端粒酶活性的抑制对顺铂诱导K562细胞凋亡的影响

目的 利用人类端粒酶逆转录酶（hTERT)基因反义寡核苷酸（ASODN）抑制K562细胞端粒酶活性后,探讨顺铂对K562细胞凋亡的影响。方法 采用聚合酶链反应－酶联免疫吸附法（PCR－ELISA）检测端粒酶活性的变化;以间接免疫荧光标记法通过流式细胞仪检测hTERT蛋白表达含量的变化。琼脂糖凝胶电泳分析细胞凋亡的DNA断裂;用流式细胞仪对细胞凋亡峰进行定量分析。结果 hTERT基因ASODN作用于K562细胞后,hTERT蛋白的表达水平及端粒酶活性下降;ASODN作用于K562细胞24h再加入顺铂作用72h,经琼脂糖凝胶电泳即可见到DNA梯形条带,而正义寡核苷酸（SODN）与顺铂联合作用组及单独应用顺铂均未见到明显的DNA梯形条带。hTERT基因ASODN作用于K562细胞24h,再加入5μmol/L顺铂作用48,72h的凋亡细胞百分率（17．43％和20．34％）分别与SODN联合顺铂作用组（7．43％和9．23％）、单用顺铂作用组（5．49％和7．34％）进行比较,差异有显著性（P＜0．01）。结论 以hTERT基因mRNA起始密码区为靶点的ASODN能特异性地抑制K562细胞的端粒酶活性;端粒酶活性的下调可促进顺铂诱导K562细胞凋亡。     

端粒酶活性的抑制对顺铂诱导HL—60细胞凋亡的影响

采用端粒酶聚合酶链反应-酶联免疫吸附测定(PCR ELISA)的方法,检测人类端粒酶逆转录酶(hTERT)基因反义寡脱氧核苷酸(ASODN)处理HL-60细胞前后端粒酶活性的改变,并进一步通过姬姆萨染色及流式细胞术方法,分析HL-60细胞的端粒酶活性受到抑制后顺铂对HL60细胞凋亡的影响.结果显示hTERT基因ASODN作用于HL60细胞后,端粒酶活性表现逐渐下降;hTERT ASODN与顺铂联合可诱导HL-60细胞出现一系列特征性的凋亡细胞的形态学变化;hTERT基因ASODN作用于HL-60细胞24小时再加入顺铂,用流式细胞术测定凋亡细胞的百分率明显高于正义寡核苷酸(S)DN)联合顺铂作用组和单用顺铂作用组(P＜0.01).然而,hTERT基因的ASODN下调HL-60细胞的端粒酶活性以后,再用DNR和Ara-c处理不能加速HL-60细胞的凋亡.以上的结果表明了端粒酶活性的下调可选择性促进顺铂诱导HL-60细胞凋亡.     

p53基因诱导白血病细胞凋亡的机制研究

目的：探讨p53基因诱导白血病细胞凋亡过程中内源性TGF-β1、TNF-α、端粒酶活性、Bcl-2表达的改变及其意义。方法：利用脂质体将温敏型p53基因[pN53cG(Val135)]导入p53基因缺失的白血病细胞系HL-60、K562细胞，经G418筛选，获得稳定表达p53蛋白的抗性克隆细胞HL-60pN53cG，K562-pN53cG细胞。采用缺口末端标记法、片段化DNA分析、RT-PCR、定量PCR、ELISA、PCR-ELISA、流式细胞术等方法检测外源性p53基因诱导白血病细胞凋亡过程中TGF-β1、TNF-α、bcl-2、端粒酶反转录酶(hTERT)mRNA表达变化、细胞上清TGF-β1水平和端粒酶活性及。TGF-β1、TNF-α反义PS-ODNS对白血病细胞凋亡和Bcl-2蛋白表达的影响。结果:①外源性野生型p53基因诱导细胞凋亡过程中内源性。TGF-β1和TNF-α mRNA表达上调，bcl-2及hTERT mRNA表达下调，细胞培养上清TGF-β1蛋白水平明显升高，端粒酶活性水平下降；②TGF-β1、TNF-α反义PS-ODNS能够明显抑制野生型p53基因诱导细胞凋亡的发生，并使细胞bcl-2 mRNA及蛋白表达恢复到处理前的水平。结论：p53基因诱导白血病细胞凋亡可通过上调内源性TGF-β1和TNF-α水平，下调hTERT mRNA表达及端粒酶活性，抑制bcl-2基因表达而发挥作用。     

