织化学染色强度以及组织学评分明显高于其他组(P <0.05)。自组装多肽凝胶+成软骨因子组修复效果较好,与自组装多肽凝胶组相似,但其修复区域蛋白聚糖表达比对照组明显升高(P <0.01)。自组装多肽凝胶+成软骨因子+骨髓间充质干细胞组修复效果不佳,12周未能完全修复缺损区域,与单纯自组装多肽凝胶组比较骨赘的形成有所增加。结果表明,单纯自组装多肽凝胶能够在原位修复骨软骨缺损并促进软骨修复,提示以自组装多肽凝胶支架移植有望提高目前修复软骨缺损的效果。     

胶原支架复合兔骨髓间充质干细胞体外模拟的微重力培养

背景:骨髓间充质干细胞向软骨细胞诱导的方法包括体外高密度微团培养、体外单层细胞培养、体外三维支架环境诱导、与软骨细胞体外共培养诱导和基因转染诱导培养等.目的:验证模拟微重力条件下诱导后的兔骨髓间充质干细胞在Ⅰ、Ⅱ型胶原支架上黏附、伸展和增殖情况.方法:对兔骨髓间充质干细胞体外进行原代和传代培养,按加入诱导条件不同分为2组:实验组(转化生长因子β1+ 胰岛素样生长因子1诱导)组、空白对照组.3周后分别作MTT比色试验、糖胺聚糖检测和免疫组织化学染色.将诱导后的实验组细胞分别种植于Ⅰ、Ⅱ型胶原支架,分为4组培养:复合Ⅱ型胶原支架静置培养、复合Ⅱ型胶原支架模拟微重力培养组、复合Ⅰ型胶原支架静置培养、复合Ⅰ型胶原支架模拟微重力培养组,1周后作苏木精-伊红、甲苯胺蓝染色.结果与结论:实验组MTT吸光度值和糖胺聚糖水平检测结果均大于空白对照组,且Ⅱ型胶原免疫组织化学检测阳性.苏木精-伊红、甲苯胺蓝染色显示,Ⅱ型胶原支架复合细胞的数量明显高于Ⅰ型胶原支架;模拟微重力培养条件下胶原支架复合细胞的数量明显高于静置培养组.结果说明微重力培养环境有利于高密度细胞的黏附、增殖,有利于细胞之间的信号传递,为维系细胞的生长和代谢提供适宜的微环境;作为诱导后骨髓间充质干细胞的支架材料Ⅱ型胶原支架优于Ⅰ型胶原.     

纳米晶羟基磷灰石胶原复合骨髓间充质干细胞修复骨缺损

背景:临床上对大范围骨缺损还没有很有效的治疗手段,而纳米晶羟基磷灰石胶原复合材料与天然骨骼的结构类似,具有较好的生物相容性,可能为修复骨缺损提供新的途径.目的:观察纳米晶羟基磷灰石胶原材料复合骨髓间充质干细胞在修复骨缺损中的作用.方法:分离培养人骨髓间充质干细胞,与纳米晶羟基磷灰石胶原材料于体外联合培养;通过大体观察、组织学分析及电镜观察了解成骨情况,进一步临床应用于修复骨缺损.结果与结论:人骨髓间充质干细胞在体外可以大量扩增,复合细胞的材料植入骨缺损处后,X射线摄片动态观察可见骨缺损处连接良好.说明骨髓间充质干细胞具有成骨细胞作用,纳米晶羟基磷灰石胶原材料是一种很好的构建组织工程骨的支架材料.     

