骨髓中一类新细胞群--神经组织定向干细胞的确立

背景：骨髓间充质干细胞和造血干细胞具有分化为神经类细胞的潜能己得到共识。另有研究者认为骨髓中除骨髓间充质干细胞和造血干细胞以外，还寄居着CXCR4阳性的组织定向干细胞，包括骨骼肌、心、肝及神经组织定向干细胞。 目的：实验拟进一步证实神经组织定向干细胞寄居于骨髓，并寻求确立神经组织定向干细胞分离、培养的新方法。 设计：开放性实验。 单位：解放军第二军医大学解剖学教研室。 材料：所用成年清洁级SD大鼠由解放军第二军医大学动物中心提供。DMEM/F12,B27，N2均购自Invitrogen公司；bFGF源于CytoLab Ltd;EGF源于Invitrogen公司；Nestin、CXCR4,β-Tublin Ⅲ，神经胶质纤维酸性蛋白等一抗为Santa Cruz公司兔抗鼠多克隆抗体；MAP2ab（Clonell—5B），CNPase（Clone AP20）为NeoMarkers公司小鼠抗大鼠单克隆抗体；荧光（FITC，Cy3）标记试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司；免疫组化试剂盒购自Vector Laboratories公司。NycoPrep^TM分离液（1．077A）购自Axis-Shield公司。 方法：实验于2004-01／2006-12在解放军第二军医大学组织工程研究所完成。取SD大鼠双侧股骨及胫骨，冲洗骨髓腔，经NycoPrep^TM分离液分离单核细胞层，DMEM／F12（1：1）无血清神经干细胞培养液（内含2％B27，1％N2，20μg/L碱性成纤维细胞生长因子，20μg／L表皮生长因子，1×10^5U/L青霉素，100mg／L链霉素），通过先贴壁、后悬浮的方法从骨髓中分离、培养单克隆生长的神经组织定向干细胞。 主要观察指标：通过免疫细胞化学法检测神经组织定向干细胞细胞球CXCR4和nesfin蛋白，以及细胞球自然分化后神经元以及神经胶质细胞的标志蛋白。 结果：①神经组织定向干细胞细胞球表达神经干细胞标志蛋白nesfin和组织定向干细胞标志蛋白CXCR4。②神经组织定向干细胞细胞球在含15％胎牛血清的     

大鼠骨髓基质细胞体外培养向神经干细胞的诱导分化

目的:已证实骨髓基质细胞可分化为中胚层组织细胞,实验予进一步探讨体外分离培养的骨髓基质细胞向神经干细胞分化的可能性,以及是否能继续定向分化为神经细胞及神经胶质细胞,为神经系统疾病细胞移植治疗提供种子细胞.方法:实验于2007-02/09在泸州医学院神经生物学研究室进行.①动物:选择5只普通级SD大鼠,由泸州医学院实验动物中心提供,实验过程中对动物的处胃符合动物伦理学标准.②实验方法:大鼠戊巴比妥钠腹腔麻醉,取双侧胫骨和股骨,磷酸盐缓冲液冲洗骨髓腔.采用密度梯度离心法从大鼠骨髓中分离培养骨髓基质细胞,胰蛋白酶与EDTA联合消化,传至第4代,用含20 μg/L碱性成纤维细胞生长因子、20 μ g/L表皮生长因子、N2辅助因子的DMEM/F12培养液向神经干细胞诱导分化.③实验评估:观察原代、传代培养及诱导分化后的骨髓基质细胞生长情况和形态变化,采用SABC法进行免疫细胞化学榆测神经细胞特异性标志的表达.结果:①骨髓基质细胞形态观察:原代细胞接种l d后开始贴壁增殖,3 d后多数贴壁,贴壁细胞呈梭形或扁平形;10 d后90%细胞融合,以长梭形为主,突起粗大,形成网状、片状;传代后细胞贴壁速度加快,增殖能力更强,7 d左右达到融合.②诱导分化后细胞生长情况和形态变化:第4代骨髓基质细胞向神经干细胞诱导分化7 d,成球的细胞脱离瓶底,悬浮在细胞液中.将细胞离心弃上清,换成血清分化液后,细胞球逐渐贴壁,球周围很快发出突起,分化为星形胶质细胞样细胞、神经元样细胞及少突胶质细胞样细胞.③神经细胞特异性标志的表达:骨髓源性细胞球表达巢蛋白,呈棕黄色,为神经干细胞:从细胞球分化的细胞抗胶质纤维酸性蛋白、微管相关蛋白2及半乳糖脑苷脂均呈阳性.结论:骨髓基质细胞能在体外诱导分化出神经干细胞,且骨髓源性神经干细胞可进一步定向分化为神经细胞及神经胶质细胞.     