脐血造血干/祖细胞端粒酶相关蛋白基因hTERT和TEP1的表达及意义

目的：探讨造血／干细胞端粒酶相关蛋白基因hTERT和TEP1在造血过程中对端粒酶活性的调节作用。方法：用RT-PCR和TRAP法分别测定脐血干／祖细胞中hTERT、TEP1mRNA及端粒酶的活性。结果：在新分离的脐血单个核细胞（MNC）和CD34^-细胞中检测不到端粒酶的活性，hTERTmRNA表达阴性；CD34^ 细胞中端粒酶活性低，hTERTmRNA阳性；而TEP1mRNA在MNC、CD34^－细胞和CD34^ 细胞中均为阳性，表达水平差异无显著性。在不同细胞因子组合条件下，CD34^ 细胞体外培养7d，细胞端粒酶活性和hTERTmRNA表达增高，之后随着细胞的分化成熟，二者表达降低，在整个培养过程中，TWEP1mRNA表达无明显变化。结论在脐血造血干／祖细胞中，hTERT基因表达水平与端粒酶活性一致，hTERT基因表达水平对端粒酶的活性起关键作用，TEP1基因作用较弱。     

三氧化二砷诱导MUTZ-1细胞凋亡的端粒酶调控研究

为了研究三氧化二砷（As2O3）诱导人类骨髓增生异常综合征难治性贫血伴原始细胞过多型（MDS—RAEB）细胞株MUTZ-1细胞凋亡的端粒酶调控机制，采用端粒重复序列扩增-酶联免疫吸附试验（TRAP—ELISA）检测端粒酶活性；RT—PCR法检测端粒酶逆转录酶（hTERT）、TRF1（TTAGGG repeat binding factor 1）、TRF2（TTAGGG repeat binding factor 2）、bcl-2、bax等基因mRNA水平的表达；磷脂酰丝氨酸（PS）转位等方法检测细胞凋亡，结果表明：1—8μmol／L As2O3诱导MUTZ-1细胞凋亡呈时间、浓度依赖关系。在该浓度范围内，As2O3可下调细胞端粒酶活性。且端粒酶活性下调与凋亡细胞阳性率呈明显负相关（r=一0．938，P=0．018）。MUTZ-1细胞经As，01作用后，hTERT基因mRNA表达下调，并与端粒酶活性变化呈正相关（r=0．783，P=0.022），但As2O3对TRF1及TRF2基因mRNA表达没有明显影响.MUTZ-1细胞端粒酶活性受抑制同时，伴有bcl-2 mRNA表达下调及bcl-2／bax比值下降结论：As2O3可能通过抑制细胞端粒酶活性及hTERT表达，诱导MUTZ-1细胞凋亡。As2O3抑制MUTZ-1细胞端粒酶活性可能是诱导该凋亡机制之一。     