微重力三维动态诱导骨髓间充质干细胞复合可注射型支架材料Pluronic F-127修复关节软骨缺损

目的:利用三维动态诱导的同种异体非软骨来源种植细胞,复合可注射型支架材料聚氧乙烯聚氧丙烯共聚物Pluronic F-127修复关节软骨缺损。方法:实验于2005-06/2006-03在哈尔滨医科大学附属第一医院动物实验中心完成。①选取2个月龄新西兰大白兔27只,3只用于骨髓间充质干细胞的分离,剩余24只随机数字表法分为诱导细胞复合支架组、单纯支架组、空白对照组,8只(16膝)/组。可注射型支架材料Pluronic F-127为白色粉沫状,无味,其水溶液在低温4℃呈液态,37℃形成固态凝胶(sigma公司,产品批号P2443)。②兔麻醉后穿刺抽取胫骨骨髓,分离培养骨髓间充质干细胞,取3代细胞进行实验。③收集细胞,离心成团,分4组不同诱导条件。三维动态培养组:10g/L藻酸钠溶液洗涤并重新悬浮细胞,细胞浓度为5×1010L-1,滴入200mmol/L氯化钙溶液,立即形成藻酸钙凝胶微球,细胞被悬浮固定于球内部,静止5min,取出凝胶微球,置于旋转式细胞培养系统,微重力条件下动态诱导。二维动态培养组:细胞直接接种于旋转式细胞培养系统,微重力条件下动态诱导。三维静态培养组:藻酸钙凝胶微球悬浮细胞接种于培养瓶静态培养。二维静态培养组:细胞直接接种于平面培养瓶静态培养。各组细胞诱导培养2周,制备切片,分别行甲苯胺蓝染色及Ⅰ、Ⅱ型胶原免疫组织化学染色。柠檬酸钠溶液溶解藻酸钙凝胶微球,测定各组胶原和蛋白多糖含量。④各组兔的双膝均制备膝关节全层软骨缺损模型。诱导细胞复合支架组选取诱导分化最佳的骨髓间充质干细胞与25%可注射型支架材料Pluronic F-127在低温下混匀,重悬,细胞终浓度为5×1010L-1,注入股骨内髁软骨缺损区。单纯支架组只将25%Pluronic F-127注入股骨内髁软骨缺损区。空白对照组关节软骨缺损区不作任何处理。各组分别于术后4,8,12,24周取材,大体及镜下观察关节软骨表面缺损修复情况,同时进行组织学评分。结果:24只兔全部进入结果分析。①骨髓间充质干细胞体外诱导培养及鉴定结果:藻酸钠接触钙离子迅速形成透明凝胶微球,有光泽,凝胶微球中的细胞呈球形,核仁清晰,与正常软骨细胞立体结构相似。培养过程中各组细胞甲苯胺兰染色均呈阳性,并表达Ⅱ型胶原,但无明显Ⅰ型胶原表达。②不同体外诱导分化条件下细胞生化指标的表达:三维、二维动态培养组的胶原和蛋白多糖含量均明显高于三维、二维静态培养组,且以三维动态培养组效果最佳[(0.078±0.002),(0.048±0.002),(0.035±0.001)A,P<0.05;(0.111±0.003),(0.069±0.003),(0.058±0.002)A,P<0.05]。③关节软骨缺损修复情况:诱导细胞复合支架组术后12周修复软骨表面光滑,质地坚硬,为透明软骨组织结构,与周围软骨结合紧密,至24周仍保持透明软骨形态;而单纯支架组、空白对照组均未被修复。术后4,8,12,24周,诱导细胞复合支架组关节软骨组织学评分均优于单纯支架组、空白对照组(P<0.05),且术后时间越长,修复效果越佳。结论:微重力条件下三维动态诱导骨髓间充质干细胞可提高分化质量,获得的种植细胞复合可注射型支架材料修复关节软骨缺损能够取得稳定的长期修复效果。     

骨膜复合骨髓间充质干细胞和软骨细胞体内移植修复软骨缺损

背景:以往主要采用磨削灌洗、钻孔、微骨折技术等对软骨缺损组织进行修复,但多数技术被认为具有一定的局限性,只能减轻患者疼痛或仅短期有效。近年来越来越多的研究表明,软骨组织工程修复技术对于软骨再生及修复具有重要意义。目的:观察自体骨膜复合骨髓间充质干细胞和软骨细胞修复兔膝关节髁间窝软骨缺损的效果。方法:取新西兰大白兔28只,随机均分为两组,建立双侧膝关节髁间窝关节软骨缺损模型,实验组左侧植入自体骨膜与骨髓间充质干细胞-软骨细胞复合物,右侧不植入任何材料作为空白对照;对照组左侧植入自体骨膜,右侧不植入任何材料作为空白对照。术后第8,12周,取膝关节软骨缺损部位新生组织,行大体、组织学观察及Wakitani评分。结果与结论:术后12周,实验组修复组织表面基本光滑,与周围软骨色泽极其相近,出现大量软骨细胞及软骨陷窝,形成软骨基质,Ⅱ型胶原免疫组织化学染色呈阳性,甲苯胺蓝染色较深;对照组修复组织仍为白色,新生修复组织局部凹陷,表面欠光滑,质地较硬,仅有极少量软骨细胞,甲苯胺蓝染色较浅,Ⅱ型胶原免疫组织化学染色呈阴性,无软骨基质形成;空白对照组软骨缺损塌陷,表面不规则,修复组织为纤维组织,甲苯胺蓝染色较浅。表明自体骨膜复合骨髓间充质干细胞与软骨细胞移植能够较好修复关节软骨缺损。     

