维甲酸联合神经生长因子体外诱导人脐血间充质干细胞向神经样细胞定向分化的实验研究

目的:探讨脐血间充质干细胞(MSCs)向神经样细胞定向诱导分化的条件及方法,以明确其神经分化潜能。方法:将人脐血间充质干细胞体外培养扩增、保存后,取第5代的MSCs分别用维甲酸(RA)、维甲酸联合神经生长因子(NGF)诱导方法向神经样细胞诱导,诱导分化期间观察细胞形态变化,并比较表达神经元特异性烯醇化酶(NES)mRNA、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)mRNA的差异。结果:两种不同诱导方法均能诱导细胞发生典型变化,对照组未发现神经样细胞生长。免疫组化法显示三种诱导方法诱导后均表达Nestin、NSE、GFAP,NGF+RA组多于RA组。Real-time RT-PCR显示诱导组及对照组均有NSE mRNA、GFAP mRNA表达,但两种诱导方法诱导后表达上调(P<0.05),添加NGF较单纯RA组上调明显(P<0.05)。结论:脐血MSCs经两种神经营养因子诱导法均可分化为神经样细胞,并表达神经细胞特异性标志物,其中添加NGF后较单纯应用RA诱导效果好。     

阿魏酸钠诱导骨髓间充质干细胞向神经细胞分化的初步研究

目的 探讨阿魏酸钠诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经细胞分化的可能作用。方法 分离培养大鼠骨髓间充质干细胞，采用阿魏酸钠对其进行诱导培养，倒置显微镜下观察诱导培养不同时间后细胞的形态变化，并应用免疫细胞化学方法鉴定诱导培养后细胞表面神经细胞特异性标志物神经丝蛋白(NF)及神经元特异性烯醇化酶(NSE)的表达。结果 阿魏酸钠诱导培养6h后即可见细胞形态发生明显变化，24h后表现为典型的神经细胞样形态，NF和NSE神经细胞特异性标志物呈阳性表达。结论 初步证实阿魏酸钠具有诱导体外培养的大鼠骨髓间充质干细胞向神经细胞分化的作用。     

人脐血间充质干细胞的分离培养与向神经元样细胞诱导分化的实验研究

目的 探讨来源于人脐血的间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)分化成神经元样细胞的可行性，以及在体外分离、纯化和扩增的条件。方法 无菌条件下收集正常足月剖腹产胎儿的脐带血，经肝素抗凝，用淋巴细胞分离液分离脐血的单个核细胞，以偏酸性的Mesencult^TM作为培养基进行培养和纯化，获得贴壁细胞，取扩增第三代后的MSCs向神经元样细胞诱导分化。用免疫荧光标记方法检测神经元特异性标记物。结果 来源于脐血的单个核细胞种植于特定的培养基中后，可产生贴壁细胞，主要表现为破骨样和间充质样细胞；传3代后，这些细胞可得到纯化、扩增；免疫组化标记显示经诱导后的MSCs表达神经丝蛋白(NF)和神经元特异性烯醇化酶(NSE)。结论 源于脐血的MSCs在体外可以培养、扩增，并向神经元样细胞分化，可作为神经干细胞的来源而用于实验研究和临床。     

当归诱导骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞

目的：研究当归体外定向诱导大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)分化的作用。方法：通过贴壁法分离大鼠MSCs，体外扩增培养。MSC用20μl当归注射液／ml含10％胎牛血清的L—DMEM为预诱导条件，预诱导24h后用当归注射液100μl/ml不含胎牛血清的L—DMEM进行诱导。光镜下观察细胞形态，免疫细胞化学检测神经细胞特异性抗原标志。结果：大鼠骨髓间充质干细胞可通过贴壁法成功分离并可在体外大量扩增。当归诱导3h后大部分MSCs转变为神经元样细胞，出现胞体和突起，免疫细胞化学染色NSE及nestin呈阳性、GFAP性。结论:大鼠骨髓间质干细胞可在体外诱导分化为神经元样细胞。     

