双特异性磷酸酶2对胃癌细胞增殖凋亡的影响及机制研究

目的 探讨双特异性磷酸酶2（DUSP2）基因对胃癌细胞增殖和凋亡的影响及其可能的机制。方法 首先利用在线分析工具KM plotter 分析876例胃癌患者DUSP2表达高低对其总体生存率的影响,并在多种胃癌细胞株（MKN-45、SGC-7901、HGC-27、N-87）中检测DUSP2的表达。进一步构建DUSP2过表达慢病毒载体,包装病毒感染MKN-45细胞,筛选出DUSP2稳定过表达的胃癌细胞株,以空载慢病毒转染并筛选后的胃癌细胞为对照。采用MTS细胞增殖实验检测DUSP2上调表达对胃癌细胞增殖能力的影响;Annexin V-FITC/PI双染流式检测细胞凋亡变化;蛋白质印迹法（Western blot）检测DUSP2、细胞外调节蛋白激酶（ERK）、p-ERK（Thr202/Tyr204）、P38、p-P38等蛋白表达水平。结果 高表达DUSP2的胃癌患者较低表达者有明显的生存优势,并且DUSP2在多株胃癌细胞中呈低表达。Western blot结果显示DUSP2稳定过表达的胃癌细胞（实验组）中DUSP2表达较对照组明显上调,DUSP2稳定过表达的胃癌细胞株构建成功。MTS实验结果表明,实验组细胞活力较对照组明显下降。实验组细胞凋亡率明显高于对照组。Western blot结果表明,实验组细胞中p-ERK（Thr202/Tyr204）及p-P38表达较对照组显著下调。结论 上调DUSP2的表达可显著抑制胃癌细胞的增殖,并促进其凋亡,其机制与DUSP2抑制了ERK、P38的磷酸化水平有关。     

δ阿片受体激活对过氧化氢损伤的心肌细胞的保护作用

目的研究δ阿片受体激活剂D-丙(2)-D-亮-(5)-脑啡肽(DADLE)对过氧化氢(H2O2)损伤的心肌细胞的保护作用及其机制。方法分离乳大鼠心肌细胞,培养48h后分为正常对照、H2O2(200μmol.L-1)、H2O2+DADLE(1μmol.L-1)、H2O2+DADLE+纳曲吲哚(10μmol.L-1)和H2O2+DADLE+U0126(10nmol.L-1)组,继续培养48h。用[3H]TdR掺入法检测心肌细胞增殖反应,流式细胞仪检测心肌细胞凋亡百分率,乳酸脱氢酶(LDH)活性测定试剂盒测定培养上清LDH活性,硫代巴比妥酸显色法测定细胞内丙二醛(MDA)含量,黄嘌呤氧化酶法测定细胞内超氧化物歧化酶(SOD)活性,Western蛋白印迹法检测细胞外信号调节激酶磷酸化(p-ERK)水平。结果①与正常对照组比较,H2O2组心肌细胞[3H]TdR掺入值明显降低,细胞凋亡率升高;培养上清LDH活性和MDA含量明显增加,SOD活性和Ap-ERK/AERK的比值降低。②与H2O2组比较,DADLE可使心肌细胞[3H]TdR掺入值升高,细胞凋亡率下降;培养上清LDH活性和MDA含量降低,SOD活性和Ap-ERK/AERK的比值升高。③分别加入δ阿片受体拮抗剂纳曲吲哚和ERK拮抗剂U0126,DADLE对上述指标的逆转作用被抑制。结论δ阿片受体激活对H2O2损伤的心肌细胞具有保护作用,其机制可能与其增强心肌细胞的抗氧化功能及促进ERK磷酸化有关。     

作用于MAPK信号转导系统的抗肿瘤药物研究

丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)是细胞内重要的信号转导系统,可以调节细胞的生长、增殖、分化、凋亡、黏附、迁移等一系列过程,继而影响肿瘤的发生、侵袭、转移以及耐药,是可能的抗肿瘤药物靶点之一。近年来,已有大量以MAPK信号转导通路为靶寻找抗肿瘤药物的研究报道,涉及该系统的多个分子,如表皮生长因子受体、Ras、Raf、蛋白激酶C、谷胱甘肽转移酶等。     

p38MAPK信号转导通路与细胞凋亡研究进展

丝裂原活化蛋白激酶(mitogen2activated protein kinase,MAPK)级联是细胞内广泛存在的丝/苏氨酸蛋白激酶超家族,是将细胞质的信号传递至细胞核并引起细胞核发生变化的重要物质。目前在人类已鉴定了4条MAPK     