人骨髓间充质干细胞的培养及多能性研究

目的：培养人骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSC）并检测其多能性。方法：抽取人胚胎骨骨髓，Percoll分离液梯度分离后，将含MSC的低密度层培养于MSCGM培养基并扩增MSC。将MSC种植于裸鼠皮下，4周后观察MSC的分化情况。结果：成功地进行了MSC的原代和传代培养。植入裸鼠体内后MSC可分化成骨、软骨、脂肪、骨骼肌、肌腱样组织等结构。结论：人MSC是一种具有多能性的干细胞。     

骨髓间充质干细胞的体外培养及定向诱导分化

目的:探讨人骨髓间充质干细胞(hMSCs)的体外培养生长特性及其在体外定向分化为神经样细胞的条件。方法:采用Ficoll-paque(1.077g/ml)分离液密度梯度分离hMSCs,显微镜下观察其生长特性,测定生长曲线;取传至3～6代的hMSCs,用阿魏酸钠对其进行诱导培养,并以β-巯基乙醇作对照观察诱导培养后细胞的形态变化,分别在6h、1d、3d和7d通过免疫荧光细胞化学染色方法测定诱导后细胞的神经元烯醇化酶(neuron specific enolase,NSE)和胶质纤维酸性蛋白(glia fiber acidprotein,GFAP),进行定量分析。结果:体外培养条件下hMSCs呈长梭形,细胞生长曲线呈S形,细胞倍增时间约为72h。阿魏酸钠诱导培养后6h可见细胞形态明显变化,NSE和GFAP表达阳性。24h后诱导细胞表现为典型的神经细胞样形态。第3天,NSE和GFAP表达最高,分别为67±3.5%和39±1.8%。结论:人骨髓间充质干细胞在体外具有自我更新能力及多分化潜能;阿魏酸钠具有诱导体外培养的人骨髓间充质干细胞向神经细胞分化的作用。     

生物衍生骨与骨髓间充质干细胞复合修复免桡骨大段缺损

背景:生物衍生支架材料具备与自身骨相似的结构和微环境,具有较好的应用前景.目的:探讨生物衍生骨复合成骨诱导的骨髓间充质干细胞修复兔桡骨的节段性骨缺损的可行性,并与单纯生物衍生骨进行比较.设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2007-01/2008-01在南华大学生命科学院实验室完成.材料:同种异体骨经脱脂、脱蛋白、部分脱钙和冻干等方法处理后制备生物衍生骨支架材料,与自体骨髓间充质干细胞复合制备组织工程骨支架材料.方法:25只健康成年新西兰大白兔双侧桡骨制备中段15 mm的骨缺损,随机取其巾20只兔右侧桡骨为实验组植入组织工程骨,左侧为对照组植入单纯生物衍生骨,不做内外固定;另5只兔双侧骨缺损处不植入任何材料作为空白组.主要观察指标:应用X射线放射学检查及组织学观察比较3组骨缺损修复的能力.结果:X射线显示随时间延长骨折处骨痂逐渐增多,实验组8周基本愈合,12周塑形完成;对照组骨痂少,愈合时间推迟;空白组术后12周骨缺损未见骨性修复,最后形成骨不连.术后2,4,8,12周实验组放射学检查评价新骨生成优于对照组(P< 0.05).组织学检查显示实验组术后4周时材料开始吸收,8周基本降解吸收被新生骨取代,12周完全修复;对照组明硅推迟,新骨生成速度、生成量低于实验组(P<0.05);空白组各时点均无新骨形成,最后缺损由纤维组织充填.结论:成骨诱导的问充质干细胞/生物衍生骨复合构建组织工程化骨植入修复兔桡骨缺损能够加速新骨形成,其修复能力明显优于单纯生物衍生骨.     

