肝癌树突状细胞瘤苗诱导抗肿瘤作用的研究

目的：研究负载肝癌抗原的肝癌树突状细胞（dendritic cell,DC）瘤苗诱导的抗肿瘤作用。方法：于体外用rhGM-CSF和rhIL-4从肝癌患者外周血诱导DC,并用肝癌细胞抗原冲击致敏,制成负载肝癌抗原的肝癌DC瘤苗。肝癌DC瘤苗活化自体T淋巴细胞分化为细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic of T-lymphocytes,CTL）,采用流式细胞术检测CTL分型;乳酸脱氢酸（LDH）4 h释放法检测CTL对肝癌细胞的特异性杀伤作用。MTT法检测肝癌DC瘤苗及其活化CTL培养上清对肿瘤细胞的抑制作用;ELISA法检测肝癌DC瘤苗活化的CTL培养上清中IL-12、IFN-γ和TNF-α水平。结果：经肝癌DC瘤苗活化后的T淋巴细胞群中,CD56^＋细胞数量显著减少,CD4^＋T和CD8^＋T细胞数量增加,其中以CD8^＋T细胞增加较明显;细胞毒实验显示,该CTL对自体肝癌细胞具有较强的杀伤作用,而对与致敏DC的肝癌抗原无关的CT26结肠腺癌细胞无明显杀伤作用;单纯肝癌DC瘤苗或其激活的CTL培养上清也表现出较强的抑瘤作用,而且这种抑瘤作用具有广谱性,可抑制多种肿瘤细胞的生长;在CTL培养上清中可检测到IL-12、TNF-α和IFN-γ的含量。结论：肝癌DC瘤苗不仅诱导了对肝癌细胞的特异性CTL杀伤作用,而且可激活CD4^＋T和CD8^＋T细胞分泌IL-12、TNF-α和IFN-γ等细胞因子,以非杀伤方式直接或间接地抑制肿瘤细胞生长,发挥非特异性的抗肿瘤作用。     

H22微波瘤苗免疫小鼠抑瘤及免疫效果的研究

目的研究H22微波瘤苗免疫小鼠的抑瘤及免疫效果.方法用微波处理H22瘤株制备瘤苗,接种昆明小鼠右后肢外侧皮下0.2 mL,共接种3次,每次间隔7 d;对照组接种生理盐水.于末次接种后第7天每只小鼠左腋下皮下接种H22瘤株细胞2×106 .接种瘤株后第21天处死小鼠,测量瘤块的体积和重量,计算体积抑瘤率和重量抑瘤率,并进行血液淋巴细胞亚群分析和体内淋巴细胞转化实验.结果瘤苗组瘤块体积平均为2.86 cm3,明显小于对照组的8.02 cm3,差异有极显著意义,t＝5.711,P＝0.000,体积抑瘤率为64.34%.瘤苗组瘤块重量平均为2.55 g,明显小于对照组的6.35 g,差异有极显著意义,t′＝5.055,P＝0.000,体积抑瘤率为59.84%.瘤苗组CD3+,t=3.278,P=0.003、CD4+,t=2.548,P=0.017、CD8+,t=2.068,P=0.048和CD4+/CD8+比值,t=2.116,P=0.043,均以瘤苗组高于对照组,差异有显著意义或极显著意义.淋巴细胞转化率瘤苗组亦高于对照组,差异有极显著意义,t=4.976,P=0.000.结论H22微波瘤苗免疫小鼠对H22瘤株具有明显抑瘤作用.     