嗜铁蛋白对血管内皮细胞的损伤作用及葛根素的保护机制

目的探讨葛根素对嗜铁蛋白诱导EA.hy926型血管内皮细胞损伤的保护作用及机制。方法嗜铁蛋白以不同作用时间(0、24、48、72 h)及浓度(0、5、10、20μmol·L-1)刺激EA.hy926细胞,MTT法及流式细胞术分别测细胞增殖及凋亡,比色法测乳酸脱氢酶(LDH)活性、ELISA测高敏C反应蛋白(hs-CRP)及单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)水平,Western blot测p-p38 MAPK、t-p38 MAPK、Bax、Bcl-2蛋白表达,加入葛根素(10、50、100μmol·L-1)和p38 MAPK抑制剂SB203580(20μmol·L-1)检测葛根素的干预作用及机制。结果与空白组比较,10μmol·L-1嗜铁蛋白作用48 h可显著抑制EA.hy926细胞增殖,上调p-p38 MAPK及Bax蛋白表达促进细胞凋亡,诱导分泌hs-CRP及MCP-1,并增加LDH活性(P<0.05);50、100μmol·L-1葛根素均可显著减轻嗜铁蛋白诱导的EA.hy926细胞增殖抑制、下调p-p38 MAPK及Bax蛋白表达以抑制细胞凋亡、减少嗜铁蛋白诱导EA.hy926细胞分泌hs-CRP及MCP-1并降低LDH活性(均P<0.01),且较SB203580更为显著(均P<0.05)。结论嗜铁蛋白可诱导血管内皮细胞损伤,葛根素可抑制p38 MAPK通路减轻嗜铁蛋白诱导的血管内皮细胞损伤。     

拟胚体高密度培养促进小鼠胚胎干细胞向心肌细胞分化*

目的探讨拟胚体（EBs）培养密度对小鼠胚胎干细胞（ESCs）心肌细胞分化的影响。方法小鼠ESCs经过悬滴培养后形成EBs后,以高、低密度（120、60个EBs/60 mm组织培养皿）贴壁培养,免疫荧光检测心肌特异性蛋白肌钙蛋白T(TnT)的表达。在不同时间点计算不同密度组搏动EBs百分比;RT-PCR检测Nkx2.5、GATA4、β-MHC及ANF基因表达水平;Western-blot检测TnT及p38表达水平。结果通过悬滴培养法形成的EBs能够出现自发性搏动并且有TnT表达。高密度培养组与低密度培养组相比具有更高的搏动EBs百分比,Nkx2.5、GATA4、β-MHC和ANF基因高表达水平,以及TnT蛋白高表达水平（P＜0.05）。高密度培养组的p38活性更高,使用p38特异性阻断剂SB203580能够降低高密度组搏动EBs百分比和TnT蛋白表达水平。结论 EBs贴壁培养密度是影响ESCs向心肌细胞分化的一个重要因素,EBs高密度培养相比于低密度培养能够获得更大程度的心肌分化,且该现象可能是由p38信号通路所介导。     

噪声应激对大鼠脑脊液中P38MAPK的影响

目的观察不同噪声应激时程对大鼠脑脊液P38MAPK含量的影响,探讨脑脊液中物质变化及其与应激行为的关系。方法制作1、3、5、7、10、14d不同时程的噪声应激模型,记录应激行为,并与正常组对照,用Wastern法测定上述各组脑脊液中P38MAPK含量。结果脑脊液中P38MAPK含量先显著增多后逐渐减少;噪声组大鼠活动力先增加后下降,体重增长缓慢,行为指标中直立、爬行和修饰的指标均明显不同于对照组（P〈0.01）。结论强噪声持续暴露可引起运动功能及行为改变,且以逐渐抑制作用更为显著。     