骨髓间充质干细胞复合异体骨修复松质骨缺损*

背景：有研究表明骨髓间充质干细胞及异体骨可促进骨缺损的修复,但骨髓间充质干细胞复合异体骨对于松质骨缺损的修复效果至今少有报道。目的：观察骨髓间充质干细胞复合异体骨修复兔松质骨缺损效果。方法：在新西兰大白兔双侧股骨外侧髁造成0.6 cm×1.2 cm 的松质骨缺损,一侧设为模型组,骨缺损处植入复合骨髓间充质干细胞的异体骨,另一侧设为对照组,单纯植入异体骨。结果与结论：植入后4,8,12周,大体观察、X 射线检查和苏木精-伊红染色观察结果显示,模型组在新骨成长方面,缺损区修复方面均优于对照组。植入后12周,模型组骨缺损区可见大量骨小梁形成及成熟的板层骨组织,骨缺损基本修复。对照组骨缺损区仅可见大量编织骨形成,骨缺损尚未得到有效修复。模型组Lane-Sandhu 法 X 射线结合组织学观察评分高于对照组(P <0.05)。生物力学检测结果显示,植入后12周,模型组股骨髁最大压力载荷、载荷/应变比值均高于对照组(P <0.05),最大应变位移较对照组低(P <0.05)。结果证实,骨髓间充质干细胞复合异体骨可有效修复兔股骨髁松质骨缺损,且修复效果明显优于单纯异体骨移植。     

基因修饰骨髓间充质干细胞修复关节软骨损伤

背景：随着生物技术的发展,通过转基因技术修饰细胞,从而获得长期稳定表达的生物活性因子以治疗关节软骨损伤逐渐引起重视。目的：就基因修饰的骨髓间充质干细胞在修复关节软骨损伤中的应用作一综述。方法：由第一作者检索1990至2011年PubMed数据库（http：／／www．ncbi．nlm．nih.gov／PubMed）有关基因修饰骨髓间充质干细胞修复关节软骨损伤的文献,英文检索词为“cartilage,genetherapy,mesenchymalstemcells,tissueengineering,bioactivefactor,vector”。共纳入15篇文献归纳总结。结果与结论：骨髓间充质干细胞已被广泛应用于修复关节软骨损伤。通过转基因技术将特定外源基因导入骨髓间充质干细胞,联合细胞治疗和基因治疗可达到更好的治疗效果,在关节软骨损伤的治疗中有广阔的应用前景。     

丝素蛋白支架材料复合骨髓间充质干细胞构建组织工程化软骨

背景：一些研究已证明丝素蛋白是细胞立体培养的良好支架。目的：拟观察丝素蛋白作为支架材料复合骨髓间充质干细胞修复关节软骨缺损的可行性。设计、时间及地点：随机对照动物实验,于2006-08/2007-11在江苏省血吸寄生虫病防治研究所完成。材料：新西兰大白兔27只,雌雄不拘,体质量1.5~2.0kg,制备关节全层软骨缺损模型;丝素蛋白材料由苏州大学材料学院李明忠教授提供。方法：分离培养并定向诱导兔骨髓间充质干细胞分化为软骨细胞,与丝素蛋白膜材料复合培养,建立兔膝关节股骨髁间软骨缺损。27只大白兔随机抽签法分为3组,每组9只。复合组植入细胞/丝素蛋白材料复合物;丝素蛋白组植入单纯丝素蛋白材料,空白组不行任何植入。主要观察指标：扫描电镜观察细胞在材料上的生长情况;4,8,12周时取材观察软骨缺损修复情况。结果：骨髓间充质干细胞诱导后在材料上生长良好。骨髓间充质干细胞与丝素蛋白复合8周后,在兔膝关节内即形成软骨样细胞,且细胞外基质非常丰富,12周后与周围软骨色泽相近,表面光整,支架材料基本吸收,未见明显退变和淋巴细胞或白细胞浸润,所有标本均未见丝素蛋白残留。丝素蛋白组呈纤维软骨样修复,空白组基本没有修复。结论：用丝素蛋白复合骨髓间充质干细胞可形成透明软骨修复动物膝关节全层软骨缺损,显示了丝素蛋白材料作为关节软骨组织工程支架材料的良好生物相容性。     

