约氏疟原虫丝/苏氨酸磷酸酶6免疫血清对原虫有性阶段发育抑制作用的研究

为探讨约氏疟原虫丝/苏氨酸磷酸酶6(Plasmodium yoelii Protein Phosphatase 6, PyPP6)作为传播阻断疫苗候选抗原的可行性,采用PCR扩增PP6优势抗原表位并克隆入pET32a(+)载体,诱导PyPP6重组蛋白(rPyPP6)表达与纯化,免疫小鼠获取抗-PyPP6免疫血清(anti-PyPP6)。采用ELISA和Western Blot方法检测anti-PyPP6血清效价和特异性,IFA检测PyPP6蛋白在约氏疟原虫各期定位,体内外实验检测anti-PyPP6血清对雄配子出丝、动合子形成和卵囊发育的影响。结果显示,成功诱导rPyPP6表达,anti-PyPP6血清抗体滴度为1:128000,PyPP6部分定位于约氏疟原虫质膜。与对照组相比,anti-PyPP6免疫血清1∶5倍稀释可显著抑制61.5%配子体出丝,动合子数目和动合子转化率分别降低了75%和19.7%,卵囊形成数量减少了35%。结果表明,PyPP6重组蛋白具有良好的免疫原性和抗原性,抗-PP6免疫血清具有显著的传播阻断效果。     

约氏疟原虫Pys25、Pys21抗原的表达及其传播阻断免疫的研究

目的 :观察约氏疟原虫有性发育阶段虫体抗原Pys2 5、Pys2 1的表达及其单克隆抗体的传播阻断效应。方法 :分别用抗Pys2 5和抗Pys2 1单抗 (McAb4和McAb10 )被动免疫感染约氏疟原虫的小鼠 ,通过直接蚊喂养试验 ,观察抗Pys2 5McAb4和抗Pys2 1McAb10对疟原虫在蚊体内发育过程的影响 ;应用间接免疫荧光和Westernblotting试验 ,检测疟原虫有性发育阶段虫体抗原Pys2 5和Pys2 1表达的动态变化。结果 :与抗Pys2 1McAb10比较 ,抗Pys2 5McAb4具有更完全的传播阻断效应。Pys2 5和Pys2 1抗原蛋白存在于从配子体到动合子的整个发育过程中 ,但Pys2 5在合子表面的表达显著早于Pys2 1。结论 :约氏疟原虫Pys2 5和Pys2 1均是传播阻断免疫的靶抗原 ;抗Pys2 5McAb4具有更强的传播阻断活性与Pys2 5在合子表面的早期表达有关。     

伯氏疟原虫丝/苏氨酸磷酸酶5抗血清对有性阶段生长抑制作用的研究

目的:探讨伯氏疟原虫丝/苏氨酸磷酸酶5(PP5)作为传播阻断疫苗候选抗原的可行性。方法:PCR扩增PP5的功能区(407-711 aa),克隆入p ET32a(+)载体。IPTG诱导PP5重组蛋白表达后,纯化重组蛋白并免疫小鼠。ELISA方法检测抗PP5免疫血清效价。实验观察免疫血清对配子体出丝、动合子转化率和蚊胃内卵囊形成的影响。结果:成功表达PP5重组蛋白,抗PP5免疫血清抗体滴度可达1∶256 000,且对配子体出丝的抑制呈剂量依赖性,在1∶5和1∶10倍稀释时,配子体出丝数目分别减少75%和45%,与对照组相比差异具有显著统计学意义0. 05)。免疫血清可显著抑制动合子形成数目,在1∶5倍稀释时,动合子转化率减少14. 79%(P0. 05),蚊感染率和胃内卵囊密度分别减少26. 05%和74. 19%(P0. 05)。结论:PP5蛋白具有良好的免疫原性和抗原性。抗PP5免疫血清具有明显的传播阻断效果。     