抑制P38丝裂原活化蛋白激酶信号通路对急性重症胰腺炎大鼠大脑皮层诱导型一氧化氮合酶表达的影响

目的观察P38丝裂原活化蛋白激酶信号通路抑制剂SB203580对急性重症胰腺炎(SAP)大鼠大脑皮层诱导型一氧化氮合酶(iNOS)蛋白表达的影响。方法将45只SD大鼠按随机数字法分3组。模型组:将5%牛磺胆酸钠经胰胆管逆行注入胰腺制备;抑制剂组:造模后于大鼠尾静脉注射SB203580;对照组开腹后翻动胰腺数次立即缝合腹壁,尾静脉注射0.9%氯化钠注射液。造模成功后24h,检测血清淀粉酶;应用免疫组织化学、蛋白印迹法观察及检测各组神经元中iNOS和磷酸化P38表达的变化,并进行图像分析和统计学处理。结果模型组大鼠p-P38、iNOS阳性神经元显著增加及蛋白水平升高;给予注射SB203580后,抑制剂组较模型组均明显减轻(P<0.05)。结论 P38丝裂原活化蛋白激酶信号通路抑制剂SB203580具有调控SAP大鼠大脑皮层iNOS蛋白表达的作用,减轻神经元的变性丢失,对于SAP大鼠大脑起到保护作用     

PD98059对HL60细胞Ras-MEK1/2-ERK1/2信号转导影响的研究

目的探讨MEK1抑制剂PD98059对HL60细胞Ras-MEK1/2-ERK1/2信号转导以及细胞增殖的影响。方法四唑盐比色试验(MTT)法检测PD98059对HL60细胞增殖的抑制作用,流式细胞术观察PD98059对HL60细胞凋亡和G0/G1期阻滞的影响,半定量反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)测定PD98059对HL60细胞ERK2、p27、Skp2基因表达的影响,免疫组织化学SP法检测ERK2、p27、Skp2蛋白表达的改变情况。结果 PD98059能够抑制HL60细胞的生长,该抑制作用具有浓度及时间依赖性(P<0.05)。PD98059能够促进HL60细胞凋亡,该作用具有浓度及时间依赖性(P<0.05);PD98059作用HL60细胞48h,随着浓度的增加G0/G1期阻滞增强(P<0.05)。PD98059可使HL60细胞ERK2、Skp2的mRNA及蛋白表达量减少,p27的mR-NA及蛋白表达量增加(P<0.05)。结论 PD98059能够抑制HL60细胞的生长,诱导细胞发生G0/G1期阻滞,促进其凋亡,这可能是通过PD98059阻断Ras-MEK1/2-ERK1/2信号转导,影响了ERK2、Skp2、p27等的表达而实现的。     

血糖稳定对大鼠脑缺血后海马神经元凋亡的影响

目的探讨血糖稳定对大鼠脑缺血所致的神经元凋亡的影响。方法将正常SD大鼠随机分为4组,假手术组(CON),全脑缺血再灌注组(I/P),血糖水平波动组(BGF)和血糖水平稳定组(BGS),水迷宫观察动物空间分辨力,使用免疫印迹技术对比研究细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)的磷酸化,同时采用末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP原位切口末端标记方法观察神经细胞凋亡。结果大鼠全脑缺血再灌注后3h和5d时海马区磷酸化ERK1/2表达明显增加;胰岛素控制输注维持血糖变动水平在术前水平的±0.5mmol/L组时可进一步增加海马ERK1/2磷酸化;但血糖变动水平在±1.2mmol/L组ERK1/2磷酸化表达与缺血再灌注组没有明显差异。再灌注5d时大鼠水迷宫结果与脑组织凋亡一致,血糖水平稳定组脑组织凋亡较缺血组明显减轻,磷酸化ERK1/2的程度与脑组织凋亡结果相反。结论术中维持血糖稳定可能通过ERK1/2信号通路调节大鼠缺血性脑损伤所致的神经元凋亡。     

C-reactive protein stimulates RAGE expression in human coronary artery endothelial cells in vitro via ROS generation and ERK/NF-κB activation

Aim:

The receptor for advanced glycation end-products (RAGE) plays an important role in development of atherosclerosis, and C-reactive protein (CRP) has been found to stimulate its expression in endothelial cells. In this study we investigated how CRP regulated the expression of RAGE in human coronary artery endothelial cells (HCAECs).