GM-CSF基因修饰的不同肿瘤瘤苗体内诱导抗肿瘤免疫功能的比较

GM-CSF作为一种重要的造血生长因子，能刺激粒细胞、巨噬细胞和树突状细胞的增殖分化，此外它还具有重要的免疫调节作用，尤其是其增强机体抗肿瘤免疫功能的作用近年来倍受重视。曾有报道，GM-CSF基因修饰的肿瘤瘤苗能诱导机体产生有效的保护性抗肿瘤免疫应答，在同一肿瘤模型中其作用强于用IL-2、     

SLC基因修饰对肿瘤细胞疫苗免疫效果的初步研究

目的：构建次级淋巴组织趋化因子（secondary lymphoid—tissue chemokine,SLC）基因修饰的趋化型恶性黑色素瘤疫苗,并初步研究其免疫效果。方法：SLC基因转染小鼠黑色素瘤细胞B16,并用适当条件的丝裂霉素处理,制备趋化型肿瘤细胞疫苗。在体外,利用趋化小室法检测趋化型疫苗培养上清对小鼠脾淋巴细胞的趋化活性。在体内,用趋化型疫苗免疫小鼠,检测脾淋巴细胞的CTL活性,并观察疫苗免疫对B16移植瘤生长的影响。结果：筛选获得了SLC基因转染的小鼠黑色素瘤B16细胞,以100μg／mL丝裂霉素处理1.5h,制备趋化型肿瘤细胞疫苗。趋化型疫苗在体外培养48h后,其培养上清对淋巴细胞具有明显的趋化活性。与野生型疫苗相比,用趋化型疫苗免疫后,小鼠脾淋巴细胞的CTL活性更强,小鼠免疫后再次接种B16细胞,肿瘤的生长受到更明显的抑制。结论：成功构建了SLC基因修饰的趋化型黑色素瘤疫苗,并在体内外初步检测到该疫苗对抗肿瘤免疫的影响和对移植瘤生长的抑制,该疫苗有可能被应用于恶性黑色素瘤的免疫治疗。     

应用SLC和Survivin共表达基因瘤苗抗肿瘤作用的研究

探讨应用次级淋巴趋化因子(secondary lymphoid chemokine, SLC)和Sur vivin共表达基因瘤苗抗肿瘤作用。方法:将SLC基因及Survivin 基因导入沙门氏菌载体,增殖并经口将此菌免疫荷瘤小鼠,观察抗肿瘤作用。结果: SLC/Survivin瘤苗对荷瘤小鼠具有较强的抗肿瘤作用。致死量D121肺癌细胞经尾静脉注入小鼠, 4 周后有87 .5% (7/8)的小鼠被证实无肿瘤生长。此保护性免疫反应可能是刺激CD8+ 细胞功能的发挥和细胞因子如γ干扰素等调节的。结论:SLC/Survivin瘤苗可诱导有效抗肿瘤反应,为将此类瘤苗使用于临床提供了一定的理论基础。     

不同途径免疫的AFP基因修饰DC瘤苗体内抗肿瘤效应的研究

目的:评价bcl-2反义寡核苷酸对肾细胞癌细胞Bcl-2蛋白表达抑制及诱导凋亡作用.方法:合成与已知人类基因无同源性的bcl-2反义寡核苷酸(AS1与翻译起始端互补,AS2与编码区互补),以阳离子脂质体Lipofectin为转染载体,MTS比色实验测定细胞活率,反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)测定bcl-2 mRNA的表达,Western杂交法测定Bcl-2蛋白表达,碘化丙啶(PI)染色流式细胞术测定凋亡细胞.结果:所测定的5个肾癌细胞株均有稳定的bcl-2 mRNA表达;转染的反义寡核苷酸对ACHN细胞Bcl-2蛋白的表达有明显抑制作用,而正义寡核苷酸无明显影响,AS2的抑制作用大于AS1;反义寡核苷酸可诱导ACHN细胞的凋亡,AS1和AS2的诱导率分别为32.1%和43.2%.结论:bcl-2反义寡核苷酸可抑制肾癌细胞Bcl-2蛋白的表达,并进而诱导细胞的调亡.     