伯氏疟原虫丝/ 苏氨酸磷酸酶6 抗血清对原虫有性阶段发育抑制作用的研究

目的:探讨伯氏疟原虫丝/苏氨酸磷酸酶6(PPP6)作为传播阻断疫苗候选抗原的可行性。方法:PCR扩增PPP6蛋白全长编码基因并克隆入p ET32a(+)载体。IPTG诱导PPP6重组蛋白的表达,纯化后皮下免疫小鼠,收集抗PPP6免疫血清。ELISA和Western blot检测抗PPP6免疫血清效价和特异性。实验观察免疫血清对配子体出丝、动合子和囊合子发育的影响。结果:成功诱导PPP6重组蛋白表达,抗PPP6免疫血清抗体效价为1∶3 200;与对照组相比,抗PPP6免疫血清可显著抑制配子体出丝(P0. 000 1);动合子数目和动合子转化率分别显著降低65. 3%和42. 07%(P0. 000 1);抗PPP6血清1∶5倍稀释时,囊合子形成数量减少68. 91%(P0. 000 1)。结论:PPP6蛋白具有良好的免疫原性和抗原性。抗PPP6免疫血清具有明显的传播阻断效果。     

C5a/C5aR通路对约氏疟原虫增殖和小鼠生存的影响

目的观察C5a/C5aR通路对约氏疟原虫17XL（P.y17XL）的增殖及其对BALB/c小鼠致死率的影响。结论将实验小鼠分为正常BALB/c组和C5aR-/-BALB/c组,每组5只,相同剂量的P.y17XL（2×105）分别感染正常BALB/c组小鼠和C5aR-/-BALB/c组小鼠,于感染后0、2、4和6d观察两组小鼠原虫血症和存活率的变化,并且采用ELISA检测感染P.y17XLBALB/c小鼠血清中C5a的水平。结果与正常组小鼠相比,C5aR-/-组小鼠生存期缩短,P.y17XL在C5aR-/-组小鼠的原虫血症较野生株小鼠高（P〈0.05）,而P.y17XL感染小鼠的血清中C5a含量低于未感染的小鼠。结论 C5a/C5aR能够抑制P.y17XL的增殖,并能延长感染小鼠的生存期。     

约氏疟原虫感染血清对疟原虫配子体感染力作用机制的研究

目的：探讨‘危机血清’介导疟原虫配子体对蛟感染力的作用机制。方法：通过间接免疫荧光实验和直接蚊血食实验,观察感染第5天小鼠血清（D5血清）对配子体感染力的影响。利用ELISA和Griess反应实验,检测D5血清对感染小鼠血清中IFN－γ、TNF－α、IL－4和脾细胞培养上清中NO2^-产生的影响。同时,检测了疟原虫寄生红细胞的提取物（PRBC提取物）诱导NO合成的能力。结果：感染等5天小鼠血液中的配子体向动合子的发育完全发生阻断。D5血清注入感染第3天的小鼠体内后未见立即抑制配子体在蚊体内的发育,但4h后,可促进宿主体内IFN－γ增多,提高NO的表达,并抑制配子体的感染力。并且,PRBC提取物诱导感染小鼠脾细胞NO的合成。结论：危机血清可能通过NO依赖的方式阻断约氏疟原虫媒介昆虫蚊的传播。     

胸腺素α原作为约氏疟原虫疫苗免疫佐剂的初步研究

目的:研究胸腺素α原(Prothymosinα,ProTα)作为约氏疟原虫疫苗免疫佐剂的作用。方法:提取P.yoelii-17XNL全蛋白作为抗原,用胸腺素α原作为免疫佐剂,免疫小鼠。具体方案为:昆明小鼠分为4组,每组6只,A组免疫P.yoelii-17XNL全蛋白+ProTα;B组免疫P.yoelii-17XNL全蛋白;C组只注射ProTα;D组为空白对照,以相同体积的生理盐水代替。免疫结束后感染致死的P.yoelii-17XL,1×107个虫/只小鼠。结果:感染后的前10天A组小鼠疟原虫血症平均值要低于其他三组,且最终有3只小鼠存活下来,存活率50%,C组有一只小鼠存活,B、D组小鼠全部死亡。结论:用P.yoelii-17XNL全蛋白做抗原,用ProTα作为佐剂,比单独用P.yoelii-17XNL全蛋白对小鼠有更好的免疫保护作用,提示了ProTα可以成为一种有潜力的蛋白疫苗。     

