人SNCA基因真核表达载体的构建及其在PC12细胞中的表达

目的:构建含人野生型及致病突变A30P、A53TSNCA基因的重组真核表达载体pEGFP-C3-SNCA,并通过稳定转染获得过表达人野生型及致病突变A30P、A53T α-synuclein(SNCA)的单克隆PC12细胞株.方法:通过RT-PCR方法扩增SNCA基因,T-A克隆后测序.在此基础上利用单核苷酸差异引物定点诱变法相继构建含SNCA基因编码区EcoR Ⅰ、BamH Ⅰ两酶切位点的同义突变及其致病突变G88C(Ala30Pro)、G209A(Ala53Thr)的重组真核表达载体pEGFP-C3-SNCA,并以PCR、双酶切、测序鉴定.以重组质粒pEGFP-C3-SNCA通过脂质体转染方法转染PC12细胞;以G418进行筛选;以有限稀释法进行亚克隆获得稳定过表达人野生型及致病突变A30P、A53T α-synuclein的单克隆PC12细胞株,并以稳定转染pEGFP-C3的PC12细胞作为对照组细胞,通过RT-PCR、Western blot及荧光显微镜鉴定各单克隆PC12细胞株.结果:PCR、酶切及测序证明重组真核表达载体pEGFP-C3-SNCA构建成功.RT-PCR、Western blot及荧光显微镜确认目的基因序列在PC12细胞稳定过表达.结论:成功地构建SNCA基因WT及A30P与A53T突变型的重组真核表达载体pEGFP-C3-SNCA;成功获得过表达人野生型及致病突变A30P、A53T α-synuclein的单克隆PC12细胞株.     

小泛素样修饰蛋白对α-突触核蛋白线粒体亚细胞定位及α-突触核蛋白经泛素系统降解的影响

目的 探讨α-突触核蛋白(α-synuclein)的小泛素样修饰蛋白1(small ubiquitin-like modifier1,SUMO-1)化修饰对α-synuclein蛋白亚细胞线粒体定位及α-synuelein蛋白经泛素系统降解的影响.方法 构建野生型、A53T突变型和缺失SUMO-1互作氨基酸的K96R突变型α-synuclein真核表达质粒.将野生型、A53T突变型和K96R突变型α-synuclein真核表达质粒分别转染HEK293细胞;在转染后48 h通过应用线粒体染色剂和激光共聚焦技术,观察野生型、A53T突变型及缺失SUMO-1修饰的α-synuclein蛋白的亚细胞线粒体定位和蛋白聚集情况.在转染后48 h应用anti-ubiquitin抗体进行Western印迹分析,明确野生型、A53T突变型及缺失SUMO-1修饰的α-synuclein蛋白泛素化程度有无差别.结果 将构建所得EGFP-α-synuclein-WT、EGFP-α-synuclein-A53T、EGFP-α-synuclein-K96R真核表达质粒经双酶切鉴定及DNA测序证实;激光共聚焦结果显示野生型、A53T突变型、K96R突变型α-synuclein蛋白均广泛分布于细胞质和细胞核中,以细胞质为主,野生型、A53T型细胞可见绿色荧光物质在胞质积聚,形成强荧光斑块,K96R型胞质内绿色荧光物质聚集少;野生型、A53T突变型、K96R突变型α-synuclein均与线粒体存在共定位,A53T突变型、K96R突变型α-synuclein在SUMO-1修饰或缺失的情况下对α-synuclein蛋白的线粒体亚细胞定位无明显影响.Western印迹结果显示转染缺失SUMO-1互作氨基酸的K96R突变型α-synuclein真核表达质粒组的细胞泛素蛋白的含量与转染空质粒组相比无明显变化,转染野生型、A53T突变型α-synuclein真核表达质粒组HEK293细胞中泛素蛋白的含量减少.结论 α-synuclein基因过度表达及致病突变A53T对α-synuclein蛋白的线粒体亚细胞定位无明显影响;SUMO-1修饰对α-synuclein蛋白的线粒体亚细胞定位也无明显影响;SUMO-1对a-αsynuclein基因过度表达及A53T突变型α-synuclein细胞内泛素化蛋白数量产生影响.     