应用SLC和Survivin共表达基因瘤苗抗肿瘤作用的研究

目的：探讨应用次级淋巴趋化因子(secondary lymphoid chemokine，SLC)和Survivin共表达基因瘤苗抗肿瘤作用。方法：将SLC基因及Survivin基因导入沙门氏菌载体，增殖并经口将此菌免疫荷瘤小鼠，观察抗肿瘤作用。结果：SLC／Survivin瘤苗对荷瘤小鼠具有较强的抗肿瘤作用。致死量D121肺癌细胞经尾静脉注入小鼠，4周后有87．5％(7／8)的小鼠被证实无肿瘤生长。此保护性免疫反应可能是刺激CD8^ 细胞功能的发挥和细胞因子如γ干扰素等调节的。结论：SLC／Survivin瘤苗可诱导有效抗肿瘤反应，为将此类瘤苗使用于临床提供了一定的理论基础。     

SC及NDV修饰的瘤苗治疗胃癌的实验疗效研究

目的 :研究中药三棱、莪术的提取物SC修饰构建的肿瘤细胞疫苗对SGC 790 1胃癌细胞株的抗瘤效应及联合新城鸡疫病毒疫苗的实验杀瘤疗效。方法 :对SGC 790 1胃肿瘤细胞进行系列处理 ,用SC(sparganiumstoloniferumBuehhum、Curcumazedoariarosc SC ,Chinesetraditionalmedicine )及NDV (新城鸡瘟病毒 )对其进行生物构建 ,修饰构建的瘤苗经免疫小鼠 (1次 /周× 4 ) 2 8d后 ,接种SGC 790 1胃肿瘤细胞 ,观察抑制肿瘤肺转移、皮下结节形成及生存时间状况。结果 :经SC修饰构建的SC SGC 790 1瘤苗能明显阻止胃癌细胞的肺转移 ,显著抑制皮下肿瘤结节形成 ,能明显延长荷瘤鼠的生存时间 ,与对照组相比差异有显著性 (P <0 0 5 )。由NDV构建的疫苗的抗瘤作用低于SC瘤苗组 ,在延长荷瘤鼠生存期方面和单瘤苗组相近 ,SC与NDV联合构建的瘤苗其抗瘤未呈生物放大及相加效应。结论 :SC修饰构建的SGC 790 1新型疫苗可以增强胃肿瘤细胞的免疫原性 ,对胃癌有较好的实验治疗效果     

自体癌固化瘤苗的研究

为探讨高温固化癌所产生的免疫远位效应，作者进行了自体癌固化瘤苗实验与临床研究。结果显示：（１）免疫小鼠（ＢＡＬＢ／Ｃ）抗肝癌（Ｈ２２）３×１０８个癌细胞攻击，有效率为９３．３％，（２）对肝癌开展固化留置（瘤苗）免疫或自体癌固化瘤苗免疫，临床有效率为７６．８％，与相应对照组（４０．５％）比较，疗效差异有显著性意义（Ｐ＜０．０１）。     

TNF-α基因修饰瘤苗的抗肿瘤作用研究

血管生成与肿瘤的发生、发展和转移有密切关系,控制血管的生成是抑制肿瘤生长和治疗的重要途径之一.本文就新生血管的定义与发生诱因,新生血管的正负调节因子,新生血管的特征,以血管为靶的肿瘤治疗策略等方面进行评述.     

MUC1肿瘤抗原表位PDTRP基因免疫诱导的体内外抗瘤效应

目的：构建MUC1肿瘤抗原表位γ1neoPDTRP质粒，基因免疫诱导机体产生有效的体内外抗瘤效应。方法： 用Insight Ⅱ将PDTRP抗原表位与MUC1分子模拟，构建含PDTRP的抗原化抗体表达质粒γ1neoPDTRP，体外转染检测表达。用该质粒基因免疫小鼠，免疫后ELISA动态检测血清中抗PDTRP抗体的产生及特异性细胞免疫应答；以4T1PDTRP肿瘤细胞攻击经γ1neoPDTRP免疫小鼠，观察免疫保护效应。结果：三串联肿瘤抗原表位PDTRPDTRPDTRP模拟了MUC1核心序列的空间结构；构建γ1neoPDTRP质粒并在体外转染表达，基因免疫小鼠诱导出特异性抗PDTRP体液和细胞免疫应答，免疫小鼠对4T1PDTRP肿瘤细胞的攻击具有显著的体内保护效应。结论：MUC1肿瘤抗原表位PDTRP可模拟MUC1核心序列的天然构象， γ1neoPDTRP基因免疫在体外诱导特异性的体液和细胞免疫应答，体内诱导对机体的免疫保护效应。     