甲状腺激素对大鼠骨髓间充质干细胞分化为少突胶质细胞的影响

背景:如何为脱髓鞘疾病的细胞替代治疗提供丰富的少突胶质细胞来源是急需解决的问题.目的:实验拟采用表皮生长因子及碱性成纤维细胞因子诱导骨髓间充质干细胞向神经干细胞方向分化,撤退细胞因子后,用甲状腺激素诱导神经干细胞向少突胶质细胞分化.设计、时间及地点:细胞观察实验,于2007-08/12在泸州医学院神经生物学研究室完成.材料:普通级SD大鼠5只用于骨髓间充质干细胞的培养.方法:采用密度梯度离心法从大鼠骨髓中分离培养骨髓间充质干细胞,传至第4代,用含碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、N2辅助因子、甲状腺激素T3的DMEM/F12诱导液诱导向神经干细胞分化.诱导后4 d,更换成含胎牛血清、甲状腺激素T3的DMEM/F12分化液,诱导向少突胶质细胞分化.主要观察指标:骨髓间充质干细胞生长情况和形态变化,采用SABC法进行免疫细胞化学检测神经细胞特异性标志的表达.结果:原代细胞接种3 d后多数贴壁,传代后细胞贴壁速度加快,增殖能力更强.诱导液处理第4天,圆形细胞聚集成簇.换成分化液后,细胞伸出树枝状细长突起,交织成网,形成少突胶质细胞样细胞.骨髓源性细胞簇表达巢蛋白阳性,示神经干细胞;从细胞簇分化的细胞,多数细胞表达半乳糖脑苷脂,部分细胞表达髓鞘碱性蛋白,示少突胶质细胞,少数细胞表达微管相关蛋白2阳性,示神经元.结论:甲状腺激素在体外可诱导骨髓间充质干细胞向少突胶质细胞分化.     

星形胶质细胞促进共培养骨髓间充质干细胞的生长和分化

目的:探讨星形胶质细胞对共培养的骨髓间充质干细胞生长和分化的影响。方法:分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,经Hoechst33342标记后与纯化的星形胶质细胞在DMEM/F12/10%FBS中一起培养,观察骨髓间充质干细胞的生长状况、形态变化和特异性标志蛋白NeuN、GFAP和CNP的表达。结果:倒置显微镜下2种细胞生长状态良好,少数Hoechst33342标记细胞伸出细长突起,呈锥形、多角形或星形,有NeuN、GFAP和CNP的表达。结论:星形胶质细胞与骨髓间充质干细胞共培养可以维持骨髓间充质干细胞的生长,并可在一定程度上诱导其向神经样细胞分化。     

多种神经营养因子联合诱导培养骨髓间充质干细胞向少突胶质样细胞的定向分化

背景:轴突再牛后髓鞘化是影响脊髓损伤后恢复的一个关键性因素,而少突胶质细胞存活的多少直接影响轴突再生后髓鞘化.目的:探讨骨髓间充质干细胞经神经营养因子诱导培养后,向少突胶质样细胞定向分化的可行性.设计、时间及地点:细胞分子生物学的体外实验,于2006-09/2007-06在同济医院骨科实验室完成.材料:选用2～4周龄SD大鼠5只,雌雄不拘,取其舣侧股骨、胫骨骨髓,分离培养骨髓间充质干细胞.培养用诱导因子表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子为美国Invitrogen公司产品.方法:取培养至第4代的骨髓间充质干细胞,加入含有20 ng/mL碱性成纤维细胞生长因子、20 ng/mL表皮生长因子、N2添加剂的无血清培养基的诱导液诱导48 h后,加含500 ng/mL胰岛素样生长因子1、N2添加剂的分化培养液培养3 d.主要观察指标:相差显微镜观察诱导过程中骨髓间充质干细胞的形态学变化.半定量RT-PCR检测少突胶质细胞特异性标志物mRNA的表达.应用神经元细胞标志物抗微管相关蛋白,星形胶质细胞标志物抗神经纤维酸性蛋白,少突胶质细胞标志物抗半乳糖脑苷脂、抗磷脂碱性蛋白抗体进行免疫细胞化学染色,检测骨髓间充质干细胞定向分化为少突胶质样细胞的阳性率.结果:①骨髓间充质干细胞向少突胶质样细胞诱导分化过稃中的形态学变化:经诱导分化后,大部分骨髓间充质干细胞表现出少突胶质细胞的形态学特征,胞质向细胞核回缩,细胞突起向外延伸,折光性增强,随时间延长多个细胞突起相互连接形成典犁的网状结构.②少突胶质细胞特异性标志物mRNA的表达:细胞诱导分化后可检测到磷脂碱性蛋白mRNA、半乳糖脑苷脂mRNA的特异性条带.③少突胶质细胞阳性率:在诱导分化条件下,半乳糖脑苷脂阳性率为65%.磷脂碱性蛋白阳性率为45%,微管相关蛋白2阳性率为10%.结论:碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子与胰岛素样生长因子联合应用能够有效促进骨髓间充质干细胞向少突胶质样细胞定向分化.     