Methods:

HCAECs were treated in vitro with CRP (50 μg/mL) in combination with a variety of inhibitors. ROS generation was determined by immunocytochemistry and flow cytometry. The RAGE expression and phosphorylation of relevant signaling proteins were measured using Western blot analyses.

Results:

CRP stimulated the expression of RAGE in the cells, accompanied by markedly increased ROS generation, phosphorylation of ERK1/2 and NF-κB p65, as well as translocation of NF-κB p65 to the nuclei. CRP also stimulated phosphorylation of JNK and p38 MAPK. Pretreatment of the cells with the ROS scavenger N-acetyl-L-cysteine, ERK inhibitor PD98059 or NF-κB inhibitor PDTC blocked CRP-stimulated RAGE expression, but pretreatment with the NADPH oxidase inhibitor DPI, JNK inhibitor SP600125 or p38 MAPK inhibitor SB203580 did not significantly alter CRP-stimulated RAGE expression.

Conclusion:

CRP stimulates RAGE expression in HCAECs in vitro via ROS generation and activation of the ERK/NF-κB signaling pathway.     

非诺贝特及罗格列酮对高糖培养肾小球系膜细胞p38MAPK信号通路调控影响

目的：探讨非诺贝特及罗格列酮对高糖培养大鼠肾小球系膜细胞（MC）p38丝裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）信号传导通路的影响。方法：大鼠系膜细胞分别培养在正常糖浓度（5．5mmol／L）、高糖浓度（25mmol／L）、25mmol／L葡萄糖＋非诺贝特（FB）100μmol／L及25mmol／L葡萄糖＋罗格列酮（RG）20μmol／L。ELISA法检测培养细胞上清液Ⅳ型胶原（Col-Ⅳ）、纤维连接蛋白（FN）;Phospho—ELISA法检测胞浆及胞核内p38MAPK和磷酸化p38MAPK（p-p38MAPK）蛋白的表达：以及RT-PCR法检测p38MAPK的mRNA的表达。结果：与正常对照组比较,高糖组MC合成基质蛋白Col-Ⅳ、FN增多;胞浆及胞核内P—p38MAPK的表达增加。非诺贝特及罗格列酮干预能使高糖培养系膜细胞合成Col-Ⅳ、FN显著减少,胞核内p-p38MAPK表达显著下调,但对胞浆内p-p38MAPK的表达则无显著影响。各组总p38MAPK蛋白水平及p38MAPK的mRNA表达则没有明显改变。结论：非诺贝特及罗格列酮能够显著下调高糖培养的Mc核内p38MAPK信号传导通路的活化,进而减少胞外基质合成。     

姜黄素对结核小鼠复发及p38丝裂原活化蛋白激酶信号通路的影响

目的 研究姜黄素对结核小鼠复发及p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)信号通路的影响.方法 将45只C57BL/6小鼠随机分为模型组(n=15)、实验组(n=15)和对照组(n=15),所有小鼠均尾静脉注射结核分枝杆菌H37RV(1×107 CFU·mL-1)0.1 mL.4周后,实验组腹腔注射异烟肼10 mg·...     

下调TMEM97对卵巢癌细胞SKOV3增殖、凋亡的影响及其相关机制探讨

目的　观察下调跨膜蛋白97（TMEM97）对卵巢癌细胞SKOV3增殖和凋亡的影响,并探讨其相关机制。方法　将卵巢癌细胞SKOV3分为转染组（si-TMEM97组）、阴性对照组（siNC组）和空白对照组（Control组）。采用实时荧光定量PCR（qPCR）及Western blot法分别在mRNA和蛋白表达水平评估转染siRNA-TMEM97后TMEM97的沉默效果;分别在转染后采用CCK-8法、PI染色法、Annexin V-FITC/PI染色法和流式细胞术检测下调TMEM97对细胞的增殖、细胞周期和细胞凋亡的影响,并检测B淋巴细胞瘤-2基因（Bcl-2）、Bcl-2相关X蛋白质（Bax）及P38丝裂原活化蛋白激酶（P38 MAPK）通路相关蛋白（P38/MAPK、p-P38/MAPK）的表达变化。结果　si-TMEM97组细胞的增殖能力相比Control组和siNC组降低,而早期凋亡率增高（均P＜0.01）。si-TMEM97组细胞Bcl-2的蛋白相对表达量较Control组和siNC组降低,而Bax、p-P38/MAPK的蛋白相对表达量较Control组和siNC组增高（均P＜0.05）。结论　下调TMEM97的表达使卵巢癌细胞SKOV3增殖减少,凋亡增加,这可能与调节凋亡相关蛋白Bcl-2/Bax表达及P38/MAPK信号通路的激活有关。     