4-1BBL基因修饰colon26细胞的体内抗肿瘤作用

背景与目的:研究4-1BBL基因修饰的小鼠结肠癌细胞瘤苗在小鼠体内诱导产生免疫反应及抗肿瘤效应的能力. 材料与方法:采用脂质体介导法将真核表达质粒pMKIT/4-1BBL导人小鼠结肠癌细胞colon26,经G418筛选后获得4-1BBL稳定高表达细胞克隆colon26/4-1BBL和空载体细胞克隆colon26/pMKITneo,以丝裂霉素C处理,制成癌细胞瘤苗.将野生型colon26、eolon26/pMKITneo和colon26/4-IBBL细胞分别接种于BALB/c小鼠右侧背部皮下,观察细胞致瘤性.取MMC处理的colon26细胞、colon26/pMKITneo细胞和colon26/4-1BBL细胞,分别腹腔免疫BALB/c小鼠,采用改良MTT法测定CTL和NK细胞杀伤活性,取血清用ELISA法测定IL-2、IFN-γ含量.于BALB/c小鼠皮下接种colon26细胞制备早期癌模型,第2 d腹腔注射colon26/4-1BBL瘤苗,7 d后再注射1次,观察肿瘤生长情况.结果:与野生型colon26和colon26/pMKITneo细胞相比,colon26/4-1BBL细胞在小鼠体内的致瘤性明显下降,表现为肿瘤结节出现时间延迟,肿瘤体积明显小于对照组(P＜0.05).MMC处理的肿瘤细胞瘤苗免疫小鼠后,colon26/4-1BBL组小鼠CTL和NK细胞的杀伤活性明显增高(P＜0.05);血清IL-2和IFN-γ的含量明显增高(P＜0.01);而且能对亲本肿瘤细胞colon26产生免疫保护作用,大部分小鼠能保持无瘤状态长期存活(100 d以上).colon26/4-1BBL瘤苗治疗后,部分小鼠保持无瘤生存,成瘤小鼠肿瘤生长缓慢,小鼠生存期明显延长(＞70 d).结论:4-1BBL基因修饰的小鼠结肠癌细胞瘤苗能显著增强小鼠的免疫功能,并能产生显著的抗肿瘤作用.     

卵巢癌细胞和脐血树突状细胞融合瘤苗抗肿瘤免疫效应的初步研究

目的：将脐血来源的树突状细胞（DC）与人卵巢癌细胞株SKOV3细胞相融合，获得SKOV3/DC融合细胞，分析其生物学特性及体外诱导抗卵巢癌肿瘤免疫的能力.方法：1）将用PKH26红色荧光染料标记脐血来源的DC后，聚乙二醇法（PEG）融合DC与人卵巢癌细胞株SKOV3细胞，流式细胞仪分选融合细胞.2）应用细胞培养技术、流式细胞术及光学显微镜检测SKOV3/DC的生长特性和形态学特征 四甲基偶氮唑蓝（MTT）法观察融合细胞体外刺激混合淋巴细胞反应的能力及诱导特异性肿瘤免疫的能力.结果：1）DC和SKOV3按10∶1比例融合，融合率约为8.5%.融合细胞可在体外缓慢增殖，CA125抗原及CD1a、CD80、CD86、HLA-DR、MHC-Ⅰ分子表达阳性.2）SKOV3/DC在体外能有效的激发混合淋巴细胞增殖反应，可明显激活细胞毒性T淋巴细胞（CTL），对卵巢癌细胞株SKOV3有特异性杀伤效应.结论：利用PEG法制备的SKOV3/DC融合细胞兼具两种亲本细胞的部分特性，在体外能够诱导特异性抗肿瘤免疫.本研究将SKOV3/DC作为肿瘤疫苗，为其在卵巢癌主动免疫治疗研究中的进一步应用打下了基础.     