新生大鼠海马区及室管膜下区神经干细胞的诱导分化：无血清培养条件下观察

背景:神经干细胞作为修复损伤神经组织的细胞源已引起学者的关注,如何有效的获取更多的神经干细胞逐渐成为重点解决的课题之一。目的:观察大鼠室管膜下区和海马回神经干细胞体外培养、传代和分化情况。设计:单一样本实验。单位:中山大学附属第三医院神经外科。材料:取出生后3dSD大鼠10只,雌雄不拘,由中山大学实验动物中心提供。巢蛋白抗体(兔抗大鼠)、神经微丝蛋白(NF-200)抗体(兔抗大鼠)、胶质纤维酸性蛋白抗体(小鼠抗大鼠)均购自Sigma公司。方法:实验于2006-09/12在中山大学基础医学院组织胚胎学实验室完成。实验过程中对动物的处置符合动物伦理学要求。从新生大鼠海马、室管膜下区分离神经干细胞,采用DMEM/F12无血清悬浮的条件培养,同时在培养基中加入碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子代替血清中含有的分裂原,进行体外扩增培养、传代观察。主要观察指标:采用免疫荧光检测技术,通过检测神经干细胞表达的nestin、神经元细胞表达的神经微丝蛋白和星形胶质细胞表达的胶质纤维酸性蛋白,鉴定神经干细胞及其分化结果。结果:分离获取的细胞具有自我更新和增殖能力,原代及传代培养20代后,在倒置显微镜下仍保留典型的"细胞克隆球"特征,神经克隆球通过nestin免疫荧光染色,呈阳性反应。经诱导后,细胞克隆球细胞外迁贴壁生长,可分化为神经微丝蛋白阳性的神经元细胞和胶质纤维酸性蛋白阳性的星形胶质细胞。结论:实验分离培养出具有自我更新和增殖能力的神经干细胞,其可诱导分化为神经元样细胞和星形胶质细胞。     

骨髓间充质干细胞向多巴胺能神经元的诱导分化

背景:近年来研究发现,神经营养因子在骨髓间充质干细胞的分化中发挥重要作用.目前脑组织中具有再生能力的神经干细胞在体外是否具有直接诱导骨髓间充质干细胞分化为多巴胺能神经元的作用还未见报道.目的:观察大鼠间充质干细胞在胶质细胞源性神经营养因子与神经干细胞共培养两种诱导条件下体外分化成多巴胺能神经元的能力.方法:分离培养SD大鼠骨髓间充质干细胞,取第3代细胞分2组培养,一组细胞应用胶质细胞源性神经营养因子单独诱导,另一组细胞与已培养成球的神经干细胞共培养进行诱导,共培养之前行Brdu标记.诱导3 d后以免疫组织化学法检测各组贴壁细胞神经元特异性标志物神经原纤维和多巴胺能神经元特异性标志物酪氨酸羟化酶的表达,观察间充质干细胞的分化情况.结果与结论:胶质细胞源性神经营养因子单独诱导组间充质干细胞在诱导24 h后胞体回缩呈锥形,突起延长且数量增多,有神经元样形态,且细胞间相互连接成网络状,3 d后部分细胞表达神经原纤维,其中少部分同时表达酪氨酸羟化酶.与神经干细胞共培养组神经干细胞球很快解离,迅速贴壁,共培养的贴壁细胞大量增殖且多呈神经元样,胞体细长多突起,相互间连接成网,多数贴壁细胞分别单独表达神经原纤维和酪氨酸羟化酶,少数细胞可见Brdu/神经原纤维,Brdu/胶质纤维酸性蛋白,Brdu/酪氨酸羟化酶双标阳性.提示间充质干细胞在胶质细胞源性神经营养因子、神经干细胞存在的情况下可定向转化为神经元,并有向多巴胺能神经元分化的可能.在该实验条件下胶质细胞源性神经营养因子效果好于神经干细胞.     

黄芪诱导大鼠骨髓间充质干细胞的分化特点

背景:黄芪提取物有较好的抗氧化、清除氧自由基的作用,加之骨髓间充质干细胞的多向分化潜能及其自体移植的优越性,可能为神经退行性疾病的治疗提供新的方式.目的:探讨黄芪诱导后大鼠骨髓间充质干细胞的分化特点.设计:细胞学体外观察.材料:清洁级6周龄雄性大鼠1只,购自中国医科院实验动物中心.黄芪注射液批号060105,为大理药业有限公司产品.方法:全骨髓法体外分离培养、纯化大鼠骨髓间充质干细胞,传至第4代时,按4×108L-1密度接种于置有盖玻片的12孔板内,制备细胞爬片.盖玻片上细胞达80%～90%融合后全量换液,加入含200 g/L黄芪注射液、体积分数为15%胎牛血清的DMEM培养基连续诱导6 d;对照组DMEM培养基中不加入黄芪注射液.主要观察指标:倒置显微镜观察诱导前后骨髓间充质干细胞的形态变化,诱导后免疫细胞化学染色鉴定特异性标志物的表达.结果:原代培养的骨髓间充质干细胞多呈圆形,扩增至第4代后细胞形态多呈梭形或成纤维细胞状,诱导后细胞形态发生改变,自胞体长出突起,随诱导时间延长,长出突起的细胞数量逐渐增多,部分突起末端呈分叉状,可见网络状连接.免疫细胞化学染色结果显示,诱导第3天巢蛋白阳性细胞、神经元特异性烯醇化酶阳性细胞和神经胶质纤维酸性蛋白阳性细胞较多,诱导第6天微管相关蛋白2阳性细胞较多.结论:黄芪首先诱导骨髓间充质干细胞向神经干细胞分化,然后促进其向神经元或神经胶质细胞的非特异性分化,并能够使已分化细胞的进一步成熟、老化.     