约氏疟原虫BY265株减毒子孢子诱导小鼠保护性免疫的研究

目的探讨约氏疟原虫BY265株减毒子孢子免疫能否诱导小鼠产生完全保护性免疫及其效应分子。方法确定减毒子孢子合适辐照剂量并免疫小鼠后,间接免疫荧光和ELISPOT分别检测抗环子孢子蛋白(CSP)抗体滴度和CSP特异的CD8+T细胞分泌IFN-γ及其抵御子孢子的攻击感染情况。结果免疫小鼠的外周血能检测到子孢子CSP特异的抗体(1∶400)和产生IFN-γ的CSP特异CD8+T细胞;与对照小鼠相比,1000个子孢子尾静脉注射攻击减毒子孢子免疫小鼠后,直到14d也检测不到红内期疟原虫。结论经辐照减毒子孢子免疫后的小鼠对野生株子孢子产生了完全保护性免疫,为红外期疫苗的研究提供基础与理论依据。     

疟原虫配子体蛋白Pys48核酸疫苗的构建与免疫活性观测

为探讨约氏疟原虫配子体蛋白Pys48核酸疫苗的免疫效果及其效应,以约氏疟原虫Pys48全基因序列克隆和真核表达载体pcDNA3．1为基础获得核酸重组质粒,肌肉注射免疫BALB／c小鼠,ELISA检测小鼠血清中特异性抗体水平,并通过IFA检测疫苗的免疫活性以及免疫血清对有性阶段虫体发育的阻断效应。测序结果和酶切鉴定均证实构建的质粒为Pys48全基因插入质粒。ELISA结果显示疫苗免疫小鼠血清特异性抗体滴度明显高于对照组;IFA结果显示免疫血清能够明显阻断配子体向合子与动合子的发育,并且其传播阻断效应与免疫血清呈剂量依赖性关系。实验表明,真核表达载体pcDNA3．1表达的Pys48核酸疫苗具有良好的免疫原性,其免疫血清可显著抑制有性阶段原虫的进一步发育。     

维生素E对约氏疟原虫感染BALB/c小鼠早期免疫应答的抑制效应

目的:探讨维生素E(Vitamin E,VE)对致死型约氏疟原虫(Plasmodium yoelii 17XL,P.y17XL)感染BALB/c小鼠的免疫调节效应。方法:6～8周、雌性BALB/c小鼠,随机分为实验组和对照组,经腹腔接种1×106P.y17XL寄生的红细胞,实验组于感染前10天口服给予VE预处理。动态观察两组小鼠的原虫血症水平;流式细胞术检测感染后第0、3和5天脾树突状细胞(Dendritic cells,DCs)亚群和Toll样受体9(Toll like receptor,TLR9)表达水平、以及巨噬细胞和活化T细胞的表达数量。结果:(1)与正常感染组相比较,补充VE加重感染小鼠的原虫血症水平,死亡率于感染后第6天达到70%,而正常感染组在感染后第6天死亡率只有30%;(2)与正常感染组相比,在每一检测点,VE处理组小鼠脾脏DCs亚群表达水平显著降低;同时,F4/80+巨噬细胞数量明显低于对照组,在感染后第5天,VE处理组小鼠脾脏T细胞活化水平显著降低。结论:在P.y17XL感染早期,VE预处理可通过抑制DCs的成熟和分化,从而加剧P.y17XL感染BALB/c小鼠的感染进程。     

约氏疟原虫可溶性抗原对鼠疟红内期保护性免疫调节作用的研究

用约氏疟原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍｙｏｅｌｉｙｏｅｌｉ，）可溶性抗原加佐剂免疫小鼠，观察原虫攻击后的保护作用及鼠脾细胞ＣｏｎＡ诱导的ＩＦＮ－γ分泌水平，并设佐剂对照组和空白组。结果显示：免疫组血原虫推迟出现，感染率明显低于其它两组（Ｐ＜００１）。感染时间明显缩短，佐剂对照组原虫率也低于空白组；且与空白组比较，免疫组和佐剂对照组ＩＦＮ－γ高峰出现早，说明ＩＦＮ－γ对抑制血中原虫起一定作用     

