SETD4敲除对小鼠巨噬细胞功能及免疫细胞分化影响的初步研究

目的探讨SETD4(SET-domain containing protein 4)基因敲除对小鼠腹腔巨噬细胞(peritoneal macrophages,pMφ)分化成熟、功能的影响以及对小鼠外周血、脾脏免疫细胞分化,胸腺和脾脏发育的影响。方法 (1)利用流式细胞术检测腹腔灌洗液中pMφ表面CD31分子的表达情况;(2)用液相芯片技术检测和比较SETD4~(-/-)和SETD4~(+/+)小鼠pMφ在受到脂多糖(LPS)刺激后对细胞因子TNF-α、IL-6释放的影响,流式细胞术检测SETD4基因敲除对巨噬细胞吞噬细菌能力及Transwell检测对巨噬细胞迁移能力的影响;(3)流式细胞术分析和比较两组小鼠外周血及脾脏主要免疫细胞的数量及比例的差异;(4)HE染色对比两组小鼠胸腺和脾脏组织结构的差异。结果 (1)与SETD4~(+/+)小鼠相比,SETD4~(-/-)小鼠pMφ受到LPS刺激后TNF-α、IL-6的释放明显减少,但是两组小鼠pMφ的比例及分化成熟程度无明显差异;(2)吞噬细菌能力和迁移能力两组无明显差异;(3)两组小鼠外周血及脾脏主要免疫细胞的数量及比例无明显差异;(4)SETD4基因敲除对小鼠胸腺和脾脏的结构无明显影响。结论 (1)SETD4能促进炎性细胞因子TNF-α、IL-6的产生,但对pMφ的分化成熟及细菌吞噬、迁移能力无明显影响;(2)SETD4基因敲除对小鼠外周血及脾脏免疫细胞的分化没有明显影响,对胸腺和脾脏组织的发育无明显影响。     

胸腺基质淋巴细胞生成素对小鼠巨噬细胞抗原提呈功能及炎性分泌功能的影响

目的:研究胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)对小鼠巨噬细胞抗原提呈能力及炎性分泌功能的影响和可能作用机制。方法:分离野生型C57B小鼠及TSLPR基因敲除(TSLPR-/-)C57B小鼠腹腔巨噬细胞,给予TSLP进行刺激。采用流式细胞术检测巨噬细胞MHCⅡ、CD86的表达;采用实时定量PCR以及ELISA方法检测小鼠巨噬细胞内以及培养上清液炎症因子MCP-1、TNF-α和IL-10的表达。结果:与野生型对照组比较,野生型实验组小鼠巨噬细胞表面抗原提呈分子(MHCⅡ,CD86)表达明显升高,炎症因子MCP-1和TNF-α表达及分泌均增高,IL-10表达及分泌无明显变化;与TSLPR基因敲除对照组相比较,TSLPR基因敲除小鼠巨噬细胞经TSLP刺激后细胞表面抗原提呈分子(MHCⅡ,CD86)表达及炎症因子MCP-1、TNF-α和IL-10的表达及分泌均无明显变化;与野生型实验组相比较,TSLPR基因敲除可明显抑制TSLP诱导的小鼠巨噬细胞抗原提呈分子增加以及炎症因子表达。结论:TSLP可通过与TSLPR结合促进小鼠巨噬细胞活化,增加巨噬细胞抗原递呈能力,产生炎症因子,促使小鼠巨噬细胞向促炎巨噬细胞表型M1型转化。     

高原低氧环境对小鼠巨噬细胞杀伤活性及分泌IL-6、TNF-α的影响

目的:通过建立高原低氧环境的小鼠模型,研究低氧条件对机体固有免疫细胞巨噬细胞(M_φ)吞噬杀伤功能的影响。方法:分别将小鼠暴露于海拔4 200 m、2 200 m和400 m的不同环境30 d后:(1)流式细胞仪检测小鼠腹腔M_φ对FITC标记的金黄色葡萄球菌的吞噬能力;(2)双乙酰基二氯荧光素(DCFH-DA)荧光探针法检测M_φ的呼吸爆发功能;(3)ELISA法检测小鼠M_φ培养上清中NO稳定氧化代谢产物亚硝酸盐(NO_2~-)的水平;(4)ELISA法检测小鼠M_φ培养上清中的IL-6、TNF-α的释放水平。结果:低氧暴露30 d后,海拔4 200 m和2 200 m的低氧状态下,小鼠腹腔M_φ的吞噬能力、呼吸爆发水平、NO的释放水平明显低于平原对照组(P0.05),培养细胞上清中的IL-6、TNF-α的浓度明显升高(P0.05)。结论:低氧暴露30 d可降低M_φ的吞噬能力和氧依赖杀伤功能,升高IL-6、TNF-α的分泌水平,进而影响机体M_φ的固有免疫应答能力。     