骨髓间充质干细胞向少突胶质细胞的定向分化

目的:神经反射通路的重建和再髓鞘化是影响脊髓损伤后恢复的一个关键性因素,而少突胶质细胞存活的多少直接影响轴突再生后髓鞘化.探讨骨髓间充质干细胞向少突胶质细胞定向分化的可行性.方法:实验于2006-09/2007-06在同济医院骨科实验室完成.①动物:2~4周龄清洁级SD大鼠5只,实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准.②实验方法:大鼠颈脱臼法处死,无菌条件下取双侧股骨、胫骨,去除两端骨骺,暴露骨髓腔,用DMEM培养液反复冲洗,收集冲洗液,重悬细胞种植于25 cm2培养瓶中,培养体系中含DMEM、体积分数为0.1的胎牛血清、终浓度为2 mmol/L谷氨酰胺及100 U/mL青霉素和100 mg/L链霉素,采用贴壁法 胰蛋白酶消化法进行纯化.取培养至第4代的骨髓间充质干细胞,加入含有碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、胰岛素样生长因子、N2添加剂的无血清培养基进行诱导分化.③实验评估:观察诱导过程中骨髓间充质干细胞的形态学变化.半定量RT-PCR检测少突胶质细胞特异性标志物mRNA的表达.应用抗微管相关蛋白、抗神经纤维酸性蛋白、抗半乳糖脑苷脂、抗磷脂碱性蛋白抗体进行免疫细胞化学染色,检测骨髓间充质干细胞定向分化为少突胶质细胞的阳性率.结果:①骨髓间充质干细胞向少突胶质细胞诱导分化过程中的形态学变化:经诱导分化后,大部分骨髓间充质干细胞表现出少突胶质细胞的形态学特征,胞质向细胞核回缩,细胞突起向外延伸,折光性增强,随时间延长多个细胞突起相互连接形成典型的网状结构.②少突胶质细胞特异性标志物mRNA的表达:细胞诱导分化后可检测到磷脂碱性蛋白mRNA、半乳糖脑苷脂mRNA的特异性条带.③少突胶质细胞阳性率:在诱导分化条件下,半乳糖脑苷脂阳性率为65%,磷脂碱性蛋白阳性率为45%,微管相关蛋白2阳性率为10%.结论:碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子与胰岛素样生长因子联合应用,能够有效促进骨髓间充质干细胞向少突胶质细胞分化.     

人骨髓间充质干细胞的免疫调节作用及向神经元样细胞诱导分化

背景:骨髓间充质干细胞作为具有多向分化潜能的干细胞,属于未分化的前体干细胞,其表型分化尚不成熟,因此在同种异体移植后无排斥反应或反应较弱.但是在体外条件下通过化学和生物诱导物使骨髓间充质干细胞转化为神经元,影响骨髓间充质干细胞向神经细胞、胶质细胞系统定向分化的因素比较复杂.目的:观察人骨髓间充质干细胞的免疫调节作用,及向神经元样细胞诱导分化的能力.设计、时间及地点:对比观察,于2008-01/2009-03在无锡市第三人民医院细胞室完成.材料:骨髓来源于人髋关节手术时的松质骨碎片或髂骨游离移植.方法:首先分离和培养骨髓间充质干细胞,建立双向混合淋巴细胞反应体系,在双向混合淋巴细胞反应中,将来自2个志愿者的外周血单个核细胞(各1×10~5/孔)等比例加入96孔板中,根据不同效靶比E/T ratios(骨髓间充质干细胞/外周血单个核细胞)加入丝裂霉紊处理过的骨髓间充质干细胞.在骨髓间充质干细胞诱导分化为神经元样细胞实验中分别选择两种诱导培养基,方法1诱导:DMEM+体积分数为10%胎牛血清+1 μmol/L全反式维甲酸+20 μg/L 碱性成纤维细胞生长因子+20 μg/L表皮生长因子;方法2诱导:DMEM+2%二甲基亚砜+100 μmol/L 丁羟茴醚.主要观察指标:~3H掺入法测定淋巴细胞增殖率,观察骨髓间充质干细胞对淋巴细胞增殖的影响;通过条件培养基定向诱导,免疫荧光和免疫组织化学染色观察其分化为神经细胞的能力.结果:①骨髓间充质干细胞与混合淋巴细胞反应体系共同培养抑制了淋巴细胞增殖,其增殖抑制率与加入骨髓间充质干细胞的数量呈正比.②方法1诱导2 h后,光镜下可见骨髓间充质干细胞的细胞质向核收缩,呈典型核周体形态.3～5 h后多数细胞能形成神经元样细胞形态,但细胞数目无明显增加.3 d后大多数细胞转变为双极或多极神经元细胞样形态,部分细胞之间拉成网状.染色可见60%～70%神经元特异性烯醇化酶、45%～50%胶质纤维酸性蛋白阳性,巢蛋白阳性细胞下降为3.4%.方法2诱导2 h即可见细胞体积变小,形成双极或多极的细胞体,可持续诱导48 h,后大部分细胞浮起死亡.染色可见40%～50%神经元特异性烯醇化酶,35%～40%胶质纤维酸性蛋白阳性,巢蛋白阳性细胞在诱导2 h时一过性上升到63%,48 h时下降为1.6%.结论:骨髓间充质干细胞具有向神经细胞分化能力并且可以抑制混合淋巴细胞反应体系中淋巴细胞的增殖,对同种异体免疫反应具有负调节作用.     

