旋毛虫肌幼虫虫体蛋白对小细胞肺癌H446细胞凋亡的影响

目的 探讨旋毛虫肌幼虫虫体蛋白对小细胞肺癌H446细胞凋亡的影响及其作用的可能机制。方法 将H446细胞与0.2 mg/mL、0.4 mg/mL、0.6 mg/mL、0.8 mg/mL、1.0 mg/mL、1.2 mg/mL虫体蛋白分别培养并设为实验组,不处理的H446细胞设为对照组,采用噻唑兰(MTT)比色法检测旋毛虫肌幼虫虫体蛋白对H446细胞增殖活性的抑制作用;采用流式细胞术(FCM)检测旋毛虫肌幼虫虫体蛋白诱导H446细胞株凋亡的情况;采用Real-timePCR及Western blot法检测细胞色素C(cytochrome C,Cyt-C)和凋亡蛋白酶活化因子(apoptotic protease activating factor 1,Apaf-1) mRNA及蛋白的表达。结果 MTT比色法结果表明虫体蛋白能够抑制H446细胞增殖活性;流式细胞术结果表明虫体蛋白作用于H446细胞24 h后,有明显的促凋亡作用;Real-timePCR及Western blot法结果显示,与阴性对照组相比,促凋亡基因Cyt-C和Apaf-1表达均上调。结论 旋毛虫肌幼虫虫体蛋白能够抑制H446细胞增殖活性,并诱导细胞凋亡,其作用可能与Cyt-C和Apaf-1表达上调有关。     

热疗联合旋毛虫肌幼虫排泄分泌蛋白对小细胞肺癌H446凋亡及S期阻滞的影响北大核心CSCD

目的观察热疗联合旋毛虫肌幼虫排泄分泌蛋白对小细胞肺癌H446凋亡及周期阻滞的影响。方法将对数生长期的H446细胞随机分为4组。对照组:H446细胞培养过程中不作任何处理;热处理组:将细胞消化后放置离心管中42℃水浴加热2 h;ESPs处理组:将提取的旋毛虫肌幼虫ESPs(0.30 mg/ml)与H446细胞共培养;热处理联合ESPs组:先经水浴处理后加入ESPs(0.30 mg/ml)与H446细胞共培养。采用流式细胞术(FCM)检测各组细胞凋亡率,分析细胞周期变化情况;采用Western blot法检测各组细胞凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、周期蛋白Cyclin D1、p27的表达情况。结果流式细胞术(FCM)检测显示,对照组细胞总凋亡率为11.39%,ESPs处理组细胞总凋亡率为15.94%,热处理组细胞总凋亡率为22.35%,热疗联合ESPs组细胞总凋亡率为29.32%。组间细胞凋亡率差异有统计学意义(P<0.01)。对照组S期细胞所占比例为27.01%, ESPs处理组S期细胞占39.83%,热处理组S期细胞占51.54%,热疗联合ESPs组S期细胞占51.83%。ESPs处理组、热处理组、热疗联合ESPs组S期细胞所占比例与对照组比较差异均有统计学意义(P<0.01)。Western blot检测热处理联合ESPs组与对照组比较Bax、Cyclin D1、p27蛋白表达上调,Bcl-2蛋白表达下调。结论热疗联合旋毛虫肌幼虫排泄分泌蛋白可诱导小细胞肺癌H446凋亡,存在S期细胞阻滞,可能与Bax、Cyclin D1、p27蛋白表达上调,Bcl-2蛋白表达下调有关。     