约氏疟原虫感染小鼠的巨噬细胞表面吞噬相关分子的研究

为探讨致死型约氏疟原虫(Plasmodium yoelii 17XL)感染抵抗型DBA/2小鼠的脾巨噬细胞发挥吞噬功能的作用机制,本试验利用Giemsa薄血膜染色,光学显微镜计数红细胞感染率,观察巨噬细胞的吞噬功能;采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测小鼠血清中抗P.y.17XL特异性IgG抗体水平;采用流式细胞技术(FACS)动态检测脾巨噬细胞表面膜分子CD36、CD64表达水平。结果表明,DBA/2小鼠红细胞感染率于感染后第7天高达31.87%,约第15天自愈;感染小鼠脾巨噬细胞吞噬能力于感染后第5天开始增强,至第10天吞噬率高达95%,随后维持于高水平;巨噬细胞表面分子CD36于感染后第3天开始升高,至第10天达到峰值;CD64表达水平于感染后第5天开始升高,随后持续维持于高水平;小鼠血清中抗P.y.17XL特异性IgG抗体水平在感染后第10天开始出现有意义的升高。结果显示,在P.y.17XL感染过程中,巨噬细胞通过表面分子CD36和CD64分别介导的非调理性和调理性吞噬方式杀伤疟原虫,提示巨噬细胞是DBA/2小鼠发挥抗疟保护性免疫的重要效应细胞。     

IL—6对约氏疟原虫子孢子入侵和红外期发育的影响

将１０４ｕＩＬ－６在子孢子接种前或后分别注入大鼠体内，观察比较子孢子发育率、红外期原虫直径。结果显示：子孢子接种前、子孢子接种后注入１０４ｕＩＬ－６及对照组的子孢子发育率分别为４．８３％、４．４５％、２．２２％，红外期原虫直径分别为２３．０５μｍ、２３．４１μｍ、２９．０９μｍ。表明ＩＬ－６对疟原虫子孢子发育率无明显影响，但可影响红外期的发育速度。     

对约氏疟原虫不同易感性的大劣按蚊和斯氏按蚊基因组RAPD序列比较

目的分析对约氏疟原虫不易感的大劣按蚊和易感的斯氏按蚊基因组RAPD谱带并测序，探讨媒介按蚊基因型与疟原虫基因型间的相互关系。方法用已筛选的一条随机引物，随机扩增大劣按蚊和斯氏按蚊成蚊的基因组DNA，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后，对相同迁移率的DNA条带克隆、测序，并采用相关在线程序及软件进行序列比较分析。结果大劣按蚊和斯氏按蚊RAPD谱带具有明显的种间差异，但有4对相同迁移率的条带。序列分析显示4对DNA条带在序列长度和组成上呈现多态性，序列的GC含量和简单重复序列存在差异，序列相似性介于48％～52％之间。结论大劣按蚊和斯氏按蚊之间存在不同的遗传背景，其基因多态性可能与产生对约氏疟原虫的易感性不同有关，为进一步研究按蚊与疟原虫之间的相互作用奠定了基础。     

疟疾传播阻断疫苗Pys25重组蛋白免疫活性的实验研究

为探讨约氏疟原虫传播阻断疫苗Pys25重组蛋白的免疫效果及其效应,我们以酵母菌表达的Pys25重组蛋白皮下免疫DBA/2小鼠,采用ELISA检测免疫后不同时间小鼠血清中的特异性抗体水平,并通过IFA观察免疫血清对有性阶段虫体发育的阻断效应。初次免疫后2周,小鼠血清中特异性IgG抗体水平开始升高,并于加强免疫后2周达到峰值;感染血液与免疫血清共同培养后,配子体向合子和动合子的发育明显受阻,并且其传播阻断效应与免疫血清呈剂量依赖性。实验表明,酵母菌表达的Pys25重组蛋白具有良好的免疫原性,其免疫血清可显著抑制有性阶段原虫的进一步发育。     