敲除IgG受体FcγRIIB加重小鼠全身及脂肪组织炎性反应

目的探讨敲除IgG受体基因(FcγRIIB)在高脂饮食(HFD)诱导下,对小鼠全身及脂肪组织炎性反应以及脂肪组织脂代谢的影响。方法选取FcγRIIB+/+雄鼠和IgG受体FcγRIIB敲除(FcγRIIB-/-)雄鼠各10只,均给予HFD诱导,17周末处死小鼠,称取小鼠体质量,采集血和脂肪组织。用ELISA、流式细胞计量术和实时定量PCR检测炎性反应及脂代谢相关指标。结果 FcγRIIB-/-小鼠与FcγRIIB+/+小鼠相比,血清中炎性因子IL-6、TNF-α和IFN-γ水平明显升高(P0.05);脂肪组织巨噬细胞浸润显著增加(P0.05);M1型极化基因MCP-1、TNF-α增加(P0.05);M2型极化基因ARG和IL-10没有明显差异;体质量、脂肪细胞大小、脂代谢相关基因PPARG、CEBPα、FASn、HSL、ATGL、UCP-1和GLUT4的表达没有差异。结论 HFD诱导下,敲除IgG受体FcγRIIB加重小鼠全身及脂肪组织的炎性反应,但不影响脂肪组织的脂代谢以及体质量。     

髓样细胞特异性SETD4基因敲除小鼠的构建与鉴定

目的　利用FLP/FRT、Cre/Loxp重组酶系统构建并鉴定髓样细胞特异性SETD4基因敲除小鼠,为深入研究SETD4的生物学功能奠定基础。 方法　将引进的Setd4flox/+小鼠自交,筛选出子代基因型为Setd4flox/flox的小鼠;与FLP小鼠交配,得到Setd4fl/+/flp小鼠;然后分别与C57BL/6小鼠交配去除FLP酶,筛选出Setd4fl/+小鼠;与Lyz2-Cre小鼠交配,筛选出Setd4fl/+/Lyz2-Cre小鼠;将得到的Setd4fl/+和Setd4fl/+/Lyz2-Cre小鼠交配,筛选出Setd4-/-/Lyz2-Cre小鼠,即髓样细胞特异性SETD4基因敲除小鼠。利用PCR技术鉴定小鼠基因型;实时荧光定量PCR技术检测小鼠腹腔巨噬细胞及肝组织中SETD4 的mRNA表达水平验证敲除情况。 结果　髓样细胞特异性SETD4基因敲除小鼠腹腔巨噬细胞中SETD4 mRNA水平较野生型小鼠显著降低;而在肝组织中无显著差异。 结论　利用FLP/FRT、Cre/Loxp系统成功构建髓样细胞特异性SETD4基因敲除小鼠,为后续的功能学研究提供了动物模型。     

SETD4基因敲除小鼠的构建及鉴定

目的　构建并鉴定SETD4基因敲除小鼠,为研究SETD4的生物学功能提供动物模型。 方法　将引进的SETD4flox/+小鼠与EIIa-Cre小鼠进行杂交繁殖,得到基因型为SETD4+/-.EIIa-Cre的小鼠;再与C57BL/6小鼠杂交去除Cre酶,获得杂合子SETD4+/-小鼠;该小鼠自交获得纯合子SETD4-/-小鼠。通过PCR法鉴定子代小鼠的基因型;RT-PCR、荧光定量PCR方法鉴定纯合子的SETD4基因敲除小鼠SETD4 mRNA表达情况;HE染色观察小鼠肝、肺组织的形态学变化。 结果　PCR结果表明子代小鼠的基因型符合SETD4-/-;纯合子基因敲除小鼠SETD4 mRNA水平显著低于野生型小鼠;SETD4基因敲除小鼠肝、肺组织的形态学特征与野生型小鼠相比无明显差异。 结论　本研究基于Cre/loxp系统,成功构建并鉴定了SETD4基因敲除小鼠。     

