PCR结合基因扫描分析技术对几种深部真菌病致病菌的快速检测及鉴定

目的 用PCR法快速鉴定22种(23株)深部真菌病致病菌种。方法 应用荧光标记的真菌通用引物ITS4与ITS86对22种(23株)深部真菌病致病菌种的菌悬液进行PCR扩增，扩增产物经ABI PRISM^TM377测序仪及基因扫描分析软件精确测定片段大小，与对照组——相应菌种采用传统方法抽提DNA后扩增片段的扫描分析结果相对照。结果 ①17种致病菌种菌悬液经ITS4、ITS86扩增出单一的片段(除了构巢曲霉和黑曲霉、白念珠菌和类星形念珠菌、裴氏着色真菌和皮炎外瓶霉片段长度相同)。②菌悬液扩增片段的扫描分析结果与其DNA扩增结果相近，差异无显著性。③整个检定过程仅需6h。结论 采用ITS通用引物及菌悬液PCR检测法，结合基因扫描分析技术可准确、特异、快速、敏感地检测并鉴定出22种深部真菌病致病菌种，这将有望成为快速诊断深部真菌病的一种方法。     

PCR-RFLP技术快速鉴定八种致病丝状病原真菌的实验研究

目的 建立能快速鉴定深部丝状真菌感染病原菌的PCR-RFLP方法。方法 用真菌通用引物扩增烟曲霉、黄曲霉、土曲霉、黑曲霉、杂色曲霉、构巢曲霉、尖端赛多孢和串珠镰刀菌的ITS区,分别用HhaⅠ、HaeⅢ、HinfⅠ、TaqⅠ和MspⅠ 5种限制性核酸内切酶对PCR产物进行酶切,建立以PCR为基础的RFLP方法,然后对22株临床株和2株环境分离株进行PCR-RFLP图谱分析。结果 对PCR产物进行RFLP分析可以准确鉴定8种深部致病丝状真菌,从DNA提取到酶切分析可以在1个工作日完成。22株临床株和2株环境分离株PCR-RFLP鉴定结果与传统的形态学鉴定结果一致。结论 PCR-RFLP技术是一种能够快速鉴定丝状真菌的有效方法。     

真菌四重PCR体系的建立及其临床应用

目的建立多重PCR体系并探讨其用于深部真菌感染诊断的可行性。方法用真菌通用引物内转录间区(ITS)联合曲霉属、镰刀菌属、毛孢子菌属、白念珠菌、新生隐球菌特异性引物建立多重PCR体系,用单重和四重PCR检测模拟体液和30例可疑深部真菌感染患者临床标本中的真菌。结果ITS可与5对属或种特异性引物任意组合(二重PCR),四重PCR组合为ITS+毛孢子菌属+白念珠菌+新生隐球菌。30例临床标本中,真菌培养、PCR检测的阳性率分别为26.67%和43.33%,两种方法的检出率差异无统计学意义(P0.05)。结论单重和四重PCR敏感性高、稳定性好、操作简单、耗时短,可为深部真菌感染的早期诊断提供病原学依据。     

聚合酶链反应检测深部致病真菌的实验研究

目的 建立能用于临床实践的检测常见致病真菌的聚合酶链反应(PCR)方法.方法 设计了以热启动PCR为基础的实验方法,首先用真菌通用引物对标本进行单重PCR,若阳性,再用白念珠菌、烟曲霉和新生隐球菌的种特异性引物进行三重PCR来检测这3种常见致病真菌.结果 对9属55种78株常见深部真菌均扩增出260bp的DNA片段,而对细菌和人DNA均未扩增出目的 片段,具有高度特异性和敏感性,该方法操作简便且成本低.结论 以热启动PCR为基础的单重PCR和三重PCR方法可能成为临床上深部真菌感染理想的快速诊断工具.     

PCR检测深部致病真菌感染的研究

目的探讨PCR在可疑深部真菌感染临床标本检测中的应用。方法对60份临床标本分别进行传统真菌培养以及真菌通用引物PCR和三重PCR检测。结果真菌培养阳性共19份，其中白念珠菌10份、烟曲霉2份、新生隐球菌2份、其他菌株5份（包括光滑念珠菌2份、热带念珠菌2份、克柔念珠菌1份）；真菌通用PCR检测共有21份阳性，经三重PCR检测共有15份阳性，分别为白念珠菌10份、烟曲霉3份、新生隐球菌2份。PCR方法与传统培养方法相比，检出率差异无统计学意义。结论PCR检测可疑深部真菌感染临床标本快速简便，稳定性好，敏感性和特异性均较理想，适合临床实验室常规使用。     

