OX40Ig修饰大鼠脂肪间充质干细胞的实验研究

目的构建含OX40融合蛋白(OX40Ig)基因修饰的大鼠脂肪间充质干细胞(ADSCs)即ADSCs^OX40Ig,探讨其在体外对淋巴细胞的免疫调节作用。方法构建pcDNA3.1(+)/OX40Ig融合基因表达载体,采用核转染技术转染大鼠ADSCs,Western blot检测ADSCs中OX40Ig表达水平。ADSCs与大鼠异基因淋巴细胞共培养后分为对照组(反应细胞+刺激细胞)、ADSCs组(反应细胞+刺激细胞+ADSCs)及ADSCs^OX40Ig组(反应细胞+刺激细胞+ADSCs^OX40Ig),MTT法检测淋巴细胞增殖抑制率,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测淋巴细胞内干扰素(IFN)-γ、白细胞介素(IL)-10及转化生长因子(TGF)-βmRNA表达。结果经测序鉴定验证,pcDNA3.1(+)/OX40Ig质粒构建成功,转染ADSCs后OX40Ig蛋白呈高表达;与ADSCs组比较,ADSCs^OX40Ig显著增强异基因淋巴细胞增殖抑制率(P<0.05);对照组、ADSCs组及ADSCs<...     

miRNA-1真核表达载体的构建及转染骨髓间充质干细胞绿色荧光蛋白的表达

目的 构建大鼠miRNA-1真核表达载体,为研究miRNA-1功能提供实验基础.方法 应用技术体外合成miRNA-1前体对应的基因组片段,定向克隆到pSD11-U6/Neo/绿色荧光蛋白载体上.阳性克隆进行及DNA测序鉴定,将构建成功的重组质粒pSD11-U6/Neo/绿色荧光蛋白/miRNA-1借助脂质体转染大鼠骨髓间充质干细胞,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达.结果 PCR鉴定及DNA测序表明真核表达载体pSD11-U6/Neo/绿色荧光蛋白/miRNA-1构建成功.转染大鼠骨髓间充质干细胞后,荧光显微镜下观察到绿色荧光蛋白表达.结论 大鼠miRNA-1真核表达载体构建成功.     

慢病毒载体介导apelin基因转染人脐带间充质干细胞的实验研究

【摘要】目的构建带有荧光标记基因增强型绿色荧光蛋白（EGFP）和apelin基因的重组质粒pUbi-apelinFLAG-pSV40-EGFP并进行慢病毒包装,探讨其转染人脐带间充质干细胞的最佳感染复数（MOI）值及目的基因表达情况。方法化学合成目的基因片段并扩增。采用In-Fusion技术将酶切后的目的基因片段与线性质粒载体连接,转化入感受态DH5α细胞中后筛选阳性克隆并进行测序。重组质粒慢病毒载体转染293T细胞,包装慢病毒并测定滴度。将重组质粒慢病毒按不同MOI值转染人脐带间充质干细胞,根据转染效率得到最佳MOI值,并采用Real-timePCR及Western blot方法检测目的基因表达情况。结果通过PCR扩增获得酶切位点碱基修饰后的大小约284bp的目的基因片段,与慢病毒质粒载体连接后形成pUbi-apelin-FLAG-pSV40-EGFP重组质粒,测序结果与预期完全符合,并成功包装慢病毒颗粒。最佳MOI值为20,转染效率为（90.32±3.61）%。慢病毒载体能高效转染人脐带间充质干细胞且2周内持续稳定上调目的基因mRNA及蛋白的表达。结论重组质粒慢病毒载体pUbi-apelin-FLAGpSV40-EGFP可有效转染人脐带间充质干细胞,并可持续高表达apelin基因     