注射用免疫核糖核酸Ⅱ的免疫调节及对顺铂的增效减毒作用

目的探讨注射用免疫核糖核酸Ⅱ(BP素)对顺铂(DDP)的增效减毒作用及对S180荷瘤小鼠的免疫调节作用。方法建立小鼠S180皮下移植瘤模型,随机分组,采用腹腔注射给药,连续给药10 d,通过白细胞(WBC)计数、骨髓有核细胞计数,取肿瘤、胸腺、脾脏称重,计算抑瘤率、胸腺指数、脾脏指数以及MTT法检测刀豆蛋白A(Con A)诱导的小鼠脾脏T淋巴细胞增殖,观察BP素对顺铂的增效减毒作用。通过ELISA法检测血清中的IL-1β、IL-6、TNF-α水平,通过腹腔巨噬细胞对鸡红细胞吞噬率的测定评价BP素对S180荷瘤小鼠的免疫调节作用。结果 BP素与DDP联合应用可显著提高DDP对S180荷瘤小鼠的抗肿瘤作用(P0.01),明显改善DDP化疗所致的脾脏指数下降,外周血WBC数、骨髓有核细胞数的减少及脾脏T淋巴细胞增殖抑制等毒副作用(P0.01或P0.05);单用BP素可显著降低荷瘤小鼠血清中的IL-1β、IL-6、TNF-α水平(P0.01或P0.05),提高腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞的吞噬率(P0.01)。结论 BP素对DDP具有增效减毒作用,并对S180荷瘤小鼠具有免疫调节作用。     

E3蛋白泛素连接酶WWP1调控TLR4介导的炎症性肠病炎性聚集中的作用

目的 探讨E3蛋白泛素连接酶WWP1调控TLR4介导的炎症性肠病炎性聚集中的作用及机制。方法 构建髓系细胞中特异性敲除E3蛋白泛素连接酶WWP1基因的小鼠，检测WPP1基因是否被敲除，随后进行分组，分为WWP敲除组(WWP1^+/+)和WWP未敲除组(WWP1^-/-)，两组小鼠再分别喂养菊聚糖硫酸钠(DSS)建立炎症性肠病模型(DSS组)和喂养生理盐水(无菌水组)，每组小鼠共10只，喂养7 d，每天检测小鼠结肠炎的临床症状，结束后处死小鼠，测量结肠长度，评估小鼠结肠炎损伤情况，Elisa检测小鼠结肠黏膜组织炎性因子IL-6、IL-10、TNF-α水平，采用RT-qPCR和Western blot检测TLR4表达水平。同时使用基因沉默方法敲除RAW 264.7细胞的WWP1基因，使用LPS刺激构建结肠炎症情况下的巨噬细胞环境，检测WWP1⁺组与WWP1^-组细胞中IL-6、IL-10、TNF-α和TLR4、WWP1表达水平。结果 WWP1^+/+组和RAW264.7细胞沉默组中WWP1...     

TLR4 基因敲除对小鼠内脏脂肪组织免疫细胞及脂肪因子的影响

目的:探讨TLR4 基因敲除对小鼠免疫细胞及脂肪因子的影响。方法:取20 周龄的雄性野生型C57BL/6 小鼠和TLR4-/ -小鼠的脾脏和附睾脂肪组织,分离细胞,用流式检测F4/80、CD11b、CD11c、CD3、CD4、CD8 分子的表达;qPCR 检测附睾脂肪组织内IL-6、HMGB1、TNF-α、脂联素和抵抗素的表达。结果:与野生型C57BL/6 小鼠相比,TLR4-/ - 小鼠脾脏和附睾脂肪组织中M1 型(F4/80+ CD11b+ CD11c+ )巨噬细胞比例上升(P<0.05),M2 型(F4/80+ CD11b+ CD11c- )巨噬细胞比例下降(P<0.05),这种趋势在附睾脂肪组织中表现更为显著。同时发现附睾脂肪组织中CD4+ T 细胞比例下降(P<0.05),CD8+ T细胞比例上升(P<0.05);IL-6、HMGB1、抵抗素表达升高(P<0.05);TNF-α和脂联素表达降低(P<0.05)。结论:TLR4 基因敲除可导致内脏脂肪组织脂肪因子和免疫细胞的紊乱。     