小泛素样修饰蛋白-1对α-突触核蛋白基因突变或过表达诱导的细胞包涵体形成及细胞凋亡的影响

目的 探讨α-突触核蛋白(α-synuclein)的小泛素样修饰蛋白(small ubiquitin-like modifier,SUMO)-1对α-synuclein基因过表达或突变诱导的细胞包涵体形成及细胞凋亡的影响.方法 构建野生型(WT)、A53T突变型和缺失SUMO-1互作氨基酸的K96R突变型、K96R-A...     

慢病毒载体介导下DJ-1过表达细胞模型的建立

目的构建人野生型DJ-1及其L166P突变体的慢病毒载体并探讨慢病毒载体在构建基因过表达细胞模型中的作用。方法分别构建野生型DJ-1与L166P突变型DJ-1慢病毒载体质粒。进行测序确定比对正确后,进行质粒的大量扩增与制备并转染包装细胞系HEK293T细胞,荧光法和Western blot检测野生型DJ-1与L166P突变型DJ-1在细胞系中的表达。在确定目的蛋白正确表达之后,大量转染HEK293T细胞进行包装并生产携带目的基因的慢病毒颗粒。测定病毒上清滴度后感染PC12细胞,荧光显微镜和Western blot观察GFP荧光强度以及目的蛋白的表达,确定病毒的感染效率。结果成功构建携带DJ-1野生型及其突变体的慢病毒载体。该病毒载体可以转染进入HEK293T细胞内且目的蛋白能够正确表达。LV-DJ-1与LV-DJ-1/L166P的病毒滴度分别为2×10~9TU/m L与2×10~8TU/m L。病毒上清可以高效感染PC12细胞,绝大多数细胞可表达目的蛋白。外源野生型DJ-1和L166P突变体的蛋白表达量分别是内源性含量的315%和285%。结论慢病毒感染细胞效率很高,是很好的制备基因过表达细胞的方法。通过慢病毒载体介导,本研究获得了DJ-1及其突变体的过表达细胞模型。该模型可以用于后续DJ-1功能研究。     

小泛素样修饰蛋白-1对α-突触核蛋白基因突变或过表达诱导的细胞包涵体形成及细胞凋亡的影响

目的 探讨α-突触核蛋白(α-synuclein)的小泛素样修饰蛋白(small ubiquitin-like modifier,SUMO)-1对α-synuclein基因过表达或突变诱导的细胞包涵体形成及细胞凋亡的影响.方法 构建野生型(WT)、A53T突变型和缺失SUMO-1互作氨基酸的K96R突变型、K96R-A53T突变型α-synuclein真核表达质粒.应用脂质体介导转染方式将构建好的质粒转入HEK293细胞;48 h后Hoechst 33258染色,采用Axiovert200型倒置荧光显微镜观察对细胞的影响,应用四甲基偶氮唑盐检测细胞活力,Annexin V-PE流式细胞仪检测细胞凋亡.结果 将构建所得真核表达质粒经双酶切鉴定及DNA测序证实;将WT型、A53T型、K96R型、K96R-A53T型α-synuclein真核表达质粒转染HEK293细胞,48 h后伊红染色显示转染野生型α-synuclein- pEGFP组及A53T突变型组某些细胞胞浆内出现圆形的嗜酸性小体(类Lewy小体)形成,分别占细胞总数的9.4％和11.7％,转染K96R及K96R-A53T融合表达载体组细胞内嗜酸性小体形成比率为10.2％和9.8％,两两相比差异无统计学意义(P＞0.05).Hoechst染色结果显示,WT组、A53T组细胞核变大,出现着色不均,染色质聚集成斑点状,未见核浓缩或核碎裂.K96R组及K96R-A53T组胞核着色基本均匀.采用四甲基偶氮唑盐法结果显示转染空质粒组细胞活力为96.2％,转染WT组、A53T组细胞活力下降至53.4％及56.1％,转染K96R组及K96R-A53T组细胞活力为72.3％和69.8％;转染48 h后,WT组、A53T组细胞凋亡率分别为32.2％和34.1％,转染K96R组及K96R-A53T突变组细胞凋亡率下降为19.4％和20.3％,两两相比差异有统计学意义(P＜0.05).结论 SUMO-1对α-synuclein基因过度表达及α-synuclein基因致病突变A53T诱导的细胞包涵体的形成无明显影响;SUMO-1可加强α-synuclein基因过度表达及α-synuclein基因致病突变A53T诱导的细胞毒性及细胞凋亡,提示SUMO-1参与了细胞凋亡过程.     