热疗联合旋毛虫肌幼虫排泄分泌蛋白对小细胞肺癌H446凋亡及S期阻滞的影响

目的观察热疗联合旋毛虫肌幼虫排泄分泌蛋白对小细胞肺癌H446凋亡及周期阻滞的影响。方法将对数生长期的H446细胞随机分为4组。对照组:H446细胞培养过程中不作任何处理;热处理组:将细胞消化后放置离心管中42℃水浴加热2 h;ESPs处理组:将提取的旋毛虫肌幼虫ESPs(0.30 mg/ml)与H446细胞共培养;热处理联合ESPs组:先经水浴处理后加入ESPs(0.30 mg/ml)与H446细胞共培养。采用流式细胞术(FCM)检测各组细胞凋亡率,分析细胞周期变化情况;采用Western blot法检测各组细胞凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、周期蛋白Cyclin D1、p27的表达情况。结果流式细胞术(FCM)检测显示,对照组细胞总凋亡率为11.39%,ESPs处理组细胞总凋亡率为15.94%,热处理组细胞总凋亡率为22.35%,热疗联合ESPs组细胞总凋亡率为29.32%。组间细胞凋亡率差异有统计学意义(P0.01)。对照组S期细胞所占比例为27.01%, ESPs处理组S期细胞占39.83%,热处理组S期细胞占51.54%,热疗联合ESPs组S期细胞占51.83%。ESPs处理组、热处理组、热疗联合ESPs组S期细胞所占比例与对照组比较差异均有统计学意义(P0.01)。Western blot检测热处理联合ESPs组与对照组比较Bax、Cyclin D1、p27蛋白表达上调,Bcl-2蛋白表达下调。结论热疗联合旋毛虫肌幼虫排泄分泌蛋白可诱导小细胞肺癌H446凋亡,存在S期细胞阻滞,可能与Bax、Cyclin D1、p27蛋白表达上调,Bcl-2蛋白表达下调有关。     

旋毛虫肌幼虫期外泌体的分离和小RNA鉴定

目的 分离纯化旋毛虫肌幼虫分泌的外泌体,并进行鉴定,为研究旋毛虫免疫逃逸机制提供新的线索。方法 采用超速离心法提取旋毛虫肌幼虫期外泌体,通过透射电子显微镜、纳米颗粒跟踪分析、免疫印记和小RNA测序对其进行鉴定。结果 旋毛虫肌幼虫期外泌体为有膜的泡状物,直径约80～200 nm,表达外泌体特异性标记蛋白CD63和Enolase,含1 266个已知的miRNA。结论 经形态、粒径及标记蛋白分析证实成功分离旋毛虫肌幼虫期外泌体,同时构建旋毛虫肌幼虫期外泌体的小RNA文库,鉴定出多种功能性小RNA,为深入研究旋毛虫肌幼虫期外泌体内小RNA分子的应用提供数据。     

质谱法分析旋毛虫肌幼虫排泄分泌蛋白的组分

目的分析旋毛虫(Trichinella spiralis)肌幼虫排泄分泌蛋白(excretory-secretory protein,ESP)的组分,寻找其抗肿瘤活性组分。方法收集纯净的旋毛虫脱囊肌幼虫,制备旋毛虫肌幼虫ESP。采用15%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离ESP,将分离获得的所有蛋白条带进行胰蛋白酶酶解,采用液质联用质谱法(LC-MS/MS)进行鉴定。利用Gene Ontology(GO)对已鉴定蛋白质进行细胞组分、分子功能和生物过程的富集分析。结果经SDS-PAGE电泳分离获得清晰的蛋白质条带,相对分子质量(Mr)为10 000~142 000。质谱分析共鉴定出162种蛋白质,其中63种为已明确鉴定的蛋白质,34种为假定蛋白质,65种为未鉴定的蛋白质。鉴定出6种与抗肿瘤相关的蛋白质,即原肌球蛋白、组蛋白H2A、剪切聚腺苷酸化特异因子亚基2、Kazal 4型丝氨酸蛋白酶抑制剂、犰狳极性蛋白和真核起始因子4A。GO富集分析显示,已鉴定的蛋白质具有54种不同的分子功能,参与细胞构成并参与382种生物过程。结论旋毛虫肌幼虫ESP组分复杂,有多种未鉴定的蛋白质,从已知的63种蛋白质中筛选出6种与抗肿瘤相关的蛋白质。     