用内转录间隔区通用引物的聚合酶链反应快速测定念珠菌菌种

目的：应用内转录间隔区（ITS）通用引物建立一种较为快速、简便的检测和鉴定念珠菌的聚合酶链反应（PCR）方法。方法：采用两对ITS通用引物ITS1、ITS4和ITS86、ITS4对7种（8株）念珠菌菌县液进行PCR扩增。结果：两对引物3.5h内对7种念珠菌的菌县液扩增出种特异的DNA多带，而第2对引物其种特异性更强。结论：采用ITS通用引物结合快速PCR检测法，可快速、简便、特异、敏感地检测出念珠菌，并能同时鉴定到种，这将在今后念珠菌病的早期诊断和治疗上有潜在的应用价值。     

应用PCR-RFLP进行申克孢子丝菌的分子生物学鉴定

目的　探索一种简单、快速的申克孢子丝菌的鉴定方法。方法　应用真菌通用引物ITS1和ITS4对来源于不同地区及不同临床型别孢子丝菌病的 2 8株申克孢子丝菌以及 9种其他临床上重要的真菌进行PCR扩增 ,利用限制性内切酶HaeⅢ对PCR产物进行酶切分析鉴定。结果　所有 2 8株申克孢子丝菌和其他 9种真菌均扩增出一条约 3 5 0bp的片段 ,其中 2 8株申克孢子丝菌RFLP带型一致 ,与 9种其他临床上重要的真菌RFLP带型差异较明显。 结论　PCR RFLP可以为建立一种简单、快速鉴定申克孢子丝菌的方法提供依据。     

真菌

20 0 0 150 6　某些致病真菌的聚合酶链反应检测 /朴英兰 (北京医大一院皮肤科 )…∥中华皮肤科杂志 .-1999,32 ( 6) .- 397建立一种比其它常规方法更为快速、稳定的体系 ,以协助临床早期诊断。共收集临床株 56株。制备模板DNA,引物为细胞色素 P4 50 L1A1基因序列引物 ,目的片段 PCR扩增。结果 :应用 ITS内转录间隔区通用引物 ,从所有受试真菌 DNA中均获得阳性 PCR扩增产物 ,出现预期的 148bp～ 4 78bp唯一条带 ;应用 DH- 1558念珠菌属特异引物 ,其扩增产物出现多条非特异性条带 ;应用 144 0 6/ 144 0 7白念珠菌特异性引物 ,经PCR…     

聚合酶链反应快速诊断浅部真菌病

目的评价聚合酶链反应（PCR）技术直接从临床标本中检测浅部真菌病病原真菌的方法.方法采用蛋白酶K消化法和煮沸法处理临床标本,从中提取致病菌DNA,然后用真菌通用引物ITS1进行PCR扩增检测,并与直接镜检和培养法作对比.结果共收集112例临床标本,PCR检测、直接镜检和培养的敏感性分别为80.7%、96.5%和70.2%,特异性分别为100%、89.1%和100%,阳性预测值分别为100%、90.2%和100%,阴性预测值分别为83.3%、96.1%和76.4%.PCR方法在24 h内即可完成从标本处理至结果判读的全过程.结论PCR检测具有较好的特异性和准确性,且比培养缩短了近2周的时间,为临床快速诊断和及时、合理地治疗浅部真菌病提供参考.     

半巢式PCR-RFLP法快速鉴定临床标本中的皮肤癣菌

目的探索快速鉴定皮肤癣菌病临床标本中致病菌的分子生物学方法。方法以皮肤癣菌的基因组DNA为模板,采用一对半真菌通用引物(NS5、ITS1、ITS4)行半巢式PCR扩增rDNA上的ITS段,用限制性内切酶BciT130Ⅰ及DdeⅠ酶切目的片段,凝胶电泳。结果7种65株常见皮肤癣菌培养菌株和17例临床标本的半巢式PCR-RFLP图谱特异;且临床标本与相应的培养菌株酶切图谱一致。结论半巢式PCR-RFLP方法适合培养菌株和临床标本病原菌的快速准确鉴定。     

PCR检测部分病原真菌的实验研究

为探讨和评价ＰＣＲ技术在检测和鉴定病原真菌方面的作用,重点是引物的选择。首先比较了来自ｒＤＮＡ基因序列的通用引物的通用性,并用３对种特异性引物进行２次套式扩增。结果表明３对通用引物均能扩增出预期的靶ＤＮＡ带,平均大小分别为６２０ｂｐ,４８５ｂｐ和５８０ｂｐ;３对种特异性引物分别扩增出白念珠菌、新生隐球菌和烟曲霉ＤＮＡ,并提高了敏感性。说明用通用引物和种特异引物进行ＰＣＲ扩增可以用于病原真菌的检测和     