小儿骨髓间充质干细胞生物学特性及多向分化潜能

背景:国内报道人骨髓间充质干细胞多取材于成人细胞,小儿骨髓间充质干细胞的研究较少.目的:拟分离培养小儿的骨髓间充质干细胞,观察其生物学特性以及向成骨、成脂肪、成神经分化的潜能.设计:观察对比实验.单位:华中科技大学同济医学院.材料:实验于2006-03109在武汉同济医院骨科实验室完成,小儿骨髓间充质干细胞取自5～8岁因髋关节发育不良行骨盆截骨术的患儿,男1例,女2例,实验经过医院伦理委员会批准许可,并征得所有患儿家属知情同意.地塞米松、维生素C、β-甘油磷酸钠、甲基异丁酸黄嘌呤、胰岛素、吲哚醚辛、羟基丁酸苯甲醚均为Sigma公司产品,二甲基亚砜为Amersco公司产品.方法:经Percoll梯度分离接种获得小儿骨髓间充质细胞,倒置相差显微镜下观察细胞形态、排列分布情况.分别采用成骨细胞诱导剂(β-甘油磷酸钠,地塞米松,维生素C)、成脂肪细胞诱导液(地塞米松,甲基异丁酸黄嘌呤,牛胰岛素,吲哚美辛)及二甲摹亚砜和羟基丁酸苯甲醚无血清培养摹诱导剂干预细胞向成骨、脂肪、神经细胞分化,经免疫组织化学染色、PCR、免疫细胞染色方法检测成骨标志物(碱性磷酸酶、骨钙素mRNA、钙结节)、脂肪标志物(脂滴、PPAR Y-2mRNA)、以及类神经标志物(尼克氏体、神经烯醇化酶、神经丝蛋白).主要观察指标:①d,JL骨髓间充质细胞形态以及增殖情况.②成骨、脂肪及类神经标志物检测结果.结果:①小儿骨髓间充质细胞贴壁容易,细胞细长梭形,增殖能力强,融合后呈旋涡状分布.②骨髓间充质细胞分别经各诱导剂诱导后,细胞形态均发生相应的变化,用化学染色、PCR、免疫细胞染色等方法检测成骨标志物、脂肪标志物及类神经标志物有明显阳性表达.结论:小儿骨髓间充质细胞生长具有稳定增殖、传代的能力,具有成骨、成脂肪、成神经等多方向的定向分化潜能.     

猫骨髓基质细胞诱导为神经干细胞的实验研究

背景骨髓基质细胞是贴壁黏附的非造血多潜能干细胞,其在一定条件体外培养、扩增可被诱导分化为神经元和胶质细胞.目的观察家猫骨髓基质细胞体外培养及诱导分化成神经干细胞的生长情况.设计随机取样.单位南方医科大学附属珠江医院神经外科.材料实验于2002-01/12在解放军第一军医大学珠江医院全军神经医学研究所中心实验室进行,实验动物是由第一军医大学动物中心提供健康家猫20只,年龄1.0～2.0岁,体质量2.5～4.0 kg,雌雄各半.干预随机抽取家猫左右下肢的骨髓,从中分离得到骨髓基质细胞,提取的骨髓基质细胞悬液在体外给予神经干细胞培养基培养,增殖后用维甲酸为分化诱导因子进行诱导骨髓基质细胞向神经干细胞转化.CK2型倒置相差光学显微镜(OLYMPAS,JAPAN)追踪观察活细胞培养生长情况,同时观察4,12,24,48 h去除非贴壁细胞及不去除贴壁细胞骨髓基质细胞生长情况.采用免疫组织化学染色改良法对干细胞阶段的骨髓基质细胞进行免疫细胞化学检测,OLYMPAS光学显微镜观察.主要观察指标对接受实验干预的骨髓基质细胞分别进行倒置相差显微镜下观察活细胞生长情况及光镜下观察免疫细胞化学染色情况.结果20只家猫全部进入结果分析.猫骨髓基质细胞在体外培养中胞体增大,倒置相差显微镜下可见丰富的胞浆颗粒,继之出芽,贴壁生长,可形成克隆团,同时可传代培养.免疫组化染色分析结果显示能表达神经干细胞特异性抗原Nestin,而且能分化出胶质细胞样细胞和神经元样细胞.结论家猫骨髓基质细胞具有干细胞特征,在合适条件下可扩增、形成克隆并诱导分化出神经胶质细胞和神经元特征细胞.     

