维生素D调控Wnt/β-catenin信号通路抑制乳腺癌干细胞活性

目的 探讨维生素D对乳腺癌干细胞活性的影响及其可能的作用机制。方法 采用MTT法检测不同浓度（1 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L和20 μmol/L）维生素D对乳腺癌SUM159细胞活力的影响,用无血清培养基悬浮培养富集乳腺癌干细胞CSCSUM159,分析维生素D对乳腺癌干细胞活性的影响。Western blot和Real-time qPCR 分别检测乳腺癌干细胞标志物CD133、CD44、Oct-4、Nanog以及Wnt/β-catenin信号通路相关分子p-GSK-3β、β-catenin、c-Myc和cyclin-D1的表达。结果 MTT法检测结果显示,1 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L和20 μmol/L维生素D均可显著抑制乳腺癌SUM159细胞的活力（P＜0.01）。无血清悬浮培养可有效富集乳腺癌干细胞CSCSUM159。维生素D可使乳腺癌干细胞CSCSUM159的成球数量减少,且细胞成球大小较对照组小。Western blot和Real-time qPCR检测结果显示,维生素D干预后,乳腺癌干细胞CSCSUM159中CD133、CD44和Nanog的蛋白表达下调,Wnt/β-catenin信号通路相关分子p-GSK-3β、β-catenin和c-Myc蛋白表达及β-catenin、c-Myc和cyclin-D1 mRNA表达亦下调（P＜0.05）。结论 维生素D可抑制乳腺癌干细胞活性,可能与其调控Wnt/β-catenin信号通路活性有关。     

小鼠乳腺癌4T1细胞中肿瘤干细胞样细胞的富集和鉴定

目的：无血清培养基(serum-free medium, SFM)悬浮培养小鼠乳腺癌细胞株4T1,富集并鉴定4T1细胞株中肿瘤干细胞样细胞。方法：通过含EGF、bFGF和B27等细胞因子的SFM培养富集4T1细胞中肿瘤干细胞样细胞,将其接种于含血清培养基（serum-supplemented medium, SSM),观察4T1肿瘤干细胞样细胞分化情况。应用细胞表面标志CD44+CD24-/low和Hoechst 33342染色法检测4T1细胞中肿瘤干细胞样细胞的比例,小鼠致瘤实验验证不同培养条件下4T1肿瘤干细胞样细胞的致瘤能力。结果：4T1细胞在SFM中能够存活、增殖,并形成细胞球,细胞球可连续传代,若重新接种于SSM中可贴壁分化。4T1细胞球中CD44+CD24-/low细胞比例为6.4%~68.9%,侧群 (side population,SP) 细胞比例为7.3%~61.2%,均显著高于SSM中培养的4T1细胞（P<0.05）;随着SFM中细胞球传代次数增加,CD44+CD24-/low细胞和SP细胞的比例逐渐升高。小鼠致瘤实验结果显示,富集了肿瘤干细胞的细胞球比常规培养4T1细胞的致瘤性更强。结论：乳腺癌4T1细胞可在含多种生长因子的SFM中悬浮生长并形成细胞球,4T1细胞中含有的乳腺癌干细胞样细胞可通过SFM培养法富集。     

化学修饰的siRNA对乳腺癌细胞VEGF基因表达抑制及凋亡的诱导作用

目的：体外水平探讨化学修饰的小干扰RNA（siRNA）介导的RNAi治疗乳腺癌的可行性。方法：选用阳离子脂质体Lipofectamine2000^TM作为转染试剂,将化学修饰的针对人VEGF基因的siRNA转染人类乳腺癌细胞株MCF-7。半定量RT—PCR和蛋白印迹试验分别检测转染前后细胞中VEGF、Bcl2和baxmRNA和蛋白水平表达的变化,Hoechst33258荧光染色分析细胞凋亡。结果：与未转染的正常细胞组相比,靶向VEGF基因的siRNA转染MCF-7后,细胞中VEGF及Bcl-2mRNA和蛋白表达水平显著降低,P〈0．01。bax基因的表达未发生明显变化,Bcl-2和bax比值下降。Hoechst33258荧光染色显示转染siRNA72h后细胞内可见凋亡小体。结论：化学修饰的siRNA介导的RNAi下调靶基因VEGF的表达,并对MCF-7细胞有明显的凋亡诱导作用。     