莪术醇生物修饰构建的瘤苗治疗胃癌的实验研究

目的探讨中药莪术的提取物——莪术醇修饰构建的肿瘤细胞疫苗对SGC-7901胃癌的抗瘤效应及联合新城鸡疫病毒(NDV)疫苗的综合效应。方法对SGC-7901胃肿瘤细胞进行系列处理,用莪术醇及NDV对其进行系列生物构建,修饰构建的瘤苗经免疫小鼠(1次/周×3)21天后,接种SGC-7901胃肿瘤细胞,根据设计观察各组抑制肿瘤肺转移、皮下结节形成、生存时间状况及LAK细胞的杀伤效应。结果经莪术醇修饰构建的SGC-7901肿瘤疫苗与对照组相比能明显阻止胃癌细胞的肺转移,显著抑制皮下肿瘤结节形成,明显延长荷瘤鼠的生存时间(P<0.05);用各组免疫接种后长期存活的脾细胞制备的LAK细胞,较同龄未免疫小鼠的脾细胞制备的LAK细胞具有更强的抗瘤效应(P<0.05);由NDV构建的疫苗的抗瘤作用低于莪术醇瘤苗组,莪术醇与NDV联合构建的瘤苗其抗瘤作用未呈现生物放大及相加效应。结论莪术醇修饰构建的SGC-7901新型肿瘤疫苗可以增强胃肿瘤细胞的免疫原性,对胃癌有较好的实验治疗作用。     

96KD糖蛋白诱导肿瘤免疫的实验研究

目的　从 H2 2肝癌细胞中纯化 96 KD糖蛋白 ,并观察其诱导肿瘤免疫作用。方法　 ( 1)分离 96 KD糖蛋白 :H2 2肝癌细胞破膜、可溶性蛋白分级硫酸铵盐析、Co A- Sepharose亲和层析、DEAE- Sephacel离子交换层析分离、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定。 ( 2 )诱导肿瘤免疫 :用不同剂量 96 KD糖蛋白分别皮下免疫 5组小鼠 ,每周 1次 ,连续两周 ,末次免疫后的第 7天用 2× 10 5H2 2细胞攻击 ,观察各组肿瘤发生率及瘤重并与对照组比较。结果　不同剂量免疫组皆显示保护作用 ,用 18μg/只 96 KD糖蛋白免疫组效果最明显。结论　使用从 H2 2肝癌细胞中分离的 96 KD糖蛋白免疫小鼠后 ,对同类癌细胞攻击显示有效的免疫保护作用。     

异位hCGβ基因免疫诱导的特异性抗肿瘤免疫应答

目的　观察异位hCGβ基因免疫诱导的肿瘤特异性免疫应答及其抗肿瘤作用 ,为肿瘤的免疫生物治疗寻求新途径。方法　构建含hCGβ编码基因的质粒TR4 2 1 hCGβ ,对BALB/c小鼠实施基因免疫 ,并以空质粒为对照。采用ELISA法和3 H TdR掺入法分别检测免疫小鼠血清中特异性抗hCGβ IgG抗体及其对肿瘤细胞体外生长的抑制作用 ;特异抗原体外刺激免疫小鼠脾细胞后 ,用3 H TdR掺入法和3 H TdR释放法分别检测其特异性增殖活性和细胞毒活性 ;皮下接种SP2 /0 hCGβ细胞攻击免疫小鼠 ,以成瘤率及实体瘤重量评估体内抗瘤效果。结果　全部TR4 2 1 hCGβ质粒免疫小鼠均产生高水平的抗hCGβ IgG抗体 ,该抗体可抑制肿瘤细胞的体外生长 ,与对照血清相比 ,差异有显著差性 (P <0 .0 5 ) ;hCGβ蛋白、灭活SP2 /0 hCGβ细胞以及两者混合均能刺激TR4 2 1 hCGβ质粒免疫小鼠脾细胞的体外增殖 (SI值分别为 1.5 3、1.81和 2 .0 5 ) ,与空质粒免疫小鼠相比 ,差异有显著性 (P <0 .0 1) ;特异抗原刺激的TR4 2 1 hCGβ质粒免疫小鼠脾细胞对SP2 /0 hCGβ细胞的细胞毒活性明显高于SP2 /0细胞(P <0 .0 1) ;空质粒免疫小鼠接种SP2 /0 hCGβ细胞后成瘤率为 10 0 % ,瘤重达 3.37g ,而TR4 2 1 hCGβ质粒免疫小鼠的成瘤率为 16 .6 6 % ,瘤重为     