褪黑激素体外定向诱导骨髓间充质干细胞的研究

目的:探讨褪黑激素(melatonin,MT)体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞(marrow mesenchymal stem cells,MSCs)不同时段向神经细胞分化的情况。方法:采用细胞培养技术分离培养和纯化大鼠MSCs,以MT为诱导剂诱导大鼠MSCs向神经细胞分化。分别在诱导后3,7,10,14 d以免疫荧光法测定神经干细胞特异性标志(nestin)、神经元细胞特异性标志(neurofilament,NF)和星形胶质细胞特异性标志(GFAP)的表达。结果:MT诱导分化3 d,部分细胞胞体收缩成三角形,有些成为简单的双极或多极细胞。诱导3 d细胞开始表达nestin,7~14 d表达nestin和NF,细胞不表达GFAP。结论:MT可诱导大鼠MSCs分化为神经细胞。     

成人骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞的体外研究

目的 探索成人骨髓间充质干细胞在体外定向分化为神经元样细胞的条件。方法 采用Ficoll-paque(1．077g／m1)分离液密度梯度离心从人的骨髓分离出骨髓间充质干细胞，体外扩增到第10代，选择4组不同组合的神经分化诱导条件，分别诱导骨髓间充质干细胞向神经元细胞分化，通过免疫细胞化学鉴定诱导后细胞神经元烯醇化酶、神经丝蛋白、胶质纤维酸性蛋白的表达情况。结果各组诱导剂诱导后，骨髓间充质干细胞分化为具有典型的神经元形态的细胞，免疫细胞化学显示、NF-M呈强阳性反应，NSE表达强度提高，在最佳的分化条件下，即加入bFGF、ATRA、BME、BHA、DMSO诱导条件下，大约80％细胞表达NF—M，86％的细胞为NSE强阳性。结论 成人MSCs在体外可定向诱导分化为神经元样细胞，且具有较高的阳性分化率。     

OECs无血清上清液体外诱导UB-MSCs向神经细胞分化

目的:观察大鼠嗅鞘细胞无血清上清液诱导脐血间充质干细胞向神经细胞分化的作用。方法:采用差速贴壁联合阿糖胞苷抑制法获得较高纯度的嗅鞘细胞,在最佳状态细胞无血清培养后取上清液。收集正常足月剖腹产胎儿的脐带血,经肝素抗凝,用淋巴细胞分离液分离脐血的单个核细胞,采用差速贴壁法纯化间充质干细胞,传第三代后用上述收集的嗅鞘细胞无血清上清液诱导,观察诱导分化过程,免疫组化鉴定分化结果。结果:用差速贴壁和阿糖胞苷抑制法可获得纯度高达95%的嗅鞘细胞,使用无血清嗅鞘细胞上清液培养脐血间充质干细胞后,发现能诱导脐血间充质干细胞向神经细胞形态分化,胞体呈椭圆形,伸出长突起。诱导7天后相差显微镜下可观察到神经干细胞、神经元和胶质细胞形态的细胞,与NSE、GFAP细胞免疫组化结果一致。结论:大鼠嗅鞘细胞无血清上清液有明显诱导脐血间充质干细胞分化为神经细胞的作用。     

成人骨髓间充质干细胞体外诱导向神经细胞分化

目的:探讨成人骨髓间充质干细胞(MSC)向神经细胞体外定向诱导分化的条件. 方法:从正常成人志愿者髂骨中分离获取MSCs,体外培养扩增纯化后传代于塑料培养皿中,采用2-巯基乙醇(BME)和二甲亚砜(DMSO)对传至3～5代的细胞进行体外诱导分化,采用免疫细胞化学法对诱导后的细胞鉴定. 结果:诱导1 h有部分细胞表达神经干细胞标志巢蛋白nestin,4 h后大部分细胞具有典型神经元形态,表达晚期神经元标志物-中间神经丝蛋白(NF-M),部分具有神经元形态的细胞表达微管相关蛋白-2 (MAP-2). 结论:成人骨髓间充质干细胞可以在体外培养扩增并诱导成为神经元样细胞.     