重组人钙调磷酸酶B亚基对免疫功能低下小鼠的影响

目的 探讨重组人钙调磷酸酶B亚基（rhCNB）对环磷酰胺诱导免疫功能低下小鼠体液免疫功能的影响。方法 将Balb/c小鼠随机分为阴性对照组、平行对照组、模型组、rhCNB治疗组。采用环磷酰胺（20 mg/kg）诱导小鼠免疫功能低下模型,治疗组及平行组给予rhCNB(20 mg/kg),阴性对照组和模型组给予等体积生理盐水。末次给药24 h后进行外周血常规、淋巴细胞亚群（CD4、CD8、CD19）及细胞因子IL-4、TNF-α、IL-6的检测;T细胞依赖性抗原抗体反应（TDAR）试验检测;计算胸腺及脾脏脏体比,观察脾脏、胸腺和胸骨组织病理学改变。结果 rhCNB可明显改善和提高免疫功能低下小鼠胸腺及脾脏脏体比,增加外周血白细胞（WBC）、血小板（PLT）、淋巴细胞（LYM）、中性粒细胞（NEU）含量,增加CD4/CD8比值及CD19亚群比例,提升抗体lgG及细胞因子TNF-α、IL-6的水平(P<0.05)。结论 rhCNB具有免疫调节作用,通过调节细胞因子水平,促进淋巴细胞分化增殖,改善机体体液免疫功能。     

SETD4对脂多糖诱导的AML12细胞IL-6转录的调控作用

目的　探讨SETD4（SET-domain containing protein 4）对脂多糖（LPS）诱导的AML12（小鼠肝脏细胞系）细胞IL-6的转录调控作用。 方法　构建SETD4表达质粒和IL-6 启动子荧光素酶报告基因质粒,共转染小鼠肝脏细胞系AML12,使用双荧光素酶报告基因技术检测LPS刺激后IL-6 启动子荧光素酶活性;单独转染SETD4表达质粒上调AML12细胞SETD4表达,检测LPS刺激后IL-6 mRNA水平变化。 结果　双酶切鉴定及核酸测序证实重组质粒pcDNA3.0/HA-SETD4、pGL3.0/IL-6 promoter的构建成功。pcDNA3.0/HA-SETD4与pGL3.0/IL-6 promoter共转染AML12细胞,LPS刺激后SETD4对IL-6 启动子荧光素酶活性没有影响;上调SETD4表达后,可以促进LPS诱导的IL-6 mRNA转录。 结论　成功构建SETD4真核表达质粒和IL-6启动子荧光素酶报告基因质粒;SETD4对LPS诱导的AML12细胞IL-6的转录发挥正调控作用。     

Reversible differentiation of pro- and anti-inflammatory macrophages

Macrophages (Mφ) represent dynamic cell populations that develop according to the nature of environmental signals. It has been demonstrated that human Mφ can be polarized in vitro into pro-inflammatory (Mφ1) and anti-inflammatory cells (Mφ2) by the lineage-determining factors GM-CSF and M-CSF, respectively. Here we show that polarized Mφ1 and Mφ2 are not an end stage of differentiation but are able to reversibly undergo functional re-differentiation into anti-inflammatory and pro-inflammatory Mφ. GM-CSF-driven Mφ1 exposed to M-CSF for an additional 6 days obtained a Mφ2-like phenotype, inhibited the production of pro-inflammatory cytokine IL-6 and TNF-α, and exhibited a reduced T cell stimulatory capacity. Vice versa, Mφ2 exposed to GM-CSF exhibited a Mφ1-like phenotype with significant lower production of anti-inflammatory cytokine IL-10 and a higher T cell stimulatory activity, and a decreased capacity for phagocytosis of early apoptotic cells. Our data suggest that polarized macrophages are flexible in modulating their immune functions upon environmental changes, i.e., steady-state versus inflammatory conditions. These observations are important for our understanding of the regulatory role of macrophages in tissue homeostasis and disease pathogenesis.     

Chemokine receptor CX3CR1 promotes dendritic cell development under steady-state conditions

Expression of CX3CR1 is an attribute of myeloid precursors committed to the monocyte/macrophage (Mφ)/DC lineages and is maintained during all stages of DC differentiation. Nevertheless, the exact role of this molecule during developmental progression of myeloid precursors towards the DC lineage remains elusive. To overcome potential compensatory mechanisms and issues of redundancy, we employed competitive adoptive transfer experiments to assess a possible function of CX3CR1 in DC and monocyte/Mφ differentiation in vivo. We show here that expression of CX3CR1 promotes the generation of DCs and monocytes/Mφ under steady-state conditions and during compensatory expansion after selective depletion of DCs, but not under inflammatory conditions evoked by sub-lethal irradiation. Direct administration of CX3CR1-deficient and CX3CR1-sufficient precursors into the spleen or the thymus resulted in a similar competitive advantage of WT over CX3CR1-deficient precursors as i.v. transfer, suggesting that CX3CR1-mediated survival rather than recruitment to lymphoid organs is critical for DC/Mφ differentiation. In conclusion, our data support the hypothesis that CX3CR1 promotes proper development of myeloid precursors into DCs and monocytes/Mφs under steady-state conditions, possibly by providing survival signals or mediating accessibility to organ-specific niches, rather than acting as a mediator of homing to the spleen or the thymus.     