脱细胞支架复合兔骨髓间充质干细胞构建组织工程血管

背景:目前临床使用的小口径(<6 mm)人工血管因生物相容性差、远期通畅率低,效果并不理想.因此,学术界一直致力于寻找具有正常血管生物学功能的血管代用品,组织工程血管的构建与功能研究已成为目前热门研究课题.目的:将兔骨髓间充质干细胞与脱细-胞血管支架动态复合培养体外构建组织工程血管,通过体内移植实验,探讨该组织工程血管的组织相容性及通畅率.设计、时间及地点:随机对照实验,细胞学、组织病理学观察,于2006-01/2008-06在南京大学医学院附属鼓楼医院实验室完成.材料:通过去污剂-酶消化法制备兔腹主动脉脱细胞支架;采用密度梯度离心法结合贴壁分离培养法,分离扩增兔骨髓间充质干细胞,将扩增后的干细胞静态种植于脱细胞支架后置于生物反应器中动态培养构建组织工程血管.方法:60只兔随机均分为3组,剪取一段腹主动脉长约1.0 cm,再将移植血管以8/0聚丙烯线间断外翻吻合到腹主动脉上.组织工程血管组:受体为对应抽取骨髓干细胞的实验兔,以组织工程血管为移植血管;脱细胞血管支架组:以脱细胞处理的同种异体腹主动脉为移植血管;同种异体血管组:以同种异体新鲜腹主动脉作为移植血管.主要观察指标:对培养的骨髓间充质干细胞进行免疫组化鉴定;血管移植后3个月行数字减影血管造影、病理切片、扫描电镜等观察移植效果.结果:兔骨髓间充质干细胞在体外培养8 d后形成漩涡状排列,免疫组化结果符合间充质干细胞表型特征:将间充质干细胞与脱细胞支架置于生物反应器培养12 d后,种子细胞在血管腔内黏附生长;血管移植3个月后,组织工程血管组、脱细胞血管支架组通畅率分别为90%,80%,均优于同种异体血管组(25%).移植3个月后苏木精一伊红染色及扫描电镜结果显示,组织工程血管组形成清晰的内、中、外膜3层结构,形态接近正常动脉,内皮细胞覆盖完整;脱细胞血管支架组血管内表面内皮细胞覆盖不完整,伴有附擘血栓形成,内膜轻度增生,伴炎性细胞浸润:同种异体血管组内膜极度增厚、坏死,管腔明显狭窄,伴不同程度的血栓机化.结论:将兔骨髓间充质干细胞复合脱细胞血管支架上,可获得一种具有良好生物相容性和通畅率的生物人工血管.     

骨髓间充质干细胞体外诱导分化软骨细胞表型的可行性

目的：探讨在体外特定培养条件下诱导绵羊骨髓间充质干细胞定向分化为软骨细胞表型的可行性。 方法：实验于2005—09／2006—02在首都医科大学细胞与遗传实验室完成。选择1岁龄骨骼成熟的健康绵羊，雌雄不拘，体质量20—30kg。①采用Percoll分离液，经密度梯度离心法自成年绵羊髂骨骨髓分离得到间充质干细胞，体外培养至第3代时，将骨髓间充质干细胞分为2组，实验组细胞贴壁后更换培养液，以无血清H—DMEM特定培养液诱导（内含转化生长因子β3 10μg/L、地塞米松10^-7mol／L、胰岛素样生长因子I10μg/L、维生索C50mg／L），对照组加含10％胎牛血清的L—DMEM培养液，3d换液一次。②在相差显微镜和透射电镜下观察细胞形态和超微结构，分别在诱导后的第7天、14天取出玻片，进行细胞形态学、组织化学和免疫组织化学分析，甲苯胺蓝染色和Ⅱ型胶原免疫组化鉴定间充质干细胞诱导后的软骨细胞表型。 结果：①相差显微镜观察实验组诱导14d后，细胞形态由梭形逐渐向多角形、多边形转变。并出现聚集成堆现象，而对照组细胞仍保持均一的梭形，增殖能力非常旺盛。②透射电镜可见实验组诱导14d后的骨髓间充质干细胞周边绒毛增多，胞浆内富含粗面内质网、高尔基体和线粒体，表明细胞合成代谢旺盛。而对照组的骨髓间充质干细胞的细胞壁较光滑，胞核呈条状，核壁有许多皱裴和突起，细胞器也比较丰富。③免疫组织化学观察实验组诱导14d后甲苯胺蓝染色和Ⅱ型胶原染色阳性。而对照组诱导14d后甲苯胺蓝染色阳性，Ⅱ型胶原免疫组化染色则为阴性。 结论：骨髓间充质干细胞在特定的诱导条件下能够分化为软骨细胞表型．可为软骨组织工程提供较为理想的种子细胞来源。     