维甲酸联合脑源性神经生长因子体外诱导人脐血间充质干细胞向神经样细胞定向分化的实验研究

目的探讨脐血间充质干细胞（MSCs）向神经样细胞定向诱导分化的条件及方法,以明确其神经分化潜能。方法将人脐血MSCs体外培养扩增、保存后,取第5代的MSCs分别用维甲酸（RA,RA组）、维甲酸联合脑源性神经生长因子（BDNF,RA＋BDNF组）诱导方法向神经样细胞诱导,诱导分化期间观察细胞形态变化,同时设对照组,对照组不加任何诱导分化剂,比较3组巢蛋白（nestin）、神经元特异性烯醇化酶（NES）、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的表达差异。结果两种不同诱导方法均能诱导细胞发生典型变化,对照组未发现神经样细胞生长。免疫组化法显示3组诱导后均表达nestin、NSE、GFAP,BDNF＋RA组的表达量多于RA组。Real-time RT-PCR显示诱导组及对照组均有NSE mRNA、GFAP mRNA表达,但RA组、RA＋BDNF组诱导后表达上调（P〈0.05）,且RA＋BDNF组较单纯RA组上调明显（P〈0.05）。结论脐血MSCs经两种神经营养因子诱导均可分化为神经样细胞,并表达神经元特异性标志物,其中添加BDNF后较单纯应用RA诱导效果好。     

骨髓间充质干细胞向神经细胞分化过程中Tau蛋白表达量的变化

目的:观察体外诱导新生豚鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)分化为神经细胞过程中神经细胞Tau蛋白表达量的改变.方法:用H-DMEM培养基加胎牛血清(H-DMEM/FBS)体外培养新生豚鼠MSCs并传代扩增;分为实验组和对照组,实验组使用含细胞因子的培养基诱导MSCs向神经细胞分化,对照组加入不含细胞因子的培养基;用倒置显微镜观察2组细胞形态学改变;用ELISA法定量分析诱导分化第1、4、7、10天和第14天Tau蛋白含量的变化;免疫细胞化学法检测第14天神经元特异性烯醇化酶(NSE)和Tau蛋白的表达.结果:在细胞因子作用下豚鼠骨髓MSCs逐渐向神经细胞分化,在诱导第10天时形态上有典型神经细胞样改变;ELISA法检测发现Tau蛋白在诱导分化早期含量很低,随着诱导分化时间的延长,Tau蛋白含量逐渐升高,第10天趋于稳定,至第14天时Tau蛋白含量无明显增加;免疫细胞化学法可检测到NSE和Tau蛋白抗体阳性细胞.结论:间充质干细胞向神经细胞分化过程中Tau蛋白表达量逐渐升高,其稳定表达可能是神经细胞分化完成或成熟的标志之一.     

人脐带血细胞分化为神经样细胞的实验研究

为探讨人脐带血细胞分化为神经样细胞的可行性 ,无菌条件下采集正常人脐血 5 0～ 10 0mL置于加有抗凝剂的采血袋中 ,分离脐血单个核细胞进行培养 ,并加入细胞因子加以诱导分化 ,利用免疫细胞化学方法进行鉴定。结果显示 :脐血单个核细胞能在体外培养中增生分化和表达干细胞特异性抗原神经巢蛋白 (nestin) ,并最终分化为神经元样和神经胶质样细胞。免疫组化染色可见神经元特异性烯醇化酶 (NSE)和胶质原性纤维酸性蛋白 (GFAP)抗原表达。碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF)和表皮生长因子 (EGF)协同作用对脐血细胞的分化有促进作用。提示 :脐血单个核细胞具有增生和分化潜能 ,可分化为神经元样及神经胶质细胞样细胞 ,可以作为神经细胞的种子细胞。     

脐带源性和脐血源性间充质干细胞分离培养方法的比较

目的建立分离培养人脐带间充质干细胞（UCMSCs）和脐带血间充质干细胞（UCBMSCs）的方法,并比较其效果。方法无菌条件下采集健康足月新生儿脐带及脐血各30份,分别通过原代贴壁培养法、酶消化法培养UCMSCs,及淋巴细胞分离液法、羟乙基淀粉沉降与淋巴细胞分离两步分离法获得脐血中单个核细胞培养UCBMSCs。应用含10％胎牛血清的DMEM／F12培养基,比较UCMSCs和UCBMSCs分离培养的效果与生长形态。流式细胞术检测其表面标志及诱导分化鉴定其分化能力。结果UCMSCs原代贴壁培养法8d左右可见成纤维样细胞从组织块边缘爬出且成簇生长,酶消化法培养UCMSCs5d左右均匀生长;UCBMSCs分离培养用羟乙基淀粉沉降与淋巴细胞分离两步法得到的细胞数量较淋巴细胞分离法明显增多。两种来源MSCs培养方法相比较,UCMSCs原代培养的时间短,培养成功率明显增高。流式细胞仪检测两种来源的MSCs具有MSCs表面标志特征。定向诱导分化结果表明MSCs具有被诱导为成骨细胞、脂肪细胞的分化能力。结论人脐带来源间充质干细胞原代培养周期短,培养效率更高;脐血间充质干细胞的分离方法中羟乙基淀粉沉降与淋巴细胞分离两步法效率更高。     

人脐血间充质干细胞体分离、培养及向脂肪细胞分化的实验研究

目的:探讨脐血间充质干细胞(UCB-MSCs)的分离培养及向脂肪细胞的分化潜能。方法:从足月儿脐血中获得间充质干细胞,体外培养传代,流式细胞检测细胞表面及抗原细胞周期;予10-6M地塞米松、100μg/ml1-甲基-3-异丁基-黄嘌呤(IBMX)、50μg/ml抗坏血酸的IMDM培养基,对MSCs进行诱导向脂肪细胞分化,油红-O染色染色鉴定。结果:成功建立了脐血间充质干细胞分离及培养扩增的方法;流式细胞仪检测结果显示,贴壁细胞均表达CD105、CD29和CD44,不表达造血细胞表型CD34、CD45和内皮细胞表型CD31;经脂肪培养液诱导后在细胞胞浆里可见颗粒状红色脂滴形成。结论:脐血间充质干细胞能进行体外分离培养,并能诱导分化为脂肪细胞。     

人脐血单个核细胞诱导分化为神经元样细胞

目的 探讨人脐血单个核细胞体外向神经元样细胞定向诱导分化的条件。方法 无菌条件下采集正常人脐血，分离单个核细胞。用DMEM/F12培养基进行纯化和扩增培养。取扩增5代的间充质干细胞(MSC)，分别用B-巯基乙醇(B—ME)、二甲基亚砜(DMSO)、神经条件培养液诱导脐血MSC向神经元样细胞分化。免疫组化法检测脐血MSC的Nestin表达和神经元样细胞特异性标志。结果 脐血原代和2、5代MSC的Nestin表达阳性率分别为6．7％、12．4％和20．8％。神经条件培养液诱导神经元样细胞阳性率最高达36％，B—ME、DMSO分别为33％和25％。结论脐血MSC具有神经干／祖细胞的特性，在一定条件下能向神经元样细胞分化。     

鼠胶质瘤细胞上清液诱导人骨髓间充质干细胞向神经元样细胞的分化

目的：分离培养人骨髓间充质干细胞(MSCs),探讨鼠胶质瘤细胞上清液对其向神经元样细胞的诱导分化。方法：利用Percoll梯度分离法,培养人MSCs。采用鼠胶质瘤细胞上清液对MSCs进行诱导分化。观察人MSCs经诱导后细胞的形态变化,采用免疫细胞化学方法检测神经元烯醇化酶(NSE)、神经丝蛋白(NF)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达。 结果：诱导24 h后,细胞胞体收缩呈锥形或球形,有突起长出,细胞间突起相互连接,交错成网,为典型的神经元样形态。免疫细胞化学结果显示,经诱导培养后的神经元样细胞的胞体及部分突起NSE和NF染色呈强阳性表达,而GFAP 染色呈阴性。诱导组出现NSE阳性的细胞率为(79.5±3.2)%,而对照组出现NSE阳性的细胞率为(12.1±2.0)%,两组之间比较差异有显著性 (P<0.01)。诱导组出现NF阳性的细胞率为(41.2±2.4)%,而对照组为阴性。结论：鼠胶质瘤细胞上清液可以诱导MSCs向神经元样细胞分化。     