Effect of chitosan conduit under a dynamic culture on the proliferation and neural differentiation of human exfoliated deciduous teeth stem cells

Ex vivo engineering of artificial nerve conduit is a suitable alternative clinical treatment for nerve injuries. Stem cells from human exfoliated deciduous teeth (SHEDs) have been considered as alternative sources of adult stem cells because of their potential to differentiate into multiple cell lineages. These cells, when cultured in six‐well plates, exhibited a spindle fibroblastic morphology, whereas those under a dynamic culture aggregated into neurosphere‐like clusters in the chitosan conduit. In this study, we confirmed that SHEDs efficiently express the neural stem cell marker nestin, the early neural cell marker β‐III‐tubulin, the late neural marker neuron‐specific enolase and the glial cell markers glial fibrillary acidic protein (GFAP) and 2',3'‐cyclic nucleotide‐3'‐phosphodiesterase (CNPase). The three‐dimensional chitosan conduit and dynamic culture system generated fluid shear stress and enhanced nutrient transfer, promoting the differentiation of SHEDs to neural cells. In particular, the gene expressions of GFAP and CNPase increased by 28‐ and 53‐fold, respectively. This study provides evidence for the dynamic culture of SHEDs during ex vivo neural differentiation and demonstrates its potential for cell therapy in neurological diseases. Copyright © 2013 John Wiley & Sons, Ltd.     

体外无血清培养基条件下诱导人骨髓基质细胞为神经干细胞的特征

背景:体外诱导骨髓基质细胞向神经元样细胞分化的方法主要是应用抗氧化剂如β-巯基乙醇、全反式维甲酸、丹参等,这些诱导方法分化的主要是神经元样细胞,这种细胞是否具有神经元的功能有待进一步观察。目的:观察体外无血清培养基条件下人骨髓基质细胞向神经细胞分化的特点。设计:观察实验。单位:潮州市中心医院。材料:实验于2004-04/2005-12在潮州市中心医院完成。成人骨髓来源于3例骨折患者的股骨和胫骨骨髓,获得患者及其家属的同意及潮州市中心医院伦理委员会批准。重组人碱性成纤维细胞生长因子和重组人表皮生长因子为Sigma公司产品;鼠抗波形蛋白单克隆抗体、鼠抗S100单克隆抗体、鼠抗TrkC单克隆抗体、鼠抗髓鞘基础蛋白单克隆抗体、SP-9000试剂盒和即用型AEC为北京中山公司产品;鼠抗GFAP单克隆抗体、兔抗巢蛋白多克隆抗体、鼠抗神经元特异性烯醇化酶单克隆抗体和鼠抗神经微丝200单克隆抗体在武汉博士德公司购买;鼠抗βⅢ管蛋白单克隆抗体为Sigma公司产品。方法:在手术骨折内固定过程中获得成人骨髓,缓冲液冲洗后分离细胞,原代培养的细胞融合时传代培养,细胞种植在神经干细胞的N2培养基或B27培养基,同时加入20μg/L的碱性成纤维细胞生长因子及表皮生长因子,放入含体积分数0.05CO2的培养箱中37℃常规培养,相差显微镜下观察骨髓基质细胞在无血清培养基中的形态变化,培养2d后采用免疫细胞化学方法检测骨髓基质细胞的神经细胞相关标志物的表达。主要观察指标:骨髓基质细胞的形态变化及神经细胞相关标志物的表达。结果:①从成年人的骨髓中分离出骨髓基质细胞,在体外生长形态类似成纤维细胞,可以维持在未分化状态稳定增殖,体外扩增可超过10代。骨髓基质细胞在无血清神经干细胞的培养基中生长状态类似神经干细胞,可以形成典型的球状结构。②细胞球可表达神经干细胞的标志物波形蛋白和巢蛋白;细胞分化可以表达神经元的标志物神经微丝200、神经元特异性烯醇化酶、TrkC和βⅢ管蛋白;部分分化的细胞表达胶质纤维酸性蛋白和S100,说明细胞分化为星形胶质细胞。结论:骨髓基质细胞在神经干细胞的无血清的培养基中细胞的生长状态、表达的标志物和分化的细胞类型与神经干细胞类似。     