人巨噬细胞炎性蛋白-1β基因修饰肿瘤细胞的体内致瘤性和瘤苗效果

目的 探讨人巨噬细胞炎性蛋白-1β(hMIP-1β)基因修饰小鼠结肠腺癌CT26细胞的致瘤性和瘤苗免疫效果.方法 通过重组腺病毒载体介导,将hMIP-1β基因导入CT26细胞中,X-gal染色法检测基因转染效率;采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测hMIP-1β基因修饰CT26细胞培养上清中hMIP-1β的含量;采用Boyden趋化小室法检测培养上清对CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、NK细胞和未成熟树突状细胞(imDC)的趋化作用.BALB/c小鼠皮下接种hMIP-1β基因修饰的CT26细胞,观察其体内致瘤性的改变和对免疫细胞的趋化作用;制备hMIP-1β基因修饰的CT26细胞瘤苗并免疫BALB/c小鼠,观察其诱导免疫细胞的杀伤活性和保护性免疫反应.结果 腺病毒载体可介导hMIP-1β基因转染CT26细胞和表达,X-gal染色的阳性率可达95.0%以上.在培养上清中hMIP-1β水平为980 pg/ml细胞,并对CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、NK细胞和imDC有显著的趋化作用,与转染对照基因LacZ的CT26细胞及野生型CT26细胞比较,差异有统计学意义(P＜0.01).体内致瘤实验显示,hMIP-1β基因修饰的CT26细胞皮下接种后,成瘤率降低,肿瘤生长速度减慢,肿瘤内可见明显坏死灶,坏死灶内和周围可见较多淋巴细胞浸润.hMIP-1β基因修饰的CT26细胞瘤苗免疫小鼠能有效诱导肿瘤特异性CTL活性和非特异性NK活性,产生明显的免疫保护作用,可抵抗肿瘤细胞的再攻击.结论 hMIP-1β基因修饰的CT26细胞致瘤性显著下降,其瘤苗可诱导强烈的抗肿瘤免疫反应,提示hMIP-1β基因修饰瘤苗有望成为更有效的抗肿瘤免疫治疗手段.     

鼠胎肝细胞对S180荷瘤小鼠免疫功能影响及抗肿瘤作用的实验研究

目的 :观察胎肝细胞 (FLC)对肉瘤 180 (S180 )小鼠的免疫功能影响和抗肿瘤作用。方法 :建立S180荷瘤小鼠并以鼠胎肝细胞悬液 (FLC)给予治疗 ,并检测T细胞亚群、巨噬细胞免疫球蛋白Fc受体(IgFcR)的表达、淋巴细胞转化率的程度及抑肿瘤生长率。结果 :鼠胎肝细胞悬液可以提高CD3 、CD4 、CD8的表达 ,分别为 4 0 74± 2 95 (P <0 0 1)、37 5 3± 4 88(P <0 0 2 )、2 4 99± 2 74 (P <0 0 5 ) ;提高巨噬细胞FcR的表达及淋巴细胞转化率 (P <0 0 5 ) ;对肿瘤的抑制率不明显 (P >0 0 5 )。结论 :鼠胎肝细胞悬液可以提高细胞亚群的活化 ,提高细胞免疫功能 ,还可以从体液免疫来提高机体的免疫力 ,从而提高机体对肿瘤的抵抗力 ,但对肿瘤抑制不够显著