人脂肪间充质干细胞分离培养及其生物学特性的实验研究

目的探索人脂肪间充质干细胞（adipose tissue—derived mesenchymal stem cells,ADMSCs）分离培养的方法及体外扩增的条件,观察ADMSCs的生物学特性。方法以腹部手术患者皮下脂肪组织为材料,采用I型胶原酶消化法及贴壁法分离培养ADMSCs,在含10％胎牛血清的低糖DMEM培养基中贴壁培养,倒置显微镜观察,流式细胞仪检测细胞表面标记CD29、CD44、CD105、CD31、CD34、CD106的表达,透射电镜及扫描电镜下观察ADMSCs超微结构,流式细胞仪测定细胞周期。结果原代和传代细胞呈梭形外观,生长增殖能力良好。CD29、CD44、CD105均呈阳性表达,阳性率分别为95.3％、98．6％和86．5％;而CD31、CD34、CD106阳性率分别为3．5％、2．6％、1．3％。透射电镜观察显示ADMSCs表现出早期幼稚细胞形态的特点,流式细胞仪检测显示84．8％的细胞处于G0/G1期。结论酶消化法能有效地从人脂肪组织分离培养人ADSCs,细胞生长稳定,增殖能力活跃,为今后ADMSCs的分离培养提供了更简单有效的方法。     

慢病毒介导HO-1基因转染猪骨髓间充质干细胞的表达

目的探讨重组血红素氧合酶1(HO-1)基因体外转染猪骨髓间充质干细胞(MSCs)应用于基因治疗的可行性。方法体外分离、培养并鉴定MSCs。采用具有高效转染非分裂期细胞的慢病毒载体系统将HO-1基因导入MSCs中;采用RT-PCR和绿色荧光蛋白(GFP)荧光技术检测目的基因的表达,台盼蓝染色及MTT法检测转染后细胞的增殖能力。结果慢病毒感染MSCs的感染复数为20,最佳感染率可达80%;MSCs表面高表达CD44和CD105;GFP荧光表达自96h开始逐渐增强;转染细胞中显示目的基因mRNA的表达;转染对MSCs存活及增殖几乎无影响。结论慢病毒载体可成功转染猪MSCs,并使其HO-1表达增高,转染对MSCs存活及增殖基本无影响。     

脂肪间充质干细胞与HGF在胃溃疡治疗中的作用

消化性溃疡(peptic ulcer,PU)是全球性常见病,其高复发率仍是当前PU治疗中的一大难题.而脂肪间充质干细胞(adipose derived stem cell,ADSC)具有多向分化能力,以及分泌肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)等生长因子的特性.因此,利用ADSC移植治疗胃溃疡,或可增强胃溃疡患者的胃黏膜屏障,有望成为一种新颖的治疗手段.本文就PU的治疗现状、ADSC和HGF的生物学特性、ADSC和HGF的相关研究进展作一综述.     

基因修饰的脂肪间充质干细胞的研究进展

脂肪间充质干细胞（ADSCs）是来源于脂肪组织的具有多向分化潜能的细胞群,是细胞疗法的理想来源。基因修饰的脂肪间充质干细胞不仅具有ADSCs的全部特性,而且能够高效表达某些外源基因,加强其在疾病治疗中的疗效,为常规的临床治疗方法难以治愈的疾病带来了新的转机。本文就近年来的相关进展进行综述,以期为基因修饰的ADSCs在临床研究的应用上提供借鉴。     