高三尖杉酯碱诱导HL-60细胞人端粒酶逆转录酶mRNA的变化

为了探讨高三尖衫酯碱(homohardngtonine，HHT)抑制HL-60细胞端粒酶活性的机制及意义，采用半定量RT-PCR和PCR-ELISA法检测HHT作用后的HL-60细胞人端粒酶逆转录酶(hTERT)mRNA表达和端粒酶活性的变化，用TUNEL法检测HL-60细胞的凋亡率。结果发现：与空白对照相比，0．005-0．03μg/ml,HHT作用HL-60细胞12小时，hTERTmRNA表达无明显变化，随HHT浓度增加至0．04-0．05μg/ml，hTERTmRNA表达明显下降至检测不出。与0小时相比，0．02μg/ml HHT作用6-18小时后，HL-60细胞hTERT mRNA表达无明显变化，24小时后hTERT mRNA表达明显减少，至30小时未能检出hTERT mRNA表达。HL-60细胞端粒酶活性的抑制与hTERT mRNA的表达下降趋势基本一致。随HL60细胞hTERT mRNA的表达下降和端粒酶活性的抑制，其凋亡率明显增加。结论：HHT能抑制HL-60细胞hTERT mRNA的转录，其与细胞凋亡的关系值得进一步研究。     

急性白血病端粒酶亚单位的表达与端粒酶活性的相关性研究

人端粒酶由人端粒酶RNA(hTR)、端粒酶相关蛋白质(TP1／TLP1)和人端粒酶催化亚单位(hTERT／hEST2)三部分组成，研究表明，TP1mRNA在不同组织的表达无显差异，HrR的转录水平对端粒酶活性的影响尚存争议，而hTERT转录水平的表达在端粒酶活性高的癌组织中明显升高。我们通过检测成人急性白血病患和正常人的端粒酶亚单位在转录水平和蛋白水平的表达及端粒酶的活性，探讨急性白血病的端粒酶活性的调节因子，为进一步寻找急性白血病的治疗靶点提供理论依据     

hTERT反义寡核苷酸对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖及端粒酶活性的影响

目的研究hTERT基因反义寡核苷酸(ASODN)对瘢痕疙瘩成纤维细胞生长增殖及端粒酶活性的抑制作用,探讨其在瘢痕疙瘩治疗中的作用。方法应用ASODN封闭瘢痕疙瘩成纤维细胞hTERT基因的表达,不同浓度不同时间以ASODN作用于体外培养的瘢痕疙瘩成纤维细胞,细胞计数和MTT法检测成纤维细胞生长增殖情况,端粒酶PCR-ELISA法检测不同处理浓度和时间成纤维细胞端粒酶活性。结果 ASODN作用于瘢痕疙瘩成纤维细胞72h后,成纤维细胞生长受抑,增殖能力减弱,并具有浓度、时间依赖性。端粒酶活性检测显示:ASODN0.5、1.0和1.5μmol/L作用组OD450-690值分别为0.612±0.038、0.535±0.027、0.423±0.023,与空白对照组(0.898±0.058)比较,差异有统计学意义(P<0.05);正义寡核苷酸1.0μmol/L作用组(OD450-690值为0.893±0.042)与空白对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论 hTERT基因ASODN能抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞的生长增殖,降低成纤维细胞端粒酶活性是其重要作用机制之一。通过抑制端粒酶活性进行抗瘢痕疙瘩治疗可能是一个新途径。     

抗端粒酶反义寡核苷酸对人胃癌细胞增殖的影响

目的：观察抗端粒酶反义寡脱氧核苷酸（ASODN）对人胃癌细胞系端粒酶活性的抑制作用及其对癌细胞增殖的影响。方法：合成与人类端粒酶RNA模板区碱基序列互补的ASODN，并用阳离子脂质体转染剂DOSPER介导，作用于人胃癌细胞系FGC85，空白组和正义寡脱氧核苷酸（SODN）作为对照，用以PCR为基础的端粒重复序列扩增法（TRAP）结合ELISA方法检测胃癌细胞的端粒酶活性，台盼蓝拒染法细胞计数，噻唑蓝（MTT）试验观察癌细胞增殖情况，免疫组化方法检测细胞增生抗原Ki-67。结果：脂质体介导的抗端粒酶ASODN对胃癌细胞的端粒酶活性具有抑制作用；细胞坟数和MTT试验显示胃癌细胞增殖速度明显减慢；细胞Ki-67染色阳性率显著降低。结论：特异性抗端粒酶ASODN可运用于抗肿瘤实验性治疗和相关研究。     