CCl_4诱导的大鼠肝纤维化模型肝纤维化逆转与MAPK信号通路的研究

目的通过检测CCl4诱导肝纤维化大鼠逆转恢复各时期MAPK信号通路蛋白动态变化,研究其在肝纤维化恢复期可能的调控作用。方法采用CCl4皮下注射SD大鼠12周,复制肝纤维化模型,分别于注射12周,停药后2、4、6、8周取材。通过检测各组ALT、AST、Hyp、LN、PⅢNP的含量变化和肝脏病理组织切片Masson染色,加以验证。采用West-ern blot法检测各组肝组织中MAPK通路蛋白表达。结果 ALT、AST、Hyp、LN、PⅢNP等反映肝损伤和纤维化进程的指标在第12周最高,即模型组最高,并且随着肝纤维化逆转而含量逐渐降低,Masson染色结果与之一致,表明大鼠肝纤维化模型期与各恢复期模型建立完成。p-ERK1/2在模型组表达明显降低,与正常组相比差异有显著性(P<0.01),恢复4周表达明显升高,与模型组相比差异有显著性(P<0.01),以后逐渐降低。p-JNK1/2在模型组表达明显降低(P<0.01),恢复期逐渐升高(P<0.05)。p-p38在模型组表达明显升高(P<0.01),恢复期逐渐降低(P<0.05)。p-ERK/ERK与Hyp相关系数r=-0.46,P=0.003;p-JNK/JNK与Hyp相关系数r=-0.53,P=0.0004;p-p38/p38与Hyp相关系数r=0.81,P=0.0001。结论 MAPK信号通路中的ERK、JNK和p38信号通路在肝纤维化逆转中发挥重要作用。     

大黄酸对人肾小球系膜细胞功能的影响

目的探讨大黄酸防治糖尿病肾病的作用机制。方法用细胞培养、ELISA、明胶酶谱及免疫沉淀、Western blot等技术,研究了大黄酸对肾小球系膜细胞转化生长因子(TGFβ₁)、基质金属蛋白酶-2,-9(MMP-2和MMP-9)及p38活化丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)活性的作用。结果大黄酸可显著抑制肾小球系膜细胞的增殖,对抗高糖诱导肾小球系膜细胞TGFβ₁活性升高的作用;对高糖诱导肾小球系膜细胞MMP-2,MMP-9,pro-MMP-2及pro-MMP-9的活性增加无明显影响,但可明显对抗高糖引起的肾小球系膜细胞p38MAPK活性增加。结论大黄酸减少FN的分泌可能与其降低p38MAPK及TGFβ₁活性有关。     

Basis for dosing time-dependent change in the anti-tumor effect of imatinib in mice

Because a variety of receptor tyrosine kinases are involved in the mechanism of tumor progression, the development of a clinically useful tyrosine kinase inhibitor is expected as a therapeutic agent for the treatment of malignant cancers. Imatinib mesylate, known as Gleevec or STI-571, is a molecule that inhibits the function of various receptors with tyrosine kinase activity, such as Abl, the bcr-abl chimeric product, KIT, and platelet-derived growth factor (PDGF) receptors. In this study, we investigated the influence of dosing time on the ability of imatinib to inhibit tumor growth in mice. Tumor-bearing mice were housed under standardized light/dark cycle conditions (lights on at 07:00 h, off at 19:00 h) with food and water ad libitum. The growth of tumor cells implanted in mice was more severely inhibited by the administration of imatinib (50 mg/kg, i.p.) in the early light phase than when it was administered in the early dark phase. The dosing time-dependency of anti-tumor effects was parallel to that of imatinib-induced anti-angiogenic effect. The inhibitory effect of imatinib on tyrosine kinase activity of PDGF receptors, but not of KIT and Abl, varied according to its administration time. The dosing time-dependency of imatinib-induced inhibition of PDGF receptor activity was closely related to that of its anti-tumor effects. Our results suggest that the anti-tumor efficacy of imatinib is enhanced by administering the drug when PDGF receptor activity was increased. The potent therapeutic efficacy of the drug could be expected by optimizing the dosing schedule.     