构建携带重组人胰岛素基因慢病毒表达载体及其病毒包装

背景:腺病毒载体作为脂肪组织工程转基因载体,在应用中存在转导细胞免疫排斥及炎症反应等问题。应用慢病毒作为载体转染干细胞尤其是应用含胰岛素基因的慢病毒载体转染干细胞可避免腺病毒载体的诸多问题。目的:实验拟构建含有人重组胰岛素(insulin)与增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)基因慢病毒表达载体pLenti6.3-insulin-IRES-EGFP,并进行病毒颗粒包装。方法:应用聚合酶链反应方法获得目的基因,在目的基因上、下游分别加上BamHⅠ,AscⅠ两个酶切位点,进行T载体克隆,转化入感受态DH5α细胞中,通过筛选获得重组质粒。用限制性内切酶酶切,将目的基因片段和pLenti6.3-IRES-EGFP载体连接,转化入感受态DH5α细胞中,通过筛选获得慢病毒表达载体pLenti6.3-insulin-IRES-EGFP,并进行测序。抽提慢病毒载体,转染293T细胞,包装病毒,测定病毒滴度。结果与结论:通过聚合酶链反应获得长度为347bp带有BamHⅠ和AscⅠ序列的目的基因。pMD18-T载体和慢病毒表达载体pLenti6.3-IRES-EGFP连接,慢病毒表达载体pLenti6.3-insulin-IRES-EGFP构建与预期相匹配,成功包装慢病毒颗粒。     

大鼠ferroportin 1过表达慢病毒载体构建及其转染PC12细胞

目的:构建含大鼠ferroportin 1(FP1,膜铁转运蛋白1)基因和EGFP(绿色荧光蛋白)基因的过表达慢病毒载体并转染PC12细胞。方法:化学合成含有目的基因FP1的质粒,将酶切获得的目的基因连接入线性化慢病毒载体,构建重组质粒PGC-FU-FP1并进行测序鉴定;鉴定正确的阳性克隆采用Lipofectamine2000转染293T细胞,通过荧光显微镜和Western Blot检测FP1表达情况;在脂质体介导下将PGC-FU-FP1、pHelper1.0和pHelper2.0三质粒系统共转染入293T细胞,包装产生慢病毒,并通过实时荧光定量PCR法检测病毒滴度。以重组慢病毒载体质粒PGC-FU-FP1转染PC12细胞,荧光显微镜下观察EGFP的表达,实时荧光定量PCR和Western Blot法分别检测FP1mRNA和蛋白表达情况。结果:FP1基因序列经测序后与GeneBank报道的序列完全一致;重组质粒PGC-FU-FP1中携带有正确的FP1基因并能在293T细胞中表达;病毒滴度为2×108TU/ml。荧光显微镜、实时荧光定量PCR和Western Blot法证实目的基因FP1能被重组慢病毒高效导入PC12细胞并得到过表达。结论:成功构建携带FP1基因的慢病毒载体,并获得FP1基因修饰的PC12基因工程细胞。为进一步研究FP1在帕金森病中的作用及基因治疗奠定基础。     

α-突触核蛋白各结构域与MN9D细胞线粒体的关系

目的 探讨α-突触核蛋白(α-synuclein)各结构域与MN9D细胞线粒体的关系.方法 用PCR方法获得α-synuclein/1～65(N),α-synuclein/61～95(A)及α-synuclein/96～140(C)基因片段,克隆入真核表达质粒pLNCX2,经测序正确后以脂质体转染PT-67细胞,挑取单克隆并扩增,收集上清感染MN9D细胞,分别用Real Time PCR检测细胞基因表达水平,免疫组织化学染色检测蛋白表达,激光扫描共焦显微镜检测蛋白与线粒体共定位,流式细胞术检测细胞状态及线粒体膜电位状态.结果 成功构建了pLNCX2/N、pLNCX2/NAC及pLNCX2/C基因片段的重组真核表达质粒,获得了可稳定表达α-synuclein各基因片段的MN9D细胞株.通过激光扫描共焦显微镜观察,可见α-synuclein/N端与线粒体存在共定位关系;α-synuelein/NAC主要在核内聚集表达;α-synuclein/C端在胞质和胞核内均有表达.JC1染色流式细胞术检测显示,过表达α-synuclein/N实验组细胞线粒体膜电位降低.结论 α-synuclein的N端可能定位于线粒体,并参与调节线粒体功能;α-synuclein/NAC虽具有疏水性但却能穿过核膜,聚集在核仁周围;α-synuclein的C端定位于胞质和核内可能参与多种细胞功能.     

PDCD4重组慢病毒载体的构建、包装及其对前列腺癌细胞增殖的影响

目的构建表达程序性细胞死亡因子4(PDCD4)的慢病毒表达载体,建立能够稳定表达目的基因的前列腺癌PC3细胞亚株。研究PDCD4分子对前列腺癌细胞增殖的影响。方法利用PCR扩增PDCD4编码区片段,克隆入pENTRA-3C入门载体,利用LR clonaseⅡ重组酶将目的基因片段转接入pLenti-6.3慢病毒表达载体并包装相应的慢病毒,以表达红色荧光蛋白mCherry的pLenti-6.3-mCherry慢病毒载体包装的慢病毒为对照,感染人前列腺癌PC3细胞,通过杀稻瘟素(blasticidin)筛选出能够稳定过表达PDCD4蛋白的细胞亚株。利用Western blot法检测PDCD4蛋白的表达量,MTT法和平板克隆形成实验检测细胞增殖能力的变化。结果构建了重组慢病毒载体pLenti6.3-PDCD4。利用重组慢病毒表达系统筛选稳定过表达PDCD4蛋白的细胞亚株,并用Western blot法进行了验证。MTT法及平板克隆形成实验结果显示PDCD4高表达的PC3细胞亚株的增殖能力受到抑制。结论成功构建了表达PDCD4分子的慢病毒表达载体,筛选出稳定表达PDCD4的PC3细胞株。过表达的PD-CD4分子可以显著抑制PC3前列腺癌细胞的增殖。     

α-突触核蛋白在体外培养SH-SY5Y细胞内过表达可导致氧应激

目的：观察α-突触核蛋白基因在SH-SY5Y细胞内过表达对细胞的影响。 方法： LipofectAMINE法转染SH-SY5Y细胞，用G418对转基因细胞进行筛选，免疫荧光细胞化学检测α-突触核蛋白表达，氧化应激敏感的荧光素探针DCF-DA对活细胞进行染色后用荧光显微镜和流式细胞仪检测细胞内氧应激状况，还原型谷胱甘肽测定试剂盒通过分光光度计检测细胞内还原型谷胱甘肽水平。 结果： 转染细胞筛选后，细胞呈α-突触核蛋白免疫反应阳性；转α-突触核蛋白基因细胞内存在DCF信号增强和还原型谷胱甘肽水平下降。 结论： α-突触核蛋白过表达可引起细胞内氧应激，表明α-突触核蛋白在帕金森病发病机制中可能起重要作用。     

低氧诱导因子1α慢病毒载体转染骨髓间充质干细胞的成骨基因表达

背景:成骨作用和血管发生在骨的形成和修复过程中紧密结合,而低氧诱导因子1α被认为是促血管新生相关基因调控中最重要的核心转录因子,其可促进缺氧部位血管的形成,进而促进骨的形成。目的:构建野生型和点突变型两个低氧诱导因子1α慢病毒真核表达载体Lenti-HIF1α-IRES-EGFP,并比较其对兔骨髓间充质干细胞成骨基因表达的影响。方法:首先根据野生型人源低氧诱导因子1α基因序列信息和确定酶切位点的点突变型序列信息构建低氧诱导因子1α基因野生型和点突变型两个慢病毒真核表达载体;然后采用制备的病毒液转染兔骨髓间充质干细胞。结果与结论:免疫荧光显微镜观察显示,转染7 d后野生型组和点突变型组细胞均未见明显荧光,转染14 d后两组细胞均呈现明显的绿色荧光;qPCR定量分析结果表明,转染7 d后即有低氧诱导因子1α和骨形态发生蛋白2基因的显著表达,转染14 d后,两基因仍然显示较高的表达水平。说明实验成功构建野生型和点突变型低氧诱导因子1α基因慢病毒真核表达载体,转染后可以促进兔骨髓间充质干细胞成骨基因的表达。     

靶向ER-α36的vshRNA真核表达慢病毒载体的构建、鉴定及其对胃癌细胞增殖的影响

目的:针对雌激素受体(ER)-α36基因的特异性靶序列,构建并鉴定靶向ER-α36基因RNAi慢病毒载体,研究ER-α36沉默后对胃癌细胞增殖的影响。方法:筛选确定的ER-α36基因RNAi有效靶序列,合成靶序列的Oligo DNA,与慢病毒载体(GV307)连接,测序鉴定。转染293T细胞,包装产生慢病毒,感染胃癌SGC7901细胞株。荧光显微镜下观察SGC7901感染后荧光表达情况,real-time PCR和Western blotting方法检测ER-α36的表达变化。用1×10-10mol/L的17β-雌二醇处理沉默ER-α36的SGC7901细胞,用细胞计数法观察细胞增殖能力的变化及检测相关下游信号通路分子Src、ERK1/2、cyclin D1表达的变化。结果:阳性克隆PCR及测序证明成功构建慢病毒载体LV-ER-α36-RNAi,倒置显微镜下观察LV-ER-α36-RNAi慢病毒载体感染率达80%以上。Real-time PCR和Western blotting方法证实四环素(Te T)诱导下LV-ER-α36-RNAi明显抑制SGC7901细胞内ER-α36 mRNA和蛋白质的表达。与对照组相比,沉默ER-α36的SGC7901细胞增殖能力减弱,Src、ERK1/2、cyclin D1蛋白表达明显降低,Src蛋白活化能力减弱(P0.05)。结论:我们构建的Te T诱导靶向ER-α36的vshRNA慢病毒载体LVER-α36-RNAi,可明显沉默ER-α36的表达,为研究ER-α36蛋白的作用机理提供实验依据,ER-α36与胃癌细胞等肿瘤细胞的增殖有关。     

pEGFP-SPAST真核表达载体的构建及遗传性痉挛性截瘫的发病机制研究

目的 构建野生型和突变型SPAST真核表达载体,研究SPAST基因突变所致遗传性痉挛性截瘫的发病机制.方法 建立野生型pEGFP-SPAST基因表达载体,采用overlap PCR方法构建突变型pEGFP-SPAST真核表达载体.细胞转染野生型和突变型pEGFP SPAST真核表达载体,观察野生型和突变型spastin蛋白在COS-7细胞中的表达,采用免疫荧光染色技术观察spastin蛋白与微管、线粒体的定位关系.结果 野生型和突变型spastin蛋白均在细胞质中表达.免疫荧光检测发现野生型和突变型spastin蛋白均不与微管共定位,也均不与线粒体共定位.结论 成功构建了野生型和突变型pEGFP-SPAST真核表达载体.突变型spastin蛋白不改变其细胞质定位.功能研究提示spastin蛋白可能不直接调控微管功能和线粒体功能.     

携EGFP的人Synoviolin基因慢病毒表达载体的构建与鉴定

目的构建携EGFP的人Synoviolin基因慢病毒表达载体。方法应用基因重组手段,SalⅠ/NotⅠ双酶切质粒pIRES2-EGFP-syno,得到含EGFP和人Synoviolin的基因片段,将其亚克隆至入门载体pENTR1A的多克隆位点内得到入门质粒pENTR1A-syno-egfp。采用LR重组酶将pENTR1A-syno-egfp和目的载体pLenti4/TO/V5-DEST进行重组反应,形成慢病毒表达载体pLenti4/TO/V5-DEST-syno-egfp。将pLenti4/TO/V5-DEST-syno-egfp与包装质粒混合,利用脂质体共转染293FT细胞,包装产生慢病毒,以293FT细胞GFP蛋白的表达水平测定病毒滴度。结果PCR,酶切及测序结果表明慢病毒表达载体pLenti4/TO/V5-DEST-syno-egfp构建成功,转染后的293FT细胞在荧光显微镜下观察可见强绿色荧光。包装的慢病毒原液滴度为1×10~8TU/ml。结论成功构建了EGFP和Synoviolin基因共表达的慢病毒表达载体,为Synoviolin基因的功能研究提供了高效稳定的转基因技术平台。     

病毒介导的P53低表达HepG2细胞株的建立

目的构建干扰P53的逆转录病毒载体,建立稳定低表达P53的HepG2细胞株。方法合成干扰P53基因的寡核苷酸序列插入pMSCV-hyg-U6质粒,转化受体菌DH5α,经酶切测序鉴定后瞬时转染HepG2细胞,通过半定量RT-PCR方法检测P53 mRNA表达水平评估干扰效果;选择干扰效果最好的重组质粒转染PT67细胞进行病毒包装,获得逆转录病毒颗粒感染HepG2细胞,通过Hygromycin筛选获得多个细胞克隆,Western blot检测P53蛋白的表达情况;选择P53表达水平最低的细胞克隆。通过5-氟尿嘧啶(5-FU)诱导凋亡实验,检测P53低表达的HepG2细胞p53通路介导的细胞凋亡情况。结果经酶切和测序验证成功构建重组病毒载体;瞬时转染HepG2细胞后P53 mRNA表达下调;病毒颗粒感染HepG2细胞后P53的mRNA、蛋白表达下调;用5-FU处理后P53低表达HepG2细胞凋亡水平明显低于对照。结论成功构建了干扰P53的逆转录病毒载体,建立了P53低表达HepG2细胞株,明显阻断了P53通路依赖的细胞凋亡。     

α-synuclein基因过度表达诱导HEK293细胞α-synuclein蛋白病理性积聚

目的观察α-synuclein过度表达诱导HEK293细胞α-synuclein蛋白病理性积聚的作用。方法将消除终止密码子α-synuclein基因扩增产物连入pGEM T-easy载体，DNA测序证实后亚克隆入增强型绿色荧光蛋白pEGFP-N1质粒，通过限制性内切酶酶切鉴定重组质粒。采用脂质2000将野生型α-synuclein-EGFP真核表达载体转染HEK293细胞，48h后采用Axiovert200型倒置荧光显微镜、荧光免疫细胞化学观察其在细胞内的表达，HE染色观察细胞胞浆内嗜酸性小体的形成。结果消除终止密码子的扩增序列经测序证实并亚克隆入pEGFP-N1质粒后，限制性内切酶酶切鉴定质粒大小、酶切位点上均符合实验设计。将野生型α-synuclein-EGFP真核表达载体转染HEK293细胞，48h后荧光显微镜下观察细胞在波长488nm蓝色激发光下发出明亮的绿色荧光，其中某些细胞出现绿色荧光物质积聚；免疫荧光细胞化学检测，EGFP阳性细胞同时也表现为α-synuclein免疫反应阳性，某些细胞胞浆内可见α-synuclein免疫阳性产物聚集；HE结果发现一些细胞胞浆内出现圆形的嗜酸性小体形成，约占细胞总数的10．8％。结论野生型α-synuclein基因过表达可诱导α-synuclein蛋白在HEK293细胞内积聚，胞浆内嗜酸性小体形成。     

Gαs慢病毒载体的构建、鉴定与表达

目的:构建Gαs慢病毒表达载体并检测其表达性能,以便应用过表达技术进一步研究Gαs功能。方法:设计针对人Gαs DNA序列的带酶切位点引物,PCR扩增获得双链DNA后,与酶切后的FUW载体片段进行连接、转化,酶切及DNA测序鉴定重组克隆。提取阳性克隆质粒,转染293T细胞。用293T细胞制备慢病毒颗粒,感染293T细胞后收集细胞全蛋白,用QPCR、Western blot检测慢病毒系统过表达效果。结果:证实人Gαs正确插入慢病毒载体,人Gαs慢病毒过表达质粒及相应病毒颗粒能有效过表达Gαs。结论:人Gαs慢病毒表达系统的成功建立,为应用过表达技术研究人Gαs慢病毒功能打下了基础。     

大鼠Olig2基因慢病毒表达载体的构建及其转染后对少突胶质前体细胞分化的影响

目的 构建大鼠少突胶质细胞转录因子2(Olig2)的慢病毒表达载体,并转染少突胶质前体细胞(OPCs),观察Olig2过表达对OPCs向少突胶质细胞(OLs)分化的影响.方法 设计合成PCR引物,从大鼠pEGFP-N3-Olig2表达质粒中扩增并克隆大鼠Olig2-EGFP片段,将其插入到pLenti6.3慢病毒表达载体中,形成pLenti6.3-Olig2-EGFP慢病毒表达载体.将其与包装质粒混合后共转染293T细胞,包装产生慢病毒后感染培养的OPCs,观察Olig2在感染细胞中的表达并鉴定其表达对OPCs向OLs分化的影响.结果 成功将大鼠Olig2-EGFP片段克隆入pLenti6.3慢病毒表达载体,构建的pLenti6.3-Olig2-EGFP慢病毒表达载体能够高效表达.与空质粒转染的OPCs相比,重组质粒转染的OPCs体外诱导分化后产生更多的OLs (n =5,P＜0.01).结论 成功建立大鼠pLenti6.3-Olig2-EGFP慢病毒表达系统,慢病毒介导的Olig2过表达促进大鼠OPCs向OLs分化.     

pVAX1-IL-4/SYN-B融合质粒的构建及表达

目的构建含人白介素4(human IL-4,hIL-4)基因与人α-突触核蛋白(humanα-synuclein,hα-syn)B细胞表位基因的真核表达质粒,并研究其在COS-7细胞内的表达。方法RT-PCR扩增人IL-4基因后,通过基因重组技术将其与α-synuclein蛋白B细胞表位基因融合,在两者之间引入柔性短肽(GSGGGSG)。将融合产物克隆到真核表达载体PVAX1上,利用电泳和测序鉴定融合质粒的大小、方向和序列。采用脂质体转染法,将融合质粒转入COS-7细胞中,用Western blotting技术检测其表达。结果电泳和测序结果与预期一致,并命名为PVAX1-IL-4/SYN-B;质粒转染COS-7细胞株成功,并且能在细胞内高效表达。结论成功构建PVAX1-IL-4/SYN-B融合质粒,并在哺乳动物COS-7细胞中高效表达,为研究融合质粒在帕金森病动物模型中的免疫效果奠定了基础。     

RPS14基因RNAi慢病毒载体构建及在SKM-1细胞中的表达

背景：有研究表明,造血干/祖细胞内RPS14表达减少可导致造血细胞病态造血,尤其是向红系分化受阻,提示RPS14的正常表达有助于维持机体的正常造血。 目的：构建RPS14基因RNAi慢病毒载体,并观察该基因在人骨髓增生异常综合征细胞株SKM-1细胞中的表达。 方法：针对已经筛选确定的RPS14基因RNAi有效靶序列,构建GC-shRPS14慢病毒载体并测序鉴定。用GC-shRPS14、pHelper 1.0载体和pHelper 2.0载体共转染包装细胞293T细胞,包装产生慢病毒,测定病毒滴度;并将获得的RPS14shRNA慢病毒载体GC-shRPS14转染人骨髓增生异常综合征细胞株SKM-1,用Western Blot检测靶细胞内RPS14蛋白的表达。 结果与结论：经测序证实,构建出了RPS14shRNA的慢病毒载体GC-shRPS14。包装慢病毒,浓缩病毒悬液的滴度为2×109 TU/mL。荧光显微镜下能直接观察到转染组细胞的GFP表达,转染效率为75%,Western Blot检测到转染后RPS14在靶细胞中表达明显被抑制。说明成功构建RPS14基因RNAi慢病毒载体,转染人SKM-1细胞株后RPS14蛋白表达沉默。