Control of RSV-induced lung injury by alternatively activated macrophages is IL-4Rα-, TLR4-, and IFN-β-dependent

Severe respiratory syncytial virus (RSV)-induced bronchiolitis has been associated with a mixed “Th1” and “Th2” cytokine storm. We hypothesized that differentiation of “alternatively activated” macrophages (AA-Mφ) would mediate the resolution of RSV-induced lung injury. RSV induced interleukin (IL)-4 and IL-13 by murine lung and peritoneal macrophages, IL-4Rα/STAT6-dependent AA-Mφ differentiation, and significantly enhanced inflammation in the lungs of IL-4Rα^−/− mice. Adoptive transfer of wildtype macrophages to IL-4Rα^−/− mice restored RSV-inducible AA-Mφ phenotype and diminished lung pathology. RSV-infected Toll-like receptor (TLR)4^−/− and interferon (IFN)-β^−/− macrophages and mice also failed to express AA-Mφ markers, but exhibited sustained proinflammatory cytokine production (e.g., IL-12) in vitro and in vivo and epithelial damage in vivo. TLR4 signaling is required for peroxisome proliferator-activated receptorγ expression, a DNA-binding protein that induces AA-Mφ genes, whereas IFN-β regulates IL-4, IL-13, IL-4Rα, and IL-10 expression in response to RSV. RSV-infected cotton rats treated with a cyclooxygenase-2 inhibitor increased expression of lung AA-Mφ. These data suggest new treatment strategies for RSV that promote AA-Mφ differentiation.     

BMSCs移植通过T细胞免疫抑制缓解1型糖尿病小鼠发病实验研究

目的　探讨小鼠骨髓间充质干细胞（Bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs）移植缓解1型糖尿病小鼠（T1DM）发病及机制。 方法　BMSCs分离培养及鉴定;第3代培养的上清作为条件培养基,与2周龄NOD小鼠脾细胞共培养,FACS检测CD4+和CD8+T细胞增殖及活化;2周龄雌性NOD小鼠随机分为BMSCs组、PBS组、对照组,每组6只,对照组2周处死;BMSCs组和PBS组12周分别腹腔注射100 μl（2×107细胞）BMSCs或等体积PBS,监测小鼠血糖和体重至26周;HE、免疫组化、免疫荧光染色观察胰腺炎性细胞浸润;FACS检测CD4+和CD8+T细胞增殖及活化。 结果　成功分离培养BMSCs;BMSCs条件培养基抑制CD4+及CD8+T细胞的增殖及活化（P<0.05）;BMSCs组小鼠体重高于PBS组（P<0.05）,糖尿病发病率降低,炎性浸润减少（P<0.05）,脾脏CD4+和CD8+T细胞增殖及活化降低（P<0.05）。结论　BMSCs移植可能通过T细胞免疫抑制缓解T1DM小鼠发病。     

BMSCs移植通过T细胞免疫抑制缓解1型糖尿病小鼠发病实验研究

目的　探讨小鼠骨髓间充质干细胞（Bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs）移植缓解1型糖尿病小鼠（T1DM）发病及机制。 方法　BMSCs分离培养及鉴定;第3代培养的上清作为条件培养基,与2周龄NOD小鼠脾细胞共培养,FACS检测CD4+和CD8+T细胞增殖及活化;2周龄雌性NOD小鼠随机分为BMSCs组、PBS组、对照组,每组6只,对照组2周处死;BMSCs组和PBS组12周分别腹腔注射100 μl（2×107细胞）BMSCs或等体积PBS,监测小鼠血糖和体重至26周;HE、免疫组化、免疫荧光染色观察胰腺炎性细胞浸润;FACS检测CD4+和CD8+T细胞增殖及活化。 结果　成功分离培养BMSCs;BMSCs条件培养基抑制CD4+及CD8+T细胞的增殖及活化（P<0.05）;BMSCs组小鼠体重高于PBS组（P<0.05）,糖尿病发病率降低,炎性浸润减少（P<0.05）,脾脏CD4+和CD8+T细胞增殖及活化降低（P<0.05）。结论　BMSCs移植可能通过T细胞免疫抑制缓解T1DM小鼠发病。