DBA/2小鼠感染不同疟原虫Th应答特点的比较研究

目的：探讨不同疟原虫感染DBA/2小鼠的免疫应答特点。方法：DBA/2小鼠经腹腔注射致死型约氏疟原虫（P.y17XL）和夏氏疟原虫（P.c AS）感染的红细胞,计数红细胞感染率;ELISA动态检测感染小鼠脾细胞培养上清中IFNγ-和IL-4水平;采用RT-PCR动态检测脾细胞中Th1和Th2型转录因子T-bet和GATA3 mRNA表达量。结果：两种疟原虫感染小鼠在感染早期T-bet mRNA表达量均明显增加,升高幅度明显高于GATA3,T-bet/GATA3比值明显高于感染前水平;IFNγ-明显升高后伴随IL-4分泌水平增加。但是,P.c AS感染小鼠IFNγ-水平明显高于P.y17XL感染小鼠,且随后的IL-4水平仅出现短暂升高,感染后前8天T-bet/GATA3比值未有明显下降趋势,原虫血症逐渐升高至小鼠全部死亡。相比,P.y17XL感染小鼠T-bet/GA-TA3比值在感染后第3天达峰值,随后缓慢下降但仍高于对照组,原虫血症得到控制至小鼠自愈。结论：抗疟保护性免疫不仅依赖于Th1和Th2型免疫应答的有效建立和协调过渡,而且Th1/Th2型免疫应答的发生时相和效应强度可能影响着疟疾感染的最终结局。     

CD4+CD25+调节性T细胞在约氏疟原虫感染早期作用机制的实验研究

目的探讨CD4^＋CD25^＋调节性T细胞在约氏疟原虫感染早期的免疫调节机制。方法用抗CTLA-4 mAb和抗CD25 mAb分别与约氏疟原虫感染早期的小鼠脾细胞共同培养后,以ELISA法检测其培养上清的IL-10、TGF-β1及IFN-γ的含量。结果与抗CTLA-4 mAb共同培养后,脾细胞上清中IL-10的水平明显降低,但TGF-β1和IFN-γ水平未出现有意义的变化;与抗-CD25 mAb共同培养后,IL-10、TGF-β1和IFN-γ水平均未出现有意义的变化,但IL-10水平有一定的降低趋势。结论约氏疟原虫感染早期,IL-10可能是介导CD4^＋CD25^＋调节性T细胞参与免疫调节的关键性细胞因子,CD4^＋CD25^＋调节性T细胞可能通过CTLA-4发挥免疫抑制作用。     

约氏疟原虫感染早期抵抗和易感小鼠Th1反应特点的实验研究

为探讨疟原虫感染早期抵抗和易感小鼠Th1反应特点,以约氏疟原虫腹腔感染DBA/2和BALB/c小鼠为材料,用ELISA试剂盒和Griess实验分别检测感染第3天小鼠脾细胞、悬浮细胞以及巨噬细胞培养上清液中IFN-γ和NO水平。结果表明以PRBC或LPS刺激后,DBA/2小鼠脾细胞上清液中IFN-γ和NO水平随培养时间的延长均有不同程度的提高,但BALB/c小鼠48h培养组的IFN-γ和NO水平仅比24h培养组略有升高。两种小鼠单纯悬浮细胞或巨噬细胞上清液中IFN-γ或NO水平均明显低于其脾细胞上清液中的水平。这表明,约氏疟原虫感染早期,抵抗宿主对特异性或非特异性因子刺激的应答能力明显强于易感宿主,在相同因子刺激下前者建立的Th1反应可进一步被强化;巨噬细胞分泌NO明显依赖于IFN-γ的诱导效应。     

约氏疟原虫保护性抗原对鼠疟红内期保护性免疫调节作用的研究──Ⅱ．53kD抗原细胞增殖反应及血清抗体与保护作用的关系

用约氏疟原虫（Ｐ．ｙ）裂殖子抗原免疫ＥＡＬＢ／ｃ小鼠，再用约氏疟原虫非致死株１０５ＰＲＢＣ／只攻击。免疫组小鼠血中原虫推迟出现，提早消失，原虫率明显低于未免疫小鼠和佐剂对照小鼠；佐剂对照组仅原虫高峰推迟出现，与易感小鼠无明显差异。抗原免疫小鼠脾脏Ｔ淋巴细胞对抗原特异性和非特异性增殖反应明显高于其它两组，原虫攻击后增殖反应普遍受到抑制，但免疫小鼠比其它两组恢复快，感染后１８天即恢复至正常水平。