脂肪间充质干细胞治疗脑瘫大鼠的作用机理研究

目的 探讨Notch信号通路在脂肪间充质干细胞治疗锥体束损伤所致脑瘫大鼠中的作用机理。方法 利用脑立体定位技术在大鼠锥体束注射乙醇构建脑瘫大鼠,通过尾静脉注射大鼠脂肪间充质干细胞,通过悬吊实验、旷场实验、姿势异常、肌张力、步态活动进行脑瘫行为学评估;取大鼠锥体束注射部位的脑组织做病理组织切片进行组织病理学分析,取锥体束注射部位脑组织进行荧光定量PCR检测Notch信号通路相关基因timp1、collagen1、hes1、hey1、jag1、notch1的表达。结果与模型组比,干细胞治疗组大鼠玻璃棒悬吊时间明显增长,差异显著;姿势异常、肌张力及步行姿态得到明显改善且差异显著;组织病理学分析证实脑瘫模型组大鼠脑组织纤维束增多,而脂肪间充质干细胞治疗组纤维束明显少;脂肪间充质干细胞治疗组神经细胞数量约为脑瘫模型组的2倍,大脑神经细胞再生非常明显,脑神经细胞形态及脑组织结构破坏较脑瘫组有所改善;与模型组比,干细胞治疗组jag1、timp1、collagen1和hes1基因表达水平显著降低,hey1基因表达水平明显升高。结论脂肪间充质干细胞能够通过调控Notch信号通路促进脑瘫大鼠脑神经修复,改...     

AKT1基因过表达骨髓间充质干细胞的建立

目的 使用慢病毒系统建立AKT1基因过表达的稳转骨髓间充质干细胞.方法 扩增AKT1 cDNA基因,并构建AKT1-cDNA表达载体,再结合穿梭质粒pCDH1-AKT1转染人胚肾293T细胞进行扩增后,使用慢病毒转染系统进行基因重组,并以其为载体转染猪的骨髓间充质干细胞,观察其荧光表达,采用Western blot和RT-PCR分别检测AKT1蛋白和mRNA表达水平.结果 双酶切鉴定和测序结果表明,所获取的cDNA为AKT1的蛋白质编码功能区基因.293T细胞和骨髓间充质干细胞的转染效率均达到90％以上.Western blot和RT-PCR结果表明,稳转细胞的AKT1蛋白和mRNA表达水平均明显高于原代细胞.结论 成功构建AKT1-cDNA表达载体;通过使用慢病毒系统,猪骨髓间充质干细胞能长期稳定过表达AKT1.     

促大鼠骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化的研究

目的探讨成年大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）的体外培养和向神经元样细胞分化的方法。方法通过梯度分离获得成年大鼠MSCs,在细胞因子和氧化剂作用下对其诱导分化为神经元样细胞,免疫细胞化学方法检测神经元特异性烯醇化酶（NSE）、神经丝蛋白（NF）、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）和神经巢蛋白（Nestin）的表达情况,流式细胞仪检测分析诱导率。结果BMSCs被转化神经元样细胞并表达Nestin。应用碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、叔丁基对羟基茴香醚（BHA）所获得的神经元样细胞诱导率高（49.7%）。结论bFGF、BHA能促进大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞。     

慢病毒介导抗菌肽PR-39基因在兔骨髓间充质干细胞中的表达及抗菌活性检测

目的 构建脯氨酸精氨酸抗菌肽(proline-arginine rich 39-amino acid peptide, PR-39)慢病毒载体,并转染兔骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells, BMSC),检测其在BMSC中的表达及抗菌活性。方法 PCR扩增目的克隆,并连接入慢病毒载体质粒pGC-FU中,与包装质粒pHelper1.0、pHelper2.0在脂质体2000介导下共转染293T细胞生产慢病毒颗粒,Real-Time PCR法检测其滴度;分离培养BMSC,BMSC转染PR-39慢病毒,荧光显微镜观察及流式细胞仪检测其转染效率,RT-PCR检测PR-39基因表达,并检测PR-39抗菌活性。结果 成功包装出滴度为2×109 TU/mL的PR-39慢病毒载体,并转染BMSC,转染72 h后可观察到细胞呈现绿色荧光,转染效率为74.09%,同时RT-PCR检测BMSC表达PR-39基因,其上清液对金黄色葡萄球菌有明显的抑制作用,抑菌率为98.43% (P<0.05)。结论     

Vanillin attenuates negative effects of ultraviolet A on the stemness of human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells

Ultraviolet A (UVA) irradiation induces various changes in cell biology. The objective of this study was to determine the effect of vanillin on UVA irradiation-induced damages in the stemness properties of human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells (hAMSCs). UVA-antagonizing mechanisms of vanillin were also examined. The results revealed that vanillin attenuated UVA-induced reduction of the proliferative potential and stemness of hAMSCs evidenced by increased proliferative activity in BrdU incorporation assay and upregulation of stemness-related genes (OCT4, NANOG and SOX2) in response to vanillin treatment. UVA-induced reduction in mRNA level of hypoxia-inducible factor (HIF)-1α was significantly recovered by vanillin. In addition, the antagonizing effect of vanillin on UVA was found to be mediated by reduced production of PGE₂ through inhibiting JNK and p38 MAPK. Taken together, these findings showed that vanillin could improve the reduced stemness of hAMSCs induced by UVA. The effect of vanillin is mediated by upregulating HIF-1α via inhibiting PGE₂-cAMP signaling. Therefore, vanillin might be used as an antagonizing agent to mitigate the effects of UVA.     

Notch1(NICD)过表达真核载体构建及对大鼠BMSCs增殖分化的影响

目的 构建Notch1(NICD)过表达真核载体,探讨其对大鼠骨髓间充质干细胞（bone mesenehymal stem cells,BMSCs）增殖分化的影响。方法 以大鼠BMSCs为研究对象,构建Notch1(NICD)过表达真核载体,将pEGFP-N1-NICD质粒转染BMSCs,实验分为空白对照CON组、空载体组和转染组,转染48h后观察细胞一般形态,Realtime PCR和Western blotting检测NSE、GFAP 和Notch1基因和蛋白表达,流式检测转染后细胞凋亡和细胞周期情况;MTT检测增殖情况。结果 经DNA测序结果,重组质粒pEGFP-N1-NICD编码序列与设计完全一致,转染48h后转染组和空载体组的BMSCs均可表达绿色荧光。转染组Notch1、GFAP基因相对表达量显著高于空载体组和CON组（P＜0.05）,Western blotting检测结果与之类似。转染48h后,转染组活细胞比率及早期凋亡率、晚期凋亡率与CON组和空载体组比较差异均具有统计学意义（P＜0.05）;空载体组与CON组晚期凋亡率比较差异具有统计学意义（P＜0.05）,转染组细胞处于G1/G0细胞比例显著高于CON组和空载体组（P＜0.01）,而处于S和G2/M期细胞比例显著低于CON组和空载体组（P＜0.01）,转染组增殖曲线值随时间逐渐低于CON组和空载体组,到第4d时显著低于CON组和空载体组（P＜0.05）。结论Notch1(NICD)过表达真核载体构建成功,高表达Notch1(NICD)基因可能在一定程度上诱导BMSCs凋亡、抑制其增殖,且表现诱导向神经胶质样细胞分化。     

TIMP-1-shRNA基因体外转染大鼠骨髓间充质干细胞的实验研究

目的 探讨联合应用RNA干扰与干细胞移植技术在肝纤维化治疗中的应用.方法 采用全骨髓贴壁培养法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs),并进行流式细胞学鉴定.按使用慢病毒包装系统建立沉默基质金属蛋白酶抑制剂-1 (TIMP-1)基因不同位点分为三组:BMSCs株SH1组(LV-3-TIMP-1-rat-246),SH2组(LV-3-TIMP-1-rat-142),SH3组(LV-3-TIMP-1-rat-373).同时设立转染空载体组(LV-3-shNC,D组).观察各组细胞转染前后形态和荧光的表达;抽提蛋白,应用Western blot技术检测TIMP-1蛋白的表达.结果 原代培养大鼠BMSCs呈梭形,传代后漩涡状生长.慢病毒转染BMSCs 7 d后,各组均可检测到荧光出现,转染前后细胞形态无改变.在3个实验组中,SH3组TIMP-1蛋白表达最低(P＜0.05).结论 应用慢病毒包装系统可以建立沉默TIMP-1基因的BMSCs株,为BMSCs联合RNA干扰技术治疗肝纤维化提供了实验基础.     

基因修饰间充质干细胞治疗肿瘤研究进展

间充质干细胞（MSCs）是来源于中胚层的成体干细胞,体内分布广泛,可从骨髓、脂肪、牙髓、脐带/胎盘等组织中分离获取,具有高度的可增殖和分化潜能,较低的免疫原性,同时具有向炎症损伤部位微环境的趋向性,在疾病治疗方面可作为基因药物的载体实现精准治疗。癌症被认为是永远无法愈合的伤口,其组织微环境在损伤与修复中呈无休止的动态变化,MSCs在其中扮演了重要角色。利用MSCs具有的向肿瘤组织中归巢及定位的特点,对其进行抗肿瘤药物的基因工程改造可能在癌症的治疗上是一种新的策略。概述MSCs在癌症发生发展中的作用以及基因修饰MSCs治疗癌症的研究进展,旨在为临床使用基因修饰MSCs治疗癌症提供策略和见解。     

VEGF基因转染间充质干细胞移植与单纯间充质干细胞移植对大鼠心肌梗死的疗效对比

目的探讨VEGF基因转染骨髓间充质干细胞与单纯骨髓间充质干细胞移植对大鼠心肌梗死的疗效。方法将SD大鼠建立心肌缺血模型,1周后随机取30只采用随机分组法分为3组,A组为联合移植组,B组为单纯干细胞移植组,C组为对照组,通过一系列检测,对比3组的疗效。结果 A组的疗效优于B组和C组,B组的疗效优于C组（P〈0.05）。结论 VEGF基因转染骨髓间充质干细胞移植比单纯骨髓间充质干细胞移植的综合疗效好。     

重组人红细胞生成素对骨髓间充质干细胞红细胞生成素受体的上调作用

目的研究重组人红细胞生成素(rhEpo)处理骨髓间充质干细胞(MSCs)后对Epo受体(EpoR)的影响。方法含rhEpo0,5及10kU.L-1的培养基培养MSCs24,48及72h后,MTT法检测细胞增殖;6d后,免疫荧光染色检测EpoR阳性的细胞百分率。rhEpo预处理24h,再缺氧处理48h,Hoechst染色,通过形态变化检测细胞凋亡率;rhEpo预处理6d,再缺氧处理48h,Western蛋白印迹法检测EpoR,磷酸化Janus激酶2(p-Jak2),磷酸化转导及转录活化蛋白(p-Stat5)及缺氧诱导因子-1a(Hif-1a)蛋白表达。结果MTT结果显示,rhEpo处理的MSCs增殖能力增强;免疫荧光结果显示,随rhEpo浓度的增加,EpoR阳性细胞数增加;对照组,rhEpo5及10kU.L-1组EpoR阳性细胞百分率分别为(8.3±4.2)%,(24.7±8.1)%和(30.8±10.5)%。rhEpo预处理能增强MSCs抗缺氧凋亡的能力,缺氧处理后,对照组、rhEpo5及10kU.L-1组细胞核固缩率分别为(42.2±8.7)%,(21.9±8.0)%和(20.1±7.9)%。Western蛋白印迹结果显示,rhEpo预处理及预处理后行低氧培养的MSCs,随rhEpo浓度的增加,EpoR及下游抗细胞凋亡蛋白p-Jak2,p-Stat5和Hif-1a蛋白表达增加。结论rhEpo可以促进MSCEpoR的表达,并增加EpoR下游抗细胞凋亡蛋白的表达。     

骨髓问充质干细胞移植对急性肺损伤大鼠的治疗作用

急性肺损伤（Au）是急性呼吸窘迫综合征的前期表现,严重时可发展为多器官功能障碍综合征,具有较高的发病率及病死率。目前对于ALI的治疗主要以机械通气和对症治疗为主,但病死率仍居高不下。随着干细胞研究的深入,骨髓问充质干细胞（BMSCs）对ALI的治疗作用被逐渐认可。在大量研究的基础上,本研究归纳了BMSCs通过增殖分化、抑制炎症反应、免疫调节等方面治疗ALI的机制与特点。