丝素蛋白材料复合骨髓间充质干细胞修复皮肤创面☆◆

背景:丝素蛋白材料具有良好的生物相容性。目的:观察丝素蛋白材料复合骨髓间充质干细胞修复大鼠全层皮肤缺损的可行性。方法:应用5-溴脱氧尿核苷标记SD大鼠骨髓间充质干细胞,并复合丝素蛋白材料培养。建立SD大鼠全层皮肤缺损模型,随机分组:实验组移植同种异体骨髓间充质干细胞与丝素蛋白材料复合物,细胞组移植骨髓间充质干细胞,对照组移植丝素蛋白材料,空白组不作处理。结果与结论:①大体观察:空白组术后8周仍可见坏死组织,且瘢痕挛缩明显;细胞组与空白组愈合情况相近。对照组术后8周未愈合,有少量瘢痕形成,与周围皮肤融为一体。实验组术后4周创面无明显瘢痕形成,术后8周愈合良好。②组织学观察:实验组术后4周免疫荧光染色显示带有5-溴脱氧尿核苷标记的骨髓间充质干细胞定位在重建的表皮和真皮组织中,术后8周创面愈合良好;细胞组免疫荧光染色显示少量带有5-溴脱氧尿核苷标记的骨髓间充质干细胞存在。表明丝素蛋白材料与骨髓间充质干细胞联合移植可修复大鼠全层皮肤缺损。     

人关节液促进骨髓间充质干细胞的定向分化

背景：目前的众多研究都是通过体外加入生长因子诱导骨髓间充质干细胞分化,但该方法细胞因子用量大,成本高,随着培养次数的增加,其成软骨潜能明显降低。 目的：混合培养人关节液与人骨髓间充质干细胞,观察共培养系统对人骨髓间充质干细胞定向诱导分化的影响。方法：采用全骨髓、贴壁培养法培养和分离人骨髓间充质干细胞,无菌操作下抽取健康志愿者的膝关节液,将其与P3代细胞混合用于实验,分为3组,关节液＋完全培养基,关节液＋人骨髓间充质干细胞＋完全培养基,人骨髓间充质干细胞＋完全培养基。每天在倒置显微镜下观察细胞形态变化和生长情况,分别于诱导后第7,14,21天行甲苯胺蓝染色检测和Ⅱ型胶原免疫组化染色检测。 结果与结论：人关节液与人骨髓间充质干细胞混合培养后,细胞增殖速度减慢,由长梭形变为多角形、椭圆形,细胞外基质呈甲苯胺蓝异染性阳性,Ⅱ型胶原免疫组化染色阳性。说明关节液对人骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化有正性促进作用,关节液中可能含有促人骨髓间充质干细胞向软骨细胞方向分化的物质。     

同种异体脱钙松质骨基质材料复合自体骨髓间充质干细胞修复全层关节软骨缺损

背景：到目前为止，还没有一种十分有效的方法治疗关节软骨缺损。许多治疗方法都只能缓解临床症状，而不能有效促进软骨的再生，也不能恢复软骨表面的承重功能。目的：观察脱钙骨基质复合骨髓间充质干细胞修复兔膝关节全层软骨缺损的疗效。设计、时间及地点：随机对照动物实验，分别于2005—01／03在兰州大学第二医院骨科研究所和2008-05／08在桂林医学院中心实验室完成。材料：取新西兰兔四肢骨干骺端及椎体松质骨，脱钙制备脱钙松质骨基质材料；体外分离培养同种新西兰兔骨髓间充质干细胞种植于脱钙骨基质支架上体外培养。36只新西兰兔随机分成骨髓间充质干细胞复合同种异体脱钙骨填充组（简称复合组）、同种异体脱钙骨填充组及空白对照组，每组12只。方法：在髁间窝髌面上用直径4mm的钻头钻孔深约3mm造成膝关节全层软骨缺损模型。复合组双侧股骨髁间窝软骨缺损处植入脱钙骨基质吸附体外分离培养的自体骨髓间充质干细胞复合物；同种异体脱钙骨填充组单纯植入脱钙骨基质；空白对照组不作任何植入。主要观察指标：分别于植入后4，8，12周取材进行组织学及免疫组化染色观察，根据关节软骨组织学计分标准进行评分。结果：36只新西兰兔均进入结果分析。复合组所修复组织为透明软骨样修复：而同种异体脱钙骨填充组和空白对照组为纤维性修复。植入后12周复合组大体评分及组织学评分明显低于同种异体脱钙骨填充组和空白对照组（P〈0．05）；同种异体脱钙骨填充组低于空白对照组（P〈0．05）。结论：运用软骨组织工程的原理，以脱钙骨基质为支架材料的自体骨髓间充质干细胞移植是一种修复软骨缺损的行之有效的方法。