hTERT反义寡核苷酸对HL-60细胞增殖及端粒酶活性的抑制作用

为了研究hTERT基因反义寡核苷酸(ASODN)对HL-60细胞增殖及端粒酶活性的抑制作用,并探讨HL-60细胞端粒酶活性与hTERT基因表达的关系,应用反义寡核苷酸封闭HL-60细胞hTERT基因的表达,RT-PCR方法检测该基因表达抑制情况,倒置显微镜观察细胞形态变化,MTT法检测细胞增殖状态,应用TRAP-ELISA、TRAP-PAGE方法检测HL-60细胞端粒酶活性。结果发现反义硫代寡核苷酸作用于HL-60细胞72小时后,hTERT基因表达明显受抑,细胞生长受抑,增殖能力减弱,其抑制作用具有序列特异性及浓度、时间依赖性。端粒酶活性检测显示反义寡核苷酸10、20和30μmol/L作用组OD450-690值分别为1.504±0.47、1.223±0.39,0.944±0.16,与未作用组(2.648±0.42)比较,差异有显著性(P<0.05);正义寡核苷酸20μmol/L作用组(OD450-690值为2.376±0·65)与未作用组比较,差异无显著性(P>0.05)。TRAP-PAGE检测表明hTERTASODN作用组较SODN作用组端粒酶条带明显减少,以30μmol/L作用组条带最少。结论hTERT基因反义寡核苷酸能够通过封闭hTERT基因的表达而抑制HL-60细胞增殖,下调端粒酶活性。     

c-myc反义寡核苷酸对HL-60细胞端粒酶活性影响及诱导凋亡作用

为了研究c-myc基因反义寡核苷酸(ASODN)对HL-60细胞端粒酶活性的影响及其诱导凋亡作用,探讨HL-60细胞端粒酶活性与c-myc基因表达的关系,应用反义寡核苷酸封闭HL-60细胞c-myc基因的表达,RT-PCR方法检测该基因表达抑制情况,采用流式细胞术进行细胞凋亡检测及细胞周期分析,琼脂糖凝胶电泳观察凋亡细胞的DNA断裂情况,应用TRAP-ELISA法测定HL-60细胞端粒酶的活性。结果表明:反义硫代寡核苷酸作用于HL-60细胞72小时后,c-myc基因表达明显受抑;S期细胞百分数由55.6%降至30%,并出现早期凋亡峰(凋亡细胞比例占25.2%);琼脂糖凝胶电泳显示DNA凋亡梯形带;端粒酶活性检测发现反义寡核苷酸3,4,5μmol/L作用组OD450-690分别为1.952±0.14,1.805±0.40,1.616±0.41,与未作用组(OD450-690为2.648±0.42)比较,差异有显著性(P<0.05);反义寡核苷酸1和2μmol/L作用组及正义寡核苷酸5μmol/L作用组OD450-690分别为2.324±0.36,2.162±0.38,2.466±0.29,与未作用组比较,差异无显著性(P>0.05)。结论:c-myc基因反义寡核苷酸能够通过封闭c-myc基因的表达而诱导HL-60细胞凋亡,阻止细胞由G1期进入S期,并具有下调端粒酶活性作用。     

端粒酶活性与膀胱癌T24细胞生长

目的 :研究端粒酶逆转录酶基因 (h TERT)反义寡核苷酸 (ASODN)对膀胱癌 T2 4细胞生长的影响。方法 :用脂质体介导技术 ,将 h TERT基因 ASODN转染入膀胱癌 T2 4细胞中应用端粒酶 PCR- EL ISA法检测端粒酶活性变化 ,MTT法测定细胞生长变化 ,并用流式细胞术观察其对 T2 4细胞周期的影响。结果 :h TERT基因 ASODN能显著地抑膀胱癌 T2 4细胞端粒酶活性 ,癌细胞生长增殖受限 ,同时抑制具有序列特异性和剂量依赖性 ,并出现细胞凋亡现象 ,其凋亡率 (15 .8% )明显高于 SODN转染组 (0 )和空白对照组 (1.9% ,P<0 .0 5 )。结论 :h TERT基因 ASODN能特异性抑制膀胱癌 T2 4细胞端粒酶活性和生长 ,促进其细胞凋亡。     