旋毛虫肌幼虫排泄分泌蛋白对H446小细胞肺癌的抑制作用

目的研究旋毛虫肌幼虫排泄分泌蛋白对H446小细胞肺癌的抑制作用。方法试验随机分为3组。A组（实验组）：将提取的旋毛虫肌幼虫排泄分泌蛋白用无血清培养基稀释成浓度为0．075、0．15和0．3mg／ml,分别与H446细胞共培养;B组（标准对照）：将顺铂稀释成12．8、6．4、3．2、1．6、0．8、0．4和0．2μg／ml,分别与H446细胞共培养;C组（空白对照组）：H446细胞培养过程中不作任何处理。采用噻唑蓝比色法（MTT法）检测各组不同时间细胞抑制率;采用原位末端转移酶标记法（TUNEL法）观察细胞凋亡情况。结果MTT法检测各实验组细胞抑制率均随药物浓度的增高和作用时间的延长而升高,与空白对照组比较差异有统计学意义（P〈0．01）;TUNEL法检测A、B、C组细胞凋亡率分别为85％、43％和2％,差异有统计学意义（P〈0．01）;A组与B组比较差异有统计学意义（P〈0．01）。结论旋毛虫肌幼虫排泄分泌蛋白对H446细胞有抑制作用,可能是潜在的抗小细胞肺癌的生物制剂。     

结核潜伏感染诊断新型候选标志物的筛选及临床验证

目的 筛选及临床验证结核潜伏感染(LTBI)新型候选标志物,为研究LTBI诊断新方法提供科学基础。方法 选择2013年1月至2015年12月就诊于遵义医学院附属医院的活动性肺结核患者(ATB组)、LTBI者(LTBI组)及健康人群(H组)血清。小样本分别独立地与包含4262个结核分枝杆菌(MTB)重组蛋白的Mtbprot^TM芯片反应进行初筛,选择差异较为明显的蛋白质,定制成蛋白小芯片,进行较大样本验证,对有效数据进行归一化处理,根据单个蛋白的P值进行评价,进一步通过SPSS统计软件,优化出最优组合。结果 用Mtbprot^TM芯片,经32份血清(H组7份、LTBI组9份及ATB组16份)试验验证,初筛出前100个可能与LTBI相关蛋白质,用这些蛋白质制成小芯片,分别与204份血清(H组44份,LTBI组60份,ATB组100份)进行进一步验证试验,优选出8个蛋白标志物,分别为Rv1860、Rv2031c、Rv1441c、Rv0494、Rv3301c、Rv0351、Rv1821和Rv0280,其组合诊断LTBI的特异性及敏感性分别为90.9%和83.1%。结论 成功筛选鉴定出8个LTBI新型候选蛋白标志物,其组合应用在LTBI诊断和鉴别诊断上具有较大的潜在应用前景。     

旋毛虫5'-nucleotidase基因特征与克隆表达

目的 研究旋毛虫5'-nucleotidase基因的序列结构特征及其蛋白克隆表达。方法 从旋毛虫获得5'-nucleotidase基因的序列,利用生物信息学方法进行系统性分析,并进行原核表达。结果 旋毛虫5'-nucleotidase基因大小为1 653 bp,编码550个氨基酸,119个氨基酸残基组成,理论相对分子质量(Mr)为62 kD,分子式为C₂₈₀₀H₄₃₅₈N₇₄₂O₈₀₃S₂₃,等电点为6.13,属于稳定存在的亲水蛋白质。该蛋白含有21个氨基酸组成的信号肽,同时具有跨膜区域,此外还含有3个N-糖基化位点、2个O-糖基化位点、20个磷酸化位点、28个B细胞线性结合位点和13个T细胞结合位点。二级结构中,α-螺旋占43.27%(238个),伸展链占22.73%(125个),β-折叠占7.82%(43个),无规则卷曲占26.18%(144个)。SDS-PAGE显示,5'-nucleotidase基因在原核表达系统中呈可溶性形式表达,重组蛋白大小约为74 kD。结论 成功克隆了旋毛虫5'-nucleotidase基因,对其进行序列分析和原核表达,为进一步探究5'-nucleotidase蛋白在旋毛虫感染过程中的作用奠定基础。     