Attenuating effects of dihydromyricetin on angiotensin II-induced rat cardiomyocyte hypertrophy related to antioxidative activity in a NO-dependent manner

Abstract

Context: Dihydromyricetin (DMY) displays a range of biological properties. However, whether DMY attenuates cardiomyocyte hypertrophy is unknown.

Objective: To investigate whether DMY had potential therapeutic value to protect against angiotensin II (Ang II)-induced cardiomyocyte hypertrophy.

Materials and methods: Neonatal rat cardiomyocytes were pretreated with DMY (0–320?μM) followed with Ang II (100?nM) stimulation for 24?h, and then degree of hypertrophy was evaluated by cell surface analysis. Levels of reactive oxygen species (ROS) were measured with 2′,7′-dichlorfluorescein-diacetate (DCFH-DA) fluorescent staining. Antioxidative activity was evaluated by malondialdehyde (MDA) level, superoxide dismutase (SOD) activity, and total antioxidant capacity (T-AOC). Cyclic guanosine monophosphate (cGMP) was determined with a radioimmunoassay.

Results: Pre-incubation with DMY (20, 40, 80, and 160?μM) for 8?h, 12?h, 24?h, or 48?h decreased cell surface areas. It down-regulated mRNA expression of atrial natriuretic factor (1.95- to 1.24-fold) and β-myosin heavy chains (3.51- to 2.32-fold), reduced levels of MDA as well as increased SOD activity and T-AOC. Expression of SOD and thioredoxin were enhanced by DMY, whereas p22^phox and phosphorylation of mitogen-activated protein kinases were inhibited. Content of cGMP (0.54- to 0.80-fold) and phosphorylation of endothelial nitric oxide synthase at serine 1177 (0.70- to 1.05-fold) were augmented by DMY. Moreover, attenuating effect of DMY on hypertrophy was abolished when NO production was inhibited by l-NAME.

Conclusion: Attenuating effects of DMY on Ang II-induced cardiomyocyte hypertrophy related to antioxidative activity in a NO-dependent manner.     

硫化氢在SB203580影响肝星状细胞增殖、凋亡中的作用

【摘要】目的 探讨H₂S 在 P38 丝裂原活化蛋白激酶（P38MAPK）阻断剂 SB203580 影响大鼠肝星状细胞（HSC）-T6增殖、凋亡中的作用及对Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白mRNA表达的影响。方法设对照组（HSC加含10%胎牛血清的DMEM培养液）、二甲基亚砜（DMSO）组（对照组基础上加DMSO）、NaHS组（对照组基础上加NaHS至最适浓度）、SB组（DMSO组基础上加SB203580至最适浓度）、SB+NaHS组。采用四甲基偶氮唑盐（MTT）法测定SB203580及H2S对HSC的增殖抑制率（IR）;Annexin V-FITC/PI双染法流式细胞术（FCM）检测HSC凋亡率;逆转录PCR法检测Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白mRNA的表达。结果SB组（7.64±2.46）、SB+NaHS组（12.71±2.73）细胞凋亡率高于对照组（1.70±0.88）,且SB+NaHS组高于SB组（均P＜0.05）;DMSO组（2.07±1.18）、NaHS组（2.56±1.23）与对照组差异无统计学意义。Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白mRNA在各组细胞中均表达,其中NaHS组表达高于对照组（P＜0.05）,且表达量最多,条带最亮、最宽,SB组与SB+NaHS组表达低于对照组和NaHS组（P＜0.05）,表达量较少,条带较暗。结论H₂S激活P38MAPK信号通路,且SB203580特异性阻断P38MAPK信号通路后,H2S刺激的HSC增殖受到抑制,凋亡得到促进。