PCR方法快速检测一些常见医学真菌

目的 为选择一种快速、敏感和特异的方法来检测临床感染的真菌。方法 选取真菌１８ＳｒＤＮＡ序列中两个片段设计引物,对１２种菌株进行ＰＣＲ扩增,均扩增出长约３１０ｂｐ产物。对一些临床常见细菌扩增均无反应。对酶母相真菌白念珠菌、新生隐球菌进行敏感性实验检测。结果 发现二者ＰＣＲ最小检出量均为菌体数达每个反应体系１０＾３。本实验过程总耗时３６ｈ以内。结论 本实验方法可快速特异性检测一些常见医学真菌。     

二次PCR用于临床标本真菌感染快速分子诊断的研究

目的 探讨二次PCR技术诊断疑似真菌感染临床标本的敏感性。方法 收集临床疑似真菌感染的深部位痰及肺泡灌洗液标本共29份,分别进行真菌直接镜检、真菌培养、真菌通用引物单次与二次PCR扩增rDNA的ITS区,并对真菌检出阳性率和多种真菌菌种检出率进行比较分析。结果 临床疑似病例痰及肺泡灌洗液标本真菌镜检、真菌培养、单次PCR和二次PCR真菌检出阳性率分别为20.7%（6/29）、37.9%（11/29）、17.2%（5/29）和48.3%（14/29）。真菌培养、单次PCR和二次PCR提示二种以上真菌菌种检出的比例分别为6.9%（2/29）、3.4%（1/29）和24.1%（7/29）。二次PCR与单次PCR的真菌检出率差异有统计学意义（χ2 = 6.34,P < 0.05）。在两种以上菌种检出率方面,二次PCR与真菌培养和单次PCR间差异均有统计学意义（χ2 = 4.09,6.30,P值均 < 0.05）。结论 二次PCR技术有助于提高临床标本真菌分子诊断的敏感性。     

Rapid real-time diagnostic PCR for Trichophyton rubrum and Trichophyton mentagrophytes in patients with tinea unguium and tinea pedis using specific fluorescent probes

BackgroundTrichophyton rubrum and Trichophyton mentagrophytes human-type (synonym, Trichophyton interdigitale (anthropophilic)) are major causative pathogens of tinea unguium. For suitable diagnosis and treatment, rapid and accurate identification of etiologic agents in clinical samples using reliable molecular based method is required.ObjectiveFor identification of organisms causing tinea unguium, we developed a new real-time polymerase chain reaction (PCR) with a pan-fungal primer set and probe, as well as specific primer sets and probes for T. rubrum and T. mentagrophytes human-type.MethodsWe designed two sets of primers from the internal transcribed spacer 1 (ITS1) region of fungal ribosomal DNA (rDNA) and three quadruple fluorescent probes, one for detection wide range pathogenic fungi and two for classification of T. rubrum and T. mentagrophytes by specific binding to different sites in the ITS1 region. We investigated the specificity of these primer sets and probes using fungal genomic DNA, and also examined 42 clinical specimens with our real-time PCR.ResultsThe primers and probes specifically detected T. rubrum, T. mentagrophytes, and a wide range of pathogenic fungi. The causative pathogens were identified in 42 nail and skin samples from 32 patients. The total time required for identification of fungal species in each clinical specimen was about 3 h. The copy number of each fungal DNA in the clinical specimens was estimated from the intensity of fluorescence simultaneously.ConclusionThis PCR system is one of the most rapid and sensitive methods available for diagnosing dermatophytosis, including tinea unguium and tinea pedis.     

Genetic identification and detection of human pathogenic Rhizopus species, a major mucormycosis agent, by multiplex PCR based on internal transcribed spacer region of rRNA gene

BACKGROUND: Mucormycosis is an invasive opportunistic infection caused by fungi belonging to the order Mucorales. Due to the lack of laboratory tests, the diagnosis of mucormycosis is notoriously difficult. Added with its rapid progression as well as the debilitated state of the patients who contract the disease, mortality is extremely high. OBJECTIVE: The goal of this study was to genetically identify human pathogenic Rhizopus species, a major mucormycosis agent, by the internal transcribed spacer (ITS) region of rRNA gene. METHODS: Primers were designed to identify five Rhizopus species known to cause human disease by multiplex PCR. PCR was done not only with test strains and clinical isolates, but also with clinical samples from cutaneous mucormycosis patients. Sporangiospore morphology was observed by scanning electron microscopy to confirm the correlation of phenotypic and genotypic features. RESULTS: Multiplex PCR identified five Rhizopus species including Rhizopus oryzae, where R. azygosporus could only be distinguished from R. microsporus by certain polymorphisms that were present in its sequence. When this multiplex PCR was applied to clinical samples from three mucormycosis patients (paraffin sections from all and sera from one patient), Rhizopus DNA corresponding to the isolated pathogens were specifically detected. CONCLUSION: While fungal DNA detection from clinical samples is a rigorously studied area, this is the first report to genetically identify and detect Rhizopus species from human mucormycosis specimens. This may expand the possibility of this multiplex PCR system not only to identify isolated fungi, but also as a screening method for visceral mucormycosis.