马链球菌兽疫亚种10株国内猪源分离株对小鼠免疫效力的评价

目的近年来马链球菌兽疫亚种引起的猪链球菌病在我国造成重大损失。为评价猪源兽疫亚种分离株的抗原变异,取国内10省市分离的10株猪源兽疫亚种分离株,分别制备灭活抗原,加入弗氏完全佐剂免疫12 w龄ICR小鼠,4 w后加入弗氏不完全佐剂进行再次免疫,再次免疫2 w后分别用5 LD50同源菌株和1.6×105CFU ATCC35246株攻击。结果表明,同源菌株攻击,免疫保护率均在90%以上;而以ATCC35246攻击的异源菌免疫小鼠,免疫保护率为80%-100%。可见我国不同地区的猪源马链球菌兽疫亚种分离株的抗原性差异不大,单一菌株制备的疫苗具有应用前景。     

检测SARS抗体的间接ELISA方法的建立

重症急性呼吸综合征（severe acute respiratory syndrome，SARS）是一种急性呼吸道传染病，临床表现为非典型肺炎。科学家对其致病和机体对其免疫的机制有不同的看法。这主要是由于SARS无特异性的临床表现，给临床诊断造成困难。因此确切的诊断只能依靠实验室手段。用于诊断的方法有多种，ELISA诊断方法具有快速简便、灵敏性高、特异性强等优点，是进行SARS诊断和免疫监测的重要工具。因此建立简单、安全、可靠的SARS实验室诊断方法具有重要的实用意义。本文以表达的S1蛋白为抗原建立了的问接ELISA法，用于检测血清SARS病毒IgG抗体。实验表明应用表达的蛋白作为诊断SARS抗原具有特异性高、抗原易纯化和成本低等特点。     

牛源无乳链球菌菌毛岛屿AP2蛋白抗原优势区的原核表达及其间接ELISA检测方法的建立北大核心CSCD

目的构建牛源无乳链球菌AP2蛋白原核表达质粒,表达AP2蛋白,并以此为包被抗原建立检测无乳链球菌抗体的ELISA方法。方法取pMD18-T-AP2和pET-30a(+)分别进双酶切,酶切片段连接后转染BL21(DE3)细胞,进行AP2的诱导表达及鉴定。以重组AP2为抗原建立检测无乳链球菌抗体的ELISA方法,并用无乳链球菌、化脓性链球菌、大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌感染兔血清进行检测。结果双酶切及PCR鉴定重组质粒构建正确。Western blot分析表明重组AP2蛋白具有反应原性,建立的间接ELISA抗原最佳包被浓度为25μg/ml,血清最佳稀释度为1∶160,酶标二抗最适稀释度为1∶70。抗体滴度检测显示重组AP2具有良好的免疫原性,3次免疫(56 d)的兔血清抗体滴度达1∶10 000。用该方法检测化脓性链球菌、大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌感染兔血清,均未出现交叉阳性反应。结论成功表达了重组无乳链球菌菌毛岛屿AP2蛋白,建立的间接ELISA方法稳定性高,特异性良好,可用于无乳链球菌感染检测。     

抗ALT抗体间接ELISA检测方法的建立

目的建立免疫小鼠体内抗人丙氨酸氨基转移酶(ALT)抗体的间接ELISA检测方法,以期作为融合后杂交瘤细胞株的筛选体系。方法利用人ALT为包被抗原,以1∶40 000稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG为二抗,采用棋盘滴定法确定抗原和对照血清(阴性、阳性)最佳工作浓度及ELISA封闭液的浓度建立ELISA体系。结果包被抗原和血清的适宜浓度或稀释度分别为1∶5 000和1∶1 000;用4%BSA封闭18 h~24 h效果最好。结论建立的ELISA方法稳定,简便易行,能准确检测免疫小鼠血清抗体的效价,并可用于抗ALT单克隆抗体杂交瘤细胞株的筛选。     

间接ELISA法对H pylori免疫牛初乳中抗体的检测

目的:建立间接ELISA法测定牛初乳中H pylori抗体的水平,并观察特异性抗体的产生规律．方法:本试验以H pylori全菌抗原免疫妊娠母牛,每头牛每次肌肉注射4×109CFU全菌抗原, 收集分娩后7 d内的初乳．以间接ELISA法检测其中H pylori抗体水平．结果:H pylori能有效地引起免疫应答,成年牛初乳中的抗体效价在分娩当天达到最大值 5．84,高于青年牛的3．51(P<0．05),随后迅速下降．对照奶牛仅在分娩当天检测到微弱阳性．结论:成年牛的对H pylori的免疫应答好于青年牛．     

马链球菌兽疫亚种中国株的类M蛋白基因抗原表位片段的克隆与表达

目的　构建马链球菌兽疫亚种 (Streptococcusequisubsp zooepidemicus)中国株的类M蛋白基因抗原表位片段的重组表达质粒 (pET -Szp) ,并检测表达产物的免疫反应性。 方法　根据GenBank登录的马链球菌兽疫亚种纽约分离株w6 0类M蛋白基因序列设计和合成引物 ,以该菌中国分离株ATCC35 2 4 6的基因组DNA为模板 ,扩增类M蛋白基因 5’端第 5 83～ 10 6 8bp片段 ,并按正确的阅读框架定向克隆到表达载体pET - 32a(+)中 ,将重组质粒转化大肠杆菌BL2 1株 ,用IPTG诱导表达 ,并通过SDS -PAGE和免疫印迹对表达蛋白进行初步分析。结果　扩增出 4 86bp的马链球菌兽疫亚种ATCC35 2 4 6的类M蛋白基因片段 ,该基因在大肠杆菌表达系统中经诱导 ,得到分子量为 5 0 0 0 0的表达产物 ,免疫印迹表明该产物具有特异的免疫反应性。结论　成功构建了表达马链球菌兽疫亚种中国株类M蛋白片段的重组表达质粒 ,并实现在大肠杆菌中表达 ,为重组类M蛋白亚单位疫苗的研制奠定了基础。     

间接ELISA法检测血清隐孢子虫抗体IgG及IgM的实验研究

目的　间接ELISA法检测小鼠隐孢子虫抗体诊断隐孢子虫病的敏感性和实用性。方法　经过方阵滴定检测确定最佳的酶标抗体的工作浓度和最佳的抗原包被量 ,进一步测定血清隐孢子虫抗体的光密度 ,并设立阴性对照组比较。结果　 10、5 0、10 0、5 0 0个卵囊剂量组和阴性对照组比较均具有显著性差异 (P <0 .0 5 ) ;将剂量对数与OD490 值作相关分析 ,IgG的相关系数r=0 .990 ,P <0 .0 5 ;IgM的相关系数r=0 .95 4 ,P <0 .0 5 ;各组剂量对数与OD490 作回归分析 ,呈线性关系 ,P <0 .0 5。结论　间接ELISA法检测血清隐孢子虫抗体具有较高的敏感性和特异性 ,适合常规的流行病学调查     

三种试验方法检测莱姆病抗体比较

本文采用IFA、ELISA、CF诊断技术,对分别采自云南、辽宁的271份林业工人血清进行莱姆病抗体检测,对其敏感性、特异性等指标进行比较。结果是IFA呈现(≥1:128)阳性41份;ELISA超过OD值X+3SD(OD≥0.83)56份;CF呈现(≥1:128)阳性38份。三种试验方法阳性率(％)之比为100.00:136.55:92.66。CF虽操作复杂,但选择性极强,相对低的敏感性有助于识别真正的莱姆病。     

旋毛虫海藻糖酶(TsTRE)蛋白的表达及其间接ELISA抗体检测方法的建立

目的 以原核表达的旋毛虫海藻糖酶(Trichinella spiralis trehalase, TsTRE)重组蛋白作为检测抗原,建立间接ELISA抗体检测方法。方法 本实验采用RT-PCR技术扩增TsTRE基因,将其与pCold I表达质粒连接并于E.coli BL21感受态细胞中表达。应用亲和柱层析技术获得纯化rTsTRE,分别利用间接免疫荧光技术和Western-blot技术定位TsTRE和检测rTsTRE的免疫反应原性。与此同时,以rTsTRE蛋白为包被抗原建立间接ELISA抗体检测方法,并对其抗原包被浓度和待测血清稀释度、抗原包被条件、封闭液种类和封闭条件、酶标二抗稀释度和孵育条件、TMB显色时间等进行优化。确定该方法的临界值及评估该方法的重复性、敏感性、特异性和临床检出率等性能。结果 免疫荧光结果显示,在肌幼虫的杆状体、尾部和表皮等部位含有大量的海藻糖酶;Western-blot结果显示,rTsTRE可结合感染旋毛虫42 d小鼠的阳性血清且蛋白分子量约为60 kDa。建立的间接ELISA抗体检测方法的阳性临界值为0.384;批内和批间变异系数分别在5.504%～7.630...     

两种抗原基质快速间接免疫荧光法检测抗核抗体的临床应用和评价

间接免疫荧光法 (ＩＦＡ)是检测抗核抗体 (ＡＮＡ)的标准方法 ,该方法采用的抗原基质有多种 ,包括动物肝、肾组织冰冻切片和人工培养的组织细胞等。据文献 [1,2 ]报道 ,进行ＡＮＡ检测时 ,采用的抗原基质不同 ,检测结果存在较大差异。其中一些用培养的组织细胞如人喉癌上皮细胞 (Ｈｅｐ 2 )能检测到ＡＮＡ的血清 ,如用肝、肾等冰冻组织切片检测则ＡＮＡ为阴性。相反 ,有一小部分血清即使ＡＮＡ滴度高也不能用Ｈｅｐ 2细胞检出 ,却能用肝组织或其他器官的组织切片检测。为了避免单独采用一种基质检测的缺点 ,我们采用德国欧蒙实验免疫制品有…     

2种检测人肾综合征出血热IgG抗体ELISA试剂盒的比较

目的 探讨国产与进口人肾综合征出血热(hemorrhagic fever with renal syndrome, HFRS)IgG抗体ELISA检测试剂盒的性能差异. 方法 采用国产和进口ELISA试剂盒分别检测50例HFRS疫苗接种者血清样本中抗人HFRS IgG抗体含量,分析比较2种ELISA试剂盒的一致性、灵敏性、精密度以及方法学等的差异. 结果 2种ELISA试剂盒的精密度良好,批内变异系数均<5%;2种试剂阳性一致率为100%,阴性一致率为20%,相似率为60%;灵敏性检测结果显示,2种ELISA试剂盒的灵敏性差异较大(P<0.05),国产ELISA试剂盒的灵敏度约是进口ELISA试剂盒的5倍. 结论 国产人HFRS IgG抗体ELISA检测试剂盒灵敏性好,进口ELISA试剂盒特异性好,国产和进口ELISA试剂盒的精密度均良好,在实际应用中应根据具体情况合理选用.     

三种ELISA试剂盒检测猪流行性乙型脑炎病毒血清IgG抗体比较

目的 比较国内常用商品化ELISA试剂盒检测猪流行性乙型脑炎病毒血清IgG抗体的诊断效果。方法 选用3种猪乙脑病毒血清IgG抗体ELISA检测试剂盒(Keqian,Lvshiyuan,Tianchen),以微量中和试验为金标准,对90份猪血清进行检测分析。结果 中和试验的阳性检出率为34.4%(31/90),Keqian,Lvshiyuan和Tianchen阳性检出率分别为50.0%(45/90), 47.8%(43/90)和 38.9%(35/90)。灵敏度最高的是Keqian,为90.32%,但其特异度只有71.19%;Tianchen的灵敏度和特异度分别为83.87%和79.66%;Lvshiyuan的灵敏度和特异度分别仅为41.94%和16.95%。与中和试验比较,Tianchen试剂盒的κ系数最高为0.63,其次是Keqian为0.57,Lvshiyuan仅为0.04。显示3种试剂盒具稳定性。结论 目前国内商品化猪乙脑病毒血清IgG抗体ELISA检测试剂盒诊断结果差异较大,与中和试验相比存在较高的假阴性,质量有待提高。     

间接免疫荧光试验在西尼罗病毒抗体检测中的初步应用

目的了解人群血清西尼罗病毒(WNV)抗体存在的本底,探讨WNV与乙型脑炎病毒(JEV)的免疫交叉反应。方法以新兵入伍健康体检时收集的男性血清347份为检测标本,应用建立的间接免疫荧光试验(IFA)对WNV与JEV的IgG抗体进行检测。结果血清WNV和JEV的抗体阳性率分别为3.2%(11/347)和5.7%(14/244);在同时检测了两种病毒抗体的244份标本中,有3份两者均为阳性,分别占WNV和JEV抗体阳性数的60%(3/5)和21%(3/14)。结论人群对WNV缺乏免疫力,JEV抗体对WNV的交叉免疫作用有一定的局限性。     

家养野猪源EMCV VP1基因的原核表达及其间接ELISA方法的建立和应用

目的以原核表达的脑心肌炎病毒(EMCV)VP1蛋白作为检测抗原,建立间接ELISA方法用来检测EMCV抗体。方法应用原核表达载体pET-28a构建家养野猪源EMCV VP1基因的重组表达质粒,并在感受态细胞BL21中表达,将该重组蛋白纯化后作为包被抗原,建立间接ELISA标准化检测程序,并应用于临床检测。结果经双酶切、PCR和测序鉴定,重组质粒pET-28a-VP1构建成功,转化后诱导表达,经SDS-PAGE电泳分析得到高效表达的VP1蛋白,该重组蛋白可被EMCV阳性血清特异性识别,具有良好的反应原性;通过优化反应条件,确定抗原浓度为1.25 ug/mL、待检血清以1∶80倍稀释为最佳抗原包被浓度和待检血清最佳稀释度,5%脱脂乳作为封闭液,待检血清的最佳作用时间为37 ℃作用60 min,酶标抗体稀释度的最佳工作浓度和最佳作用时间分别为1∶8 000和37 ℃ 30 min,底物最佳显色时间为20 min,特异性强,敏感性较高,重复性良好;应用该间接ELISA方法分别检测河南省126个猪场送检的1 618份血清和527份PCV-2抗体阳性血清,发现阳性场检出率为65.87%,血清总阳性率为45.30%,不同规模和不同阶段猪群均存在EMCV感染,中小型猪场的阳性率显著高于规模化猪场,EMCV与猪圆环病毒2型的混合感染率高达75.14%。结论应用原核表达的重组VP1蛋白作为包被抗原建立的间接ELISA方法可用于检测EMCV抗体水平,临床检测结果填补了河南省EMCV血清流行病学监测的空白。     

2型猪链球菌中国强毒株溶血素样蛋白基因的原核表达及其抗血清制备

目的克隆2型猪链球菌溶血素样蛋白(Hemolysin-like protein,HLP)编码基因并进行原核表达,纯化重组蛋白并制备相应的多克隆抗体。方法采用PCR法,从2型猪链球菌中国强毒株05ZYH33基因组扩增基因hlp,构建重组表达质粒pET32a::hlp,转化E.coliBL21(DE3),筛选阳性转化子进行IPTG诱导表达,SDS-PAGE鉴定表达产物;His亲和层析柱纯化重组蛋白;重组蛋白免疫新西兰兔制备多克隆抗体,间接ELISA和Western blot检测多抗血清。结果构建的重组质粒在宿主菌中可高效表达,His亲和层析柱纯化获得较高纯度的重组蛋白;重组蛋白免疫新西兰兔后获得高效价的抗血清。结论在原核系统中成功地表达了hlp基因编码的蛋白,并以重组蛋白为抗原制备出高效价的多抗血清,为进一步研究hlp基因的功能奠定了基础。     

2型猪链球菌表面蛋白Sao的生物信息学分析及基因工程疫苗的设计

目的利用生物信息学方法分析Sao蛋白结构并预测B细胞抗原表位,筛选可用于疫苗设计的序列。方法以Sao蛋白的氨基酸序列为基础,利用Protparam工具分析蛋白基本理化性质,TMHMM预测跨膜区,PredictProtein在线分析蛋白二级结构,SWISS-MODEL软件模拟三级空间构象,DNASTAR分析亲(疏)水性、可塑性和表面可及性,综合使用在线ABCPred和BepiPred工具预测B细胞抗原表位,筛选能用于构建基因工程疫苗的蛋白序列。结果 Sao蛋白羧基端存在7个高度一致的重复序列以及1个LPVTG保守膜锚定基序,二级结构组分中无规卷曲比例高达74.21%,三级空间构象模拟结果与二级结构预测一致。蛋白的亲水区域、可塑性区域、表面可及性区域比例分别为76.21%、64.06%和75.04%。Sao存在多个线性抗原表位,经筛选得到两个可用于疫苗设计的蛋白序列,BLAST显示这两个序列为猪链球菌所特有,存在于2型猪链球菌9种不同的分离菌株中,同时也存在于猪链球菌致病性血清型1、2、1/2、3、7、9、14型中。结论 Sao蛋白为不稳定蛋白,亲水性强,筛选得到的两个蛋白序列抗原性强且高度保守,为猪链球菌特有序列,能够用于基因工程疫苗的构建。     

新城疫病毒核蛋白单克隆抗体的制备及双抗体夹心ELISA的初步建立

目的制备新城疫病毒(NDV)核蛋白(NP)的单克隆抗体(单抗),并用于建立一种可定量检测NDV病毒含量的双抗体夹心酶联免疫吸附试验检测方法(NDV NP ELISA)。方法基于NDV病毒株F48E9获得NP基因,经原核表达方式制备出重组抗原rNP;免疫小鼠制备NDV NP特异性单抗;单抗经HRP标记和配对筛选,建立NDV NP ELISA,分析其特异性、灵敏度、精密度、准确度和检测线性,并分析本方法定量检测的NP含量与PFU病毒滴度的定量相关性。结果建立基于单抗3C10和4E7的NDV NP ELISA,其定量检测NDV rNP的最佳线性范围为0.015~0.250μg/ml(R2=0.9974),回收率在88.4%~106.01%,变异系数小于3.4%;该方法具有良好特异性;该方法定量检测NDV抗原含量与PFU病毒感染滴度有较好的相关性(R2=0.9209)。结论建立NDV NP ELISA,可准确定量检测NDV病毒中的NP抗原含量,为NDV病毒含量的测定提供一种可靠简便的分析方法。     

血清抗碳酸酐酶Ⅲ抗体ELISA检测方法的建立与初步应用

目的建立人血清抗碳酸酐酶（CA）Ⅲ抗体的ELISA检测方法,并对系统性红斑狼疮、皮肌炎、糖尿病肾病、高血压肾病患者和健康人群的血清抗CAⅢ抗体水平进行初步调查。方法使用抗CAⅢ抗体标准品、CAⅢ及相应酶标抗体建立血清抗CAⅢ抗体ELISA检测方法,验证试剂稳定性、标本保存稳定性,并进行精密度、灵敏度、回收率、抗干扰性等方法学评价;各项技术指标均合格后对系统性红斑狼疮、皮肌炎、糖尿病肾病和高血压肾病患者的血清进行抗CAⅢ抗体水平检测。结果成功建立ELISA检测人血清抗CAⅢ抗体的方法,其批内精密度为6.2%,批间精密度为8.2%,灵敏度为0.025,回收率为106%,且具有较好的抗干扰性、试剂稳定性和标本保存稳定性。系统性红斑狼疮和糖尿病肾病患者的血清抗CAⅢ抗体水平高于健康对照相（P〈0.05）,阳性率分别为43%和18%。皮肌炎和高血压肾病患者的血清抗CAⅢ抗体水平与健康对照组比较无统计学差异（P〉0.05）,且未出现阳性结果。结论使用现有市售试剂进行人血清抗CAⅢ抗体的ELISA检测是可行的,抗CAⅢ抗体可能参与了系统性红斑狼疮和糖尿病肾病的发生发展。