持续性压力培养环境对兔骨髓基质干细胞增殖的影响

背景:骨髓基质干细胞来源的成骨细胞是骨髓腔内主要的受力细胞,在人工关节置换病例中,其生命活动状况与假体传导压力有密切关系.目的:观察持续性压力培养环境对兔骨髓基质干细胞增殖的影响.揭示持续压力致假体松动下沉进展及其置换后活动影响的生物学机制.设计、时间及地点:随机分组设计,细胞学体外观察,于2004-02/2007-10在解放军第四军医大学骨科研究所完成.材料:出生1个月的新西兰幼兔1只,体质量0.5 kg,取其骨髓基质干细胞用于实验.方法:传代培养兔骨髓基质干细胞,将生长良好的第3代骨髓基质干细胞按1×104个/孔随机接种于7块24孔培养板,14 h后细胞完全贴壁,换新鲜含体积分数为10%胎生血清的DMEM.实验随机将4块培养板分为4组:对照组不予加压,20 kPa持续压力组,60 kPa持续压力组,100 kPa持续压力组分别在规定的时间内每天施以20,60,100 kPa的持续3 h压力.主要观察指标:四甲基偶氮唑盐法检测培养1,3,5,7 d各组骨髓基质干细胞的吸光度值变化.结果:除培养第1天外,第3,5,7天各压力组骨髓基质干细胞的吸光度值均低于对照组(P<0.01).其中第3天20 kPa持续压力组与60 kPa持续压力组吸光度值差异无显著性意义(P>0.05),但均高于100 kPa持续压力组(P<0.05).第5天不同持续压力组吸光度值两两比较差异具有显著性意义(P<0.05),压力越高,吸光度值越低.第7天100 kPa持续压力组吸光度值低于压力20 kPa持续压力组(P<0.05).结论:关节置换后早期患者不宜过早下地,否则将产生持续性应力,可以引起骨髓腔内骨髓基质干细胞的抑止,从而不利于骨质愈合,容易产生假体下沉和松动.     

以海藻酸盐及异种骨复合技术制备组织工程化骨及体内成骨(英文)

背景:海藻酸有相对温和的凝胶条件与良好的生物相容性,已广泛应用于生物组织工程.目的:采用海藻酸钠凝胶复合异种骨的方法,构建骨组织工程载体,观察载体中细胞的生物性能及体内成骨能力.方法:取2只2周龄新西兰兔的骨髓,以1 ×10~(-8)mol/L重组人骨形态发生蛋白2诱导骨髓间充质干细胞.取诱导后第2代骨髓间充质干细胞接种于1%海藻酸钠凝胶中,培养4 d苏木精-伊红染色观察凝胶中细胞形态.将第2代骨髓间充质干细胞分为单纯DMEM凝胶组和含1%海藻酸钠的DMEM凝胶组,分别培养7 d后行骨形态发生蛋白2免疫组织化学染色观察.取24只裸鼠,随机分为2组,于两侧股部肌袋中分别植入骨髓间充质干细胞,海藻酸钠凝胶/牛松质骨复合体作为实验组,骨髓间充质干细胞,牛松质骨复合体作为对照组.术后2,4周后组织学观察复合体成骨情况,图像分析系统分析各组成骨或软骨的面积百分比.结果与结论:海藻酸钠凝胶中骨髓间充质干细胞形态饱满,细胞悬浮于凝胶中,可见细胞分裂和核分裂相.单纯DMEM凝胶组和含1%海藻酸钠的DMEM凝胶组免疫组织化学观察,细胞分裂增殖正常,伸出多种形态的突起,胞核大,核仁清晰.单纯DMEM凝胶组和含1%海藻酸钠的DMEM凝胶组的骨形态发生蛋白2表达阳性率差异无显著性意义(P>0.05).扫描电镜观察海藻酸钠凝胶均匀地复合于牛松质骨微孔中,不同平面均有细胞生长.动物实验显示术后2,4周实验组和对照组的成骨或软骨的面积百分比差异有显著性意义(P<0.05).提示以海藻酸钠凝胶,牛松质骨构建骨组织工程载体,合乎组织工程载体的超结构原理,能最大限度地承载细胞,生物性能好,对骨髓间充质干细胞增殖和成骨表型及相关的生物性能无不良影响,在体内成骨效率较高.     