基于蛋白组学分析旋毛虫原肌球蛋白过表达对小细胞肺癌NCI-H446细胞蛋白组分的影响

目的 研究旋毛虫原肌球蛋白(tropomyosin, Tm)过表达对人小细胞肺癌(small cell lung cancer, SCLC) NCI-H446细胞蛋白组分的影响。方法 本研究通过串联质谱标记(Tandem mass tags, TMT)技术结合生物信息学分析旋毛虫Tm过表达对NCI-H446细胞蛋白组分的影响。比较旋毛虫Tm(Tm-pcDNA3.1)过表达和转染空载体(pcDNA3.1)48 h后NCI-H446细胞的蛋白组分，利用Uniprot数据库检索差异表达蛋白(Differentially expressed protein, DEPs)并对所得DEPs进行基因本体论(GO)富集分析。从STRING数据库获得DEPs相互作用数据，利用Cytoscape 3.9.0软件构建蛋白互作网络并筛选中心节点蛋白。通过Western blot对随机选取的中心节点蛋白NDRG1进行验证。结果 旋毛虫Tm转染NCI-H446细胞48 h后，筛选出DEPs 70个，其中34个上调，36个下调；GO功能富集分析显示，DEPs主要涉及转录后的调控、免疫应答的调节等生物学功能；分析蛋白...     

伪旋毛虫21 kDa蛋白的分子克隆和特性

伪旋毛虫(Trichinella pseudospiralis)是广泛寄生于脊椎动物骨骼肌细胞的旋毛虫形线虫属的一种。幼虫寄生时无包囊形成,且病理损害涉及到肌细胞的全长。幼虫的排泄、分泌物(ES)是引起肌细胞变性的原因之一。目前对伪旋毛虫幼虫ES的抗原成份了解尚少,为此作者用ES免疫血清从伪旋毛虫幼虫cDNA文库中筛选出一重组蛋白,并对其免疫学特性进行了鉴定。 收集伪旋毛虫幼虫的ES并制备幼虫的     

旋毛虫和伪旋毛虫肌幼虫时期排泄分泌产物iTRAQ法蛋白质组学分析

目的探究旋毛虫和伪旋毛虫肌幼虫时期排泄分泌产物(ESP)中的差异蛋白,分析两者免疫抑制差异的原因和参与包囊形成的潜在功能蛋白。方法收集旋毛虫和伪旋毛虫ESP,采用二喹啉甲酸检测法测定旋毛虫、伪旋毛虫ESP蛋白浓度,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测蛋白质量,对经过超滤管酶解法酶解后的ESP多肽段采用同位素相对定量和绝对定量标记技术(iTRAQ)标记,混合标记后的样品进行液相分离高pH反相色谱和液相串联质谱检测。检测完成后,搜索UniProt数据库中的旋毛虫(Trichinella spiralis)和伪旋毛虫(Trichinella pseiudospiralis)数据库,在可信蛋白(得分80以上)的基础上筛选同源蛋白,比较同源蛋白的差异表达情况。利用QuickGO对差异蛋白进行标准化描述。选取9个差异明显的重要蛋白进行实时荧光定量PCR验证,采用△△Ct法验证基因表达水平。采用SPSS 19.0软件进行统计学分析结果经iTRAQ标记鉴定出旋毛虫可信蛋白492个,伪旋毛虫535个,可用于定量分析的旋毛虫蛋白193个,伪旋毛虫蛋白164个。旋毛虫/伪旋毛虫同源比对结果显示,表达蛋白上调162个,下调31个。GO分析结果显示,分子功能主要富集在离子结合功能、肽酶活性、氧化还原酶活性和核酸酶活性,分别为45、18、12和8个。在生物过程中,涉及最多的是小分子代谢过程(15个),碳水化合物代谢过程(12个),生物合成过程(12个),DNA代谢过程过程(8个)。差异蛋白涉及的细胞组成成分主要为细胞质和含蛋白质的复合物。KECG分析显示,与硫胺素代谢,鞘糖脂生物合成,苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成相关的蛋白大部分上调。plancitoxin-1(E5SXW8)、胰蛋白酶(E5SPA7)、胱抑素(E5S387)、丝氨酸蛋白酶抑制剂(E5SJH4)、5’-核苷酸酶(E5S554)、烯醇酶(E5SQX1)、L-天冬酰胺酶(E5SBA6)蛋白表达和基因转录水平在旋毛虫肌幼虫时期均高于伪旋毛虫(P<0.05);热休克蛋白β-1 (E5RZQ6)、组蛋白H2B (E5S7K8)蛋白表达和基因表达水平在旋毛虫肌幼虫时期低于伪旋毛虫(P<0.05)。结论旋毛虫和伪旋毛虫肌幼虫时期ESP差异蛋白生物信息学分析提示丝氨酸蛋白酶、胱抑素、plancitoxin-1和14-3-3蛋白等可食能与包嚢形成和免疫调节相关。     