全反式维甲酸促人脐血多能干细胞向多巴胺能神经元分化

目的探讨在全反式维甲酸(all-trans retinoic acid,ATRA)作用下,人脐血多能干细胞(cord blood-stem cells,CB-SCs)向多巴胺能神经元的分化潜能。方法分离、培养CB-SCs后,分为诱导组、神经培养基对照组和无血清培养基对照组。诱导培养12 d后,观察干细胞的形态学变化,免疫化学荧光法检测多巴胺神经元标志物的表达。ELISA法检测上清液中多巴胺递质的含量。结果 ATRA处理后,大部分CB-SCs出现神经样分化,神经培养基对照组仅少量CB-SCs出现神经样分化,无血清培养基对照组CB-SCs继续扩增而无明显形态学变化;诱导组(48±11)%的细胞酪氨酸羟化酶(TH)表达阳性;神经培养基对照组仅少量TH阳性细胞;ELISA检测结果表明,诱导组多巴胺较神经培养基对照组明显升高(P<0.001)。结论 ATRA可以较为高效地促CB-SCs分化为多巴胺能神经元。     

人脐血单个核细胞诱导分化为神经元样细胞

目的 探讨人脐血单个核细胞体外向神经元样细胞定向诱导分化的条件。方法 无菌条件下采集正常人脐血,分离单个核细胞。用DMEM/F12培养基进行纯化和扩增培养。取扩增5代的间充质干细胞(MSC),分别用β-巯基乙醇(β-ME)、二甲基亚砜(DMSO)、神经条件培养液诱导脐血MSC向神经元样细胞分化。免疫组化法检测脐血MSC的Nestin表达和神经元样细胞特异性标志。结果 脐血原代和2、5代MSC的Nestin表达阳性率分别为6.7%、12.4%和20.8%。神经条件培养液诱导神经元样细胞阳性率最高达36%,β-ME、DMSO分别为33%和25%。结论 脐血MSC具有神经干/祖细胞的特性,在一定条件下能向神经元样细胞分化。     

脐血间质干细胞移植后梗死心肌细胞的凋亡及意义

目的探讨脐血间质干细胞移植对梗死心肌残存心肌细胞凋亡的影响。方法无菌条件下采集成年杂种妊娠犬脐血,体外分离、纯化、培养、扩增脐血间质干细胞,经5-氮杂胞苷(5-aza)体外诱导向肌源性细胞分化,DAPI荧光标记,经左冠状动脉前降支灌注移植入成年杂种犬急性心肌梗死模型区域,2、4、8周取心肌标本,采用HE染色及TUNEL法检测犬心肌梗死模型中脐血间质干细胞移植后心肌细胞的凋亡情况。结果免疫组化法检测结果表明,培养的细胞为脐血间质干细胞,在5-aza诱导作用下可向肌源性细胞定向分化,2、4、8周后在移植区域观察到带荧光的心肌纤维和细胞核,排列方向与残留心肌组织基本一致,荧光标记的肌纤维相互连接。经TUNEL法检测可见在脐血间质干细胞移植组和对照组心肌梗死区域均有凋亡的心肌细胞分布,但移植组凋亡细胞明显低于非移植组;HE染色有相似的阳性率,阳性细胞多具有凋亡的形态特征。结论脐血间质干细胞移植梗死心肌除能形成心肌再生外,尚能减少心肌梗死后梗死区域的心肌细胞凋亡,达到延缓心室重构的目的。应用TUNEL法检测心肌细胞凋亡有较强的实用性。