不同浓度尿酸对体外培养人脐静脉血管内皮细胞增殖过程的影响

背景:近年对尿酸特别是其与心血管疾病的研究较多,但多集中在流行病学领域,从细胞学角度探讨尿酸对内皮细胞影响的研究并不多见。目的:观察不同浓度的尿酸对体外培养的人脐静脉内皮细胞株(ECV304)丙二醛,一氧化氮及3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐的影响。设计:以人脐静脉内皮细胞为观察对象,随机对照实验。单位:解放军第四军医大学西京医院内分泌科。材料:脐静脉内皮细胞株ECV304由解放军第四军医大学免疫教研室提供;DMEM低糖培养基,美国Gibco公司生产;胎牛血清,北京元亨圣马生物技术研究所生产;胰蛋白酶,美国Gibco公司生产;3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐,华美公司生产;二甲基亚砜(DM-SO),分析纯,天津博迪化工有限公司生产;尿酸,Sigma公司生产。一氧化氮测试盒,丙二醛测试盒,南京建成公司生产。普通倒置显微镜、酶联免疫检测仪IX70型倒置显微镜,日本Olympus生产;酶联免疫检测仪,华东电子管厂生产。方法:实验于2003-12/2004-04在第四军医大学内分泌科和烧伤科进行。内皮细胞的复苏、培养、传代、接种均参考司徒镇强等主编的《细胞培养》中的方法进行。用无血清DMEM培养24h使细胞同步化于G0/G1期,分4组实验,分别为对照组,低浓度尿酸组,中浓度尿酸组和高浓度尿酸组,每组分为24h,48h和72h3个时间点,每个时间点8个样本。对照组,低浓度尿酸组,中浓度尿酸组和高浓度尿酸组分别加入含有0mmol/L,0.1mmol/L,0.2mmol/L,0.4mmol/L尿酸的5%的血清培养液,然后将培养板放入37℃,体积分数为0.05的CO2孵箱中孵育。在24h后检测丙二醛,一氧化氮及3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐,48h及72h分别再检测3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐。主要观察指标:各组人脐静脉内皮细胞增殖情况及一氧化氮和丙二醛的含量。结果:随尿酸浓度增高,ECV304产生丙二醛的含量逐渐下降,分别为(2.97±0.05),(2.89±0.09),(2.78±0.10),(2.44±0.03)μmol/L。ECV304产生一氧化氮的量分别为(6.86±1.41),(12.5±2.7),(18.9±1.8),(21.1±1.4)μmol/L,ECV304产生一氧化氮的量和3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐吸光度逐渐增加,细胞增殖以48h增加最为明显。结论:尿酸有抗氧化性,可促进血管内皮细胞的增殖及一氧化氮的释放。     

碱性成纤维生长因子和人重组骨形态发生蛋白2诱导分化兔骨髓间充质干细胞

背景:骨髓间充质干细胞依赖特定的生长和分化因子能分化为骨、软骨、脂肪等不同组织。人重组骨形态发生蛋白2有明显的骨诱导作用,能诱导未分化的骨髓间充质干细胞不可逆地形成骨与软骨,并最终导致新骨生成;碱性成纤维生长因子亦参与调控骨髓间充质干细胞的软骨与骨的分化。目的:观察碱性成纤维生长因子和人重组骨形态发生蛋白2对兔骨髓间充质干细胞增殖和分化的影响,以便寻求合适的骨形成诱导方法以代替常规的成骨培养体系。设计:随机对照实验。单位:解放军第四军医大学唐都医院骨肿瘤研究所。材料:培养的兔骨髓间充质干细胞。方法:实验于2004-06/12在第四军医大学唐都医院骨肿瘤研究所暨全军骨科中心完成。①体外培养的兔骨髓间充质干细胞分别经3种不同的生长因子(100μg/L人重组骨形态发生蛋白2,100μg/L碱性成纤维生长因子,100μg/L人重组骨形态发生蛋白2加100μg/L碱性成纤维生长因子)和成骨培养体系处理。②其增殖和分化通过四甲基偶氮唑盐比色法,碱性磷酸酶、骨钙素检测和钙结节VonKossa染色观察。主要观察指标:通过检测增殖率和碱性磷酸酶活性比较不同生长因子对兔骨髓间充质干细胞增殖和分化的影响。结果:①人重组骨形态发生蛋白2能促进兔骨髓间充质干细胞的增殖和分化,特别是其分化。②碱性成纤维生长因子能刺激兔骨髓间充质干细胞的增殖,与对照组相比,细胞增值率提高近100%;虽然对兔骨髓间充质干细胞分化无明显影响,但其能促进人重组骨形态发生蛋白2对兔骨髓间充质干细胞分化。结论:碱性成纤维生长因子和人重组骨形态发生蛋白2是兔骨髓间充质干细胞有效的分化因子,两者在体外都能促进兔骨髓间充质干细胞的增殖和分化。碱性成纤维生长因子和人重组骨形态发生蛋白2能协同作用加速骨诱导及骨形成,可以用作分化骨组织工程中的种子细胞。     

体外团状培养系统中Ad-hTGF-β1诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞的分化

背景:组织工程技术的发展给修复关节软骨缺损带来了希望,最近的比较研究证实骨髓间充质干细胞是修复全层软骨缺损的最佳细胞源.目的:在体外团状培养系统中,以Ad-hTGF-β1诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞定向分化,并对分化后的细胞进行鉴定.设计、时间及地点:以细胞为对象的重复观察测量实验,于2007-06/2008-01在解放军第三军医大学新桥医院中心实验室完成.材料:2月龄日本大耳白兔由解放军第三军医大学实验动物中心提供.方法:兔骨髓间充质干细胞体外分离培养扩增,Ad-hTGF-β1转染后,在团状培养系统中培养.通过组织学、免疫组化及反转录-聚合酶链反应方法检测其成软骨分化.主要观察指标:组织学染色观察细胞形态改变,免疫组化方法及反转录-聚合酶链反应检测蛋白多糖和Ⅱ型胶原的表达.结果:组织学染色显示,诱导后细胞呈软骨细胞样形态.免疫组化方法及反转录-聚合酶链反应结果显示,诱导后的细胞表达蛋白多糖和Ⅱ型胶原.结论:骨髓间充质干细胞经Ad-hTGF-β1诱导后在团状培养系统中可分化为软骨细胞.