旋毛虫幼虫侵入小鼠肠上皮细胞后细胞蛋白变化的研究

目的观察旋毛虫幼虫侵入前后小鼠肠上皮细胞蛋白的变化，筛选幼虫侵入相关蛋白。方法将旋毛虫感染性幼虫接种至小鼠小肠上皮细胞（intestinal epithelial cells，IECs）单层，于37℃5％CO2条件下培养2h，提取细胞蛋白，进行SDS-PAGE与Western blot分析，并与正常IECs细胞蛋白比较。结果SDS-PAGE分析表明，IECs与感染性幼虫共孵育后的IECs蛋白带数为44条，与正常IECs对照组的相同；Western blot显示，正常IECs蛋白不能被旋毛虫感染鼠血清识别，与幼虫共孵育后的IECs蛋白有16个组分带能被旋毛虫感染鼠血清识别，分子质量单位分别为125、118、106、98、70、64、50、47、46、40、34、33、31、29、27、26ku。结论小鼠IECs与旋毛虫幼虫共培养可产生能被旋毛虫感染鼠血清识别的细胞蛋白，该组蛋白可能是旋毛虫侵入相关蛋白。     

多头带绦虫成虫和幼虫的iTRAQ蛋白质组学分析

目的 分析多头带绦虫成虫和幼虫样本中的差异蛋白定量结果,为筛选调节寄生虫发育和生长的特定蛋白奠定基础。方法 提取多头带绦虫成虫与脑多头蚴原头节蛋白质样本进行SDS-PAGE电泳分析后,采用同位素标记相对与绝对定量技术(iTRAQ)技术和液相串联质谱(LC-MS/MS)分析,当两种样品蛋白的差异倍数达到1.5倍以上,且经检验有统计学意义时,视为差异蛋白。结果 本研究共鉴定了684个蛋白,其中130个差异表达蛋白,相对于幼虫,成虫上调蛋白69个,分别为副肌球蛋白,果糖-1,6-二磷酸酶,钙结合蛋白,六钩蚴蛋白Tso22c,热休克蛋白70,8 kDa糖蛋白,肌球蛋白轻链,钙调蛋白等;成虫下调蛋白61个,分别是抗原cC1,钙蛋白酶,膜联蛋白B3,皮层蛋白,糖脂转移蛋白,微管相关蛋白,乳酸脱氢酶B,xpa-结合蛋白等。通过实时定量PCR验证了10个差异明显的蛋白。另外,差异蛋白路径注释中约30%的蛋白参与了代谢途径和次生代谢物的生物合成。结论 本研究为多头带绦虫发育、生活史及寄生虫-宿主的互作机制研究提供了基线资料。     

旋毛虫成囊前期幼虫抗原结构基因TspE1的克隆与表达

目的　克隆和表达旋毛虫河南地理株成囊前期幼虫编码 3 1kDa抗原的结构基因 (TspE1)。　 方法　大鼠感染旋毛虫后第 17天收集成囊前期幼虫 ,提取虫体的总RNA。通过RT PCR特异性扩增目的基因 ,构建重组质粒pUC18 Ts HN3 ,将重组质粒 pUC18 Ts HN3中的目的基因亚克隆入原核表达载体pGEMEX 1,构建重组子 pGEMEX 1 Ts HN3 ,经IPTG诱导 ,在E .coliJM 10 9(DE3 )中表达。对表达产物进行SDS PAGE分析和Westernblotting鉴定。　 结果　SDS PAGE显示目的基因在大肠杆菌中获得高效表达 ,重组蛋白的分子量为 3 1kDa ,以诱导 4h时表达量最多。薄层凝胶光密度扫描分析结果显示 ,表达的融合蛋白量约占细菌总蛋白的 2 6%。Westernblotting证实 ,融合蛋白条带能被感染旋毛虫的大鼠血清及旋毛虫病患者血清识别。　结论　旋毛虫河南地理株成囊前期幼虫抗原结构基因TspE1克隆和原核表达成功。     

Low levels of exogenous histone H1 in yeast cause cell death.