急性白血病细胞端粒酶逆转录酶(hTERT) mRNA的表达及意义

为研究原代急性白血病 (AL)骨髓单个核细胞 (MNCs)端粒酶逆转录酶 (hTERT)mRNA表达及其意义 ,采用半定量RT PCR方法检测骨髓MNCshTERTmRNA表达 ,用TRAP PCR ELISA法检测骨髓MNCs端粒酶活性。结果发现 :30例初发AL患者骨髓MNCshTERTmRNA表达量 (0 .71± 0 .34)明显高于 12例AL获CR的患者 (0 .4 3± 0 .2 5 )及 6例正常志愿者 (0 .2 2± 0 .2 1)。 30例初发AL患者骨髓MNCs端粒酶活性 (0 .2 35± 0 .395 )明显高于 12例AL获CR的患者 (0 .0 12± 0 .0 15 )。初发AL患者骨髓MNCshTERTmRNA表达量与端粒酶活性呈正相关 (r=0 .4 2 1,P <0 .0 1)。初发AL患者骨髓液常规涂片中原始细胞百分率与骨髓MNCs的hTERTmRNA表达量和端粒酶活性均呈正相关 (r =0 .4 5 7,P<0 .0 5和r =0 .4 11,P <0 .0 5 )。结论 :初发AL患者骨髓MNCs的hTERTmRNA表达与端粒酶活性相关。推测hTERTmRNA表达可能代表白血病细胞的一种高增殖状态。     

p53基因对HL-60细胞端粒酶活性和人端粒酶逆转录酶基因表达的影响

为了研究野生型p53基因转染的HL-60细胞端粒酶活性和人端粒酶逆转录酶（hTERT)基因表达的变化，采用脂质体法将野生型p53基因转染HL-60细胞，用TUNEL检测细胞凋亡。用端粒重复扩增法（TRAP）-酶联免疫吸附试验（ELISA）检测端粒酶活性变化，以及用RT-PCR方法检测hTERTmRNA表达的变化。结果显示：转染野生型p53基因的HL-60细胞在32.5℃培养24小时和72小时后，凋亡率分别为8.3%和21.0%,hTERTmRNA和端粒酶活性分别下降至对照组的68.4%和55.8%及27.3%和8.9%。结论：p53基因能下调HL-60细胞hTERTmRNA和端粒酶活性。这可能是野生型p53基因诱导细胞凋亡机制之一。     

AZT对白血病细胞株KG-1a细胞增殖和端粒酶活性的影响

本研究探索端粒酶抑制剂3’-叠氮-2’,3’-脱氧胸腺核苷(AZT)对人急性髓系白血病细胞株KG-1a细胞增殖和端粒酶活性的影响。用MTT法检测不同浓度AZT分别作用24、48、72 h时KG-1a细胞增殖水平;流式细胞术检测AZT对KG-1a细胞周期及细胞凋亡的影响;TRAP-PCR-ELISA法检测细胞端粒酶活性;RT-PCR法检测细胞端粒逆转录酶(hTERT)mRNA的表达。结果表明,AZT能抑制KG-1a细胞增殖,抑制作用具有时间和浓度依赖性;随AZT浓度的增加,处于S期的细胞数目减少,G2/M期细胞数目增加,且出现凋亡峰;AZT作用后实验组细胞的端粒酶活性降低,hTERT-mRNA表达下降,下调程度与AZT浓度呈正相关。结论:AZT在体外能明显抑制KG-1a细胞增殖,并诱导其凋亡,其机制与降低端粒酶活性、下调hTERT mRNA表达有关。