线粒体凋亡途径在TA2小鼠自发性乳腺癌中的作用

比较TA2小鼠正常乳腺、乳腺癌前病变和乳腺癌组织中细胞增殖和凋亡的情况,通过检测线粒体凋亡途径中Bcl-2、Bax、Caspase-3和Caspase-9在乳腺组织中的表达,初步确定线粒体凋亡途径在TA2小鼠自发乳腺癌中可能发挥的作用。方法:收集正常TA2成年雌鼠的乳腺组织（NC组）和TA2自发性乳腺癌癌前病变组织（SBC-b组）和乳腺癌组织（SBC-t组）,采用免疫组化方法检测各组乳腺上皮细胞中PCNA、Bcl-2、Bax、Caspase-3和Caspase-9的表达并计算增殖指数（PI）;采用TUNEL方法检测细胞凋亡并计算凋亡指数（AI）;采用Real-time PCR和Western blot方法检测组织中Bcl-2、Bax、Caspase-3和Caspase-9蛋白表达及mRNA相对表达水平。结果:免疫组化染色,Real-time PCR以及Western blot结果一致显示,SBC-b组Bcl-2,Bax,Caspase-3和Caspase-9表达均明显高于NC（P<0.01或P<0.05）;SBC-t组中除Bcl-2高于NC外,其余蛋白表达均明显低于NC（P<0.01）,但bcl-2,bax和Caspase-3 mRNA表达均显著高于NC（P<0.01）,Caspase-9 mRNA略高于NC,但无统计学意义（P>0.05）。结论:线粒体途径可能参与了TA2鼠自发性乳腺癌的发生,其通过刺激部分乳腺上皮细胞凋亡,破坏了TA2小鼠乳腺上皮细胞增殖和凋亡的平衡,以致乳腺癌发生。      

雌激素受体β1对乳腺癌MDA-MB-231细胞凋亡的影响

目的观察雌激素受体β1（ERβ1）被阻断后对Bax和Bcl-2表达的影响,探讨ERβ1在乳腺癌中的生物学作用机制。方法应用脂质体法,将针对人ERβl基因的siRNA转染人类乳腺癌细胞株MDA—MB-231。分别用Real time-PCR、Western Blot检测ERβ1被干扰前后细胞中ERβ1、Bcl-2、Bax等基因mRNA和蛋白表达水平的变化;通过细胞增殖曲线观察ERβ1基因被干扰后细胞增殖活性的变化;采用流式细胞仪分析细胞凋亡率的改变。计量资料的比较采用t检验或单因素方差分析。结果RNA干扰技术阻断乳腺癌MDA—MB-231细胞ERβ1基因的表达后,ERβ1 mRNA和蛋白水平显著下降（P〈0．05）,生长曲线显示细胞增殖能力明显增强（P〈0．05）;pSilencer—ERβ1转染组细胞的Bax基因mRNA及蛋白水平显著下降（P〈0．01）,Bcl-2基因的表达未发生变化,Bcl-2／Bax比值明显上升;pSilencer-ERβ1转染组细胞凋亡率较未转染组明显减少（t=6．22,P=0．00）。结论ERβ1可通过调控细胞凋亡相关基因Bax而促进细胞的凋亡,是ERβ1抑制细胞增殖的原因之一。     

贝母素乙通过调控PI3K/Akt信号通路诱导乳腺癌MCF-7细胞凋亡

目的：探究贝母素乙（Peiminine）对乳腺癌细胞MCF-7细胞凋亡的影响及其可能作用机制。方法：采用不同浓度贝母素乙或联合PI3K抑制剂LY294002干预MCF-7细胞,MTT法检测细胞增殖能力;Hoechst33258染色和Annexin V-FITC/PI流式细胞术检测细胞凋亡情况;JC-1染色法检测细胞线粒体膜电位变化;Western blotting检测细胞中PI3K(p110α)、Akt、p-Akt(ser473)、Bad、Bax、Bcl-2、cleaved-Caspase-3以及线粒体和胞浆中细胞色素C(Cyt C)等蛋白表达水平。结果：贝母素乙可呈时间-浓度依赖性抑制MCF-7细胞增殖,诱导细胞出现凋亡形态改变,促进细胞凋亡,并降低线粒体膜电位,上调细胞中Bad、Bax、cleaved-Caspase-3及胞浆中Cyt C蛋白表达水平,下调PI3K(p110α)、p-Akt、Bcl-2和线粒体中Cyt C蛋白表达水平,而Akt蛋白表达水平无显著变化。然而,联合LY294002干预可增强贝母素乙对MCF-7细胞凋亡的促进作用。结论：贝母素乙可诱导乳腺癌MCF-7细胞凋...     