To elucidate the function of lysine-rich histone, yeast cells, which are believed to lack this histone, were transformed with an expression vector carrying the sea urchin histone H1 gene under control of an inducible promoter. Expression of full-length protein was tested by immunoblotting and the intracellular distribution was monitored by immunoelectron microscopy. Even low amounts of exogenous H1 led to dramatic changes in intracellular morphology and cell death. The cells that survived had lost either the plasmid or the ability to express the exogenous protein. Thus, even low amounts of canonical histone H1 are lethal to yeast cells.     

旋毛虫感染兔唾液中抗旋毛虫IgG抗体水平

将28只日本大耳兔随机分为实验组(20只)和对照组(8只),实验组用旋毛虫脱囊幼虫经口灌胃日本大耳兔(3000条/只),对照组不做任何处理。采集感染前和感染后1～6周兔唾液和血清以及对照组兔唾液和血清。建立旋毛虫肌肉幼虫排泄分泌抗原(MLESA)为诊断抗原的间接ELISA,测定兔唾液和血清中抗旋毛虫IgG抗体。结果显示,感染后1～6周,唾液阳性率分别为10%、15%、40%、65%、85%和95%;血清阳性率分别为35%、50%、80%、90%、100%和100%。感染后1～3周,唾液阳性率与血清阳性率差异有统计学意义(χ2=3.58、5.23、6.67,P0.05),感染后4～6周,两者差异无统计学差异(χ2=0.12、1.03、1.03,P0.05)。提示在血清标本采集困难的情况下,MLESA的间接ELISA法检测唾液中抗旋毛虫IgG抗体可作为旋毛虫病免疫诊断的辅助方法。     

阿苯达唑对小鼠旋毛虫囊包幼虫作用后的组织化学观察

目的：探讨阿苯达唑对小鼠旋毛虫囊包幼虫的作用机制。方法：应用形态学、组织学及组织化学方法观察阿苯达唑治疗后囊包幼虫的形态学、组织学及酶的活性变化。结果：阿苯达唑治疗组,囊包幼虫的结构明显破坏,虫体缩小与断裂,部分虫体被吸收,囊包内伴有炎细胞浸润。组织化学染色显示,治疗组虫体糖原减少, Ｒ Ｎ Ａ、 Ｓ Ｄ Ｈ、 Ａ Ｔ Ｐａｓｅ、 Ａ Ｃ Ｐ活性均低于对照组,而 Ｌ Ｄ Ｈ 活性高于对照组。结论：阿苯达唑对旋毛虫的生理功能有影响。     

白藜芦醇诱导小细胞肺癌H446细胞凋亡机制的研究

目的研究白藜芦醇对小细胞肺癌H446细胞增殖的抑制、凋亡诱导作用及作用特点,并探讨其可能的机制。 方法采用MTT法观察白藜芦醇对H446细胞的毒性以及细胞抑制率,筛选合适的药物作用浓度。通过不同浓度组及不同作用时间组观察白藜芦醇对H446细胞的毒性及细胞抑制率。采用流式细胞术检测不同浓度白藜芦醇及白藜芦醇不同作用时间对H446细胞的凋亡诱导作用、线粒体膜电位的变化以及细胞内ROS释放量的变化。 结果白藜芦醇对小细胞肺癌H446细胞增殖有明确的抑制作用,高浓度时可引起细胞死亡,随着药物剂量增加和作用时间的延长,抑制作用更强,具有剂量依赖和时间依赖的特点,差异有统计学意义(P<0.05)。白藜芦醇可诱导H446细胞凋亡、促进细胞内ROS的释放、使线粒体膜电位下降,随着药物剂量增加和作用时间延长,凋亡诱导作用更强、细胞内ROS释放量更多、线粒体膜电位下降速度更快,呈现剂量和时间依赖的特点,差异有统计学意义(P<0.05)。 结论白藜芦醇对小细胞肺癌H446细胞的增殖具有明确的抑制作用,其诱导小细胞肺癌H446的凋亡可能与线粒体功能障碍有关。