上调SCD1对乳腺癌细胞增殖凋亡的影响及与其相关通路的调控机制

目的:探究上调硬脂酰辅酶A去饱和酶1（SCD1）对乳腺癌细胞增殖凋亡的影响及与其相关通路的调控机制。方法:将细胞分为三组,即对照组、阴性对照组和SCD1组。检测和比较每组的转染效率、细胞活力、增殖情况以及凋亡率。qPCR检测mRNA水平,Western blot检测蛋白表达水平。结果:SCD1组细胞的SCD1 mRNA和蛋白的表达水平显著高于对照组和阴性对照组。SCD1组的细胞活力和克隆形成数目显著高于对照组和阴性对照组。SCD1组的细胞凋亡率显著低于对照组和阴性对照组。转染SCD1后,细胞表达的Cyclin D1、PCNA和Bcl-2 mRNA水平显著升高,Caspase3、Bax mRNA水平显著降低。乳腺癌MCF-7细胞SCD1过表达后,Wnt、β-catenin mRNA和蛋白的表达水平均显著升高。结论:上调SCD1的水平可通过促进Wnt/β-catenin通路促进乳腺癌细胞的增殖并抑制其凋亡。     

下调FAM111B对乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响

目的:探讨下调FAM111B对乳腺癌细胞系MDA-MB-231和MCF7细胞增殖和凋亡的影响及其机制。方法:构建siR-FAM111B慢病毒载体,转染乳腺癌MDA-MB-231和MCF7细胞,qRT-PCR检查转染组与对照组FAM111B mRNA表达,Western blotting法检测各组细胞FAM111B蛋白表达。用CCK-8法检测细胞的增殖能力。流式细胞术检测Annexin-V/PI双染各组细胞的凋亡情况。Western blotting法检测凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2的表达。结果:siR-FAM111B成功转染MDA-MB-231和MCF7细胞,转染后应用qRT-PCR和Western blotting检测,结果显示,FAM111B mRNA与蛋白水平均下调。siR-FAM111B能抑制两种细胞的增殖。Annexin-V/PI双染结果显示,下调FAM111B诱导两种细胞凋亡。Western blotting结果显示,下调FAM111B可以促进两种细胞Bax的表达,抑制Bcl-2的表达。结论:下调FAM111B能够抑制乳腺癌细胞的增殖,通过调节线粒体凋亡通路诱导细胞凋亡。     

盐霉素通过靶向调控ALDH影响三阴性乳腺癌细胞MDA-MB- 231增殖和凋亡

目的 探讨盐霉素（salinomycin,Sal）对三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖和凋亡的影响及其作用机制。方法 采用流式细胞术筛选ALDH高表达乳腺癌细胞系;采用MTT法检测不同浓度Sal（1~32 μmol/L）对细胞增殖的影响;采用流式细胞仪检测Sal对细胞凋亡以及肿瘤干细胞表面标志物ALDH表达的影响;采用qRT-PCR、Western blot检测凋亡相关分子Caspase-3、Bax、Bcl-2、PARP mRNA和蛋白表达;TCGA（the Cancer Genome Atlas）数据库下载乳腺癌患者数据集（n=1 218）,采用Pearson法分析ALDH与凋亡相关分子表达的相关性。结果 Sal在24 h、48 h、72 h均可以剂量依赖的方式抑制MDA-MB-231细胞增殖（均P<0.001）;Sal作用MDA-MB-231细胞48 h后,与对照组比较,2 μmol/L组、4 μmol/L组、8 μmol/L组的细胞凋亡率均升高（均P<0.05）;Bcl-2、PARP、Caspase-3 mRNA表达下降（均P<0.05）,Bax mRNA表达升高（均P<0.05）;Bcl-2、Caspase-3 蛋白表达下降（均P<0.05）,PARP、Bax 蛋白表达升高（均P<0.05）;MDA-MB-231乳腺癌干细胞表面标志物ALDH表达下降（均P<0.05）。TCGA数据库分析显示,ALDH与抗凋亡分子Bcl-2、Caspase-3的表达呈正相关（r=0.209,P=0.007;r=0.235,P=0.002）,与Bax、PARP的表达呈负相关（r=-0.326,P＜0.001;r=-0.453,P＜0.001）。结论 Sal可抑制人乳腺癌MDA-MB-231细胞生长,可能通过下调肿瘤干细胞表面标志物ALDH表达实现。     

桔梗皂苷D对人移行细胞癌5637细胞株的诱导凋亡作用及其分子机制

目的 探讨桔梗皂苷D对人移行细胞癌5637细胞诱导凋亡作用及分子机制。方法 HE染色和透射电子显微镜观察细胞的形态学变化;流式细胞学技术检测细胞凋亡率的变化;Western blot法检测凋亡通路相关蛋白的表达变化;PCR法检测p53、Bcl-2、Bax mRNA表达;免疫组织化学法检测凋亡相关蛋白表达的影响。结果 通过HE染色和电子显微镜观察桔梗皂苷D组5637细胞,可见凋亡细胞,凋亡指数明显高于对照组（P<0.01）;与对照组细胞相比,桔梗皂苷D组5637细胞Survivin、Livin表达量明显下降（P<0.05）;Caspase-9、Caspase-8、Caspase-3、Cyt-c表达量与对照组比较,明显增加（P<0.05）;p53、Bax mRNA水平明显升高,Bcl-2 mRNA表达下降（P<0.01）; Bax、Caspase-9、Caspase-8以及Caspase-3表达较对照组增多,而Bcl-2表达则明显下降（P<0.01）。结论 桔梗皂苷D能诱导人移行细胞癌5637细胞凋亡,其作用机制可能与上调Caspase-9、Caspase-8、Caspase-3、Cyt-c、p53和下调Bcl-2表达、激活线粒体途径和死亡受体途径有关。     

BC200在乳腺癌细胞系中的表达及其作用

目的:探究长链非编码RNA BC200在不同侵袭力的人乳腺上皮细胞中的差异性表达，阐明BC200对人乳腺癌细胞迁移、增殖、侵袭及凋亡的生物学行为的影响。方法:通过实时定量PCR方法检测BC200在不同乳腺癌细胞系中的表达，通过慢病毒转染下调、过表达BC200，比较各组细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡能力的变化。结果:BC200在MDA-MB-453细胞中表达最高，在BT549细胞中表达最低。转染过表达BC200慢病毒的BT549细胞的增殖、迁移、侵袭能力高于对照组，细胞凋亡低于对照组；转染下调BC200慢病毒的MDA-MB-453细胞的增殖、迁移、侵袭能力低于对照组，细胞凋亡高于对照组。结论:BC200在乳腺癌细胞中呈异常过表达。过表达BC200的乳腺癌细胞增殖、迁移、侵袭能力均增强并抑制凋亡，提示BC200在乳腺癌的发生发展中可发挥重要的促进作用。     

乳腺癌干细胞富集与鉴定的初步研究

目的:通过从MCF-7、ZR-75-1、MDA-MB-231乳腺癌细胞系中培养富集及鉴定乳腺癌干细胞(breast cancer stem cell,BCSC),寻找培养与富集乳腺癌干细胞的方法。方法:贴壁培养MCF-7、ZR-75-1、MDA-MB-231细胞系,倒置显微镜观察各细胞形态;流式细胞仪分别分选收集CD44-CD24-、CD44-CD24+、CD44+CD24-及 CD44+CD24+ 细胞,其中CD44+CD24-为乳腺癌干细胞,其余三类为对照组;MTT法计数细胞,绘制MCF-7、ZR-75-1、MDA-MB-231细胞系生长曲线;MCF-7细胞系进行无血清悬浮培养1个周期,流式细胞仪检测分子表面标记物CD44+CD24-含量,贴壁培养的CD44+CD24-乳腺癌干细胞为对照组;将分选的MCF-7（CD44+CD24-）和分选的其余MCF-7细胞（非CD44+CD24-）进行干性成球实验,鉴定CD44+CD24-干性表达。结果:MCF-7、MDA-MB-231细胞系富含表面标志物CD44-CD24-的乳腺癌细胞;ZR-75-1细胞系富含分子表面标志物CD44+CD24+的乳腺癌细胞;生长曲线显示MCF-7、ZR-75-1、MDA-MB-231均呈持续增长,MDA-MB-231细胞生长较MCF-7、ZR-75-1细胞快;通过无血清悬浮培养CD44+CD24-乳腺癌干细胞由19.4%富集到88.9%;成球实验中CD44+CD24-表型细胞成球数量较分选的其余MCF-7细胞（非CD44+CD24-表型）明显增多,成球率分别为（36.5±1.7）%,（1.1±0.5）%。结论:流式细胞仪可成功分选出分子表面标志物为CD44+CD24-的乳腺癌干细胞;CD44+CD24-可能不是乳腺癌干细胞唯一的表面标志物;MDA-MB-231细胞系较MCF-7、ZR-75-1细胞系生长快;无血清悬浮培养法可简便、高效地富集乳腺癌干细胞;CD44+CD24-乳腺癌干细胞干性表达较强。     

防己诺林碱对肺癌H1299和A549细胞的作用及其分子机制研究

目的 探究防己诺林碱在肺癌中的作用及其分子机制。方法 MTS法检测经10、15、20、30、40和60 μM/L防己诺林碱处理的肺癌H1299和A549细胞的增殖情况,通过Caspase3、Caspase8和Caspase9活性检测试剂盒和TUNEL试剂盒检测细胞凋亡情况。Western blot检测MAPK信号通路(p-Akt、PI3K、mTOR和Akt蛋白)、增殖和转移(MMP-2、MMP-9、PCNA、Cyclin D1和P21蛋白)、周期和凋亡(Cyclin D2、Bcl2、MCL-1、Bax和p53蛋白)相关蛋白的表达情况,通过Real-time PCR检测PI3k、mTOR、MMP-2、MMP-9、PCNA、Cyclin D1、Cyclin D2、MCL-1、Bax、Bcl2和TP53基因表达情况。结果 防己诺林碱会抑制肺癌H1299和A549细胞的增殖,诱导细胞凋亡,增加Caspase3、Caspase8和Caspase9酶活性。经防己诺林碱处理后,PI3K、p-Akt、mTOR、MMP-2、MMP-9、PCNA、Cyclin D1、Cyclin D2和Bcl2蛋白表达降低,P21、MCL-1、Bax和p53蛋白表达升高,并且表现为剂量依赖性,但对Akt蛋白表达无影响;PI3K、mTOR、MMP-2、MMP-9、PCNA、Cyclin D1、Cyclin D2和Bcl2基因表达降低,TP53、MCL-1和Bax基因表达增加。结论 防己诺林碱通过调控MAPK信号通路、增殖和转移、周期和凋亡相关蛋白和基因的表达,从而抑制细胞增殖,诱导细胞凋亡。     

过表达lncRNA LINC00886靶向调控miR-451a影响乳腺癌MDA-MB-231细胞生物学行为

目的:探究过表达长链非编码RNA（lncRNA）LINC00886通过调控微小RNA-451a（miR-451a）对乳腺癌（BC）MDA-MB-231细胞生物学行为的影响。方法:荧光定量PCR（qRT-PCR）检测人乳腺上皮细胞系（MCF-12A）和4种BC细胞系（HCC1937、SUM159、SK-BR-3和MDA-MB-231）中lncRNA LINC00886、miR-451a表达。将MDA-MB-231细胞分为对照组、LINC00886-NC组、LINC00886组、LINC00886+miR-NC组、LINC00886+miR-451a组。qRT-PCR法检测MDA-MB-231细胞中lncRNA LINC00886、miR-451a表达水平;克隆形成实验和EdU染色检测MDA-MB-231细胞增殖能力;流式细胞术、Transwell小室实验、划痕愈合实验分别用来检测MDA-MB-231细胞凋亡、侵袭、迁移;蛋白印迹法检测MDA-MB-231细胞中增殖细胞核抗原（PCNA）、Bcl-2相关X蛋白（Bax）、B淋巴细胞瘤-2（Bcl-2）、活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Cleaved caspase-3）、基质金属蛋白酶（MMP）-2、MMP-9蛋白表达;双荧光素酶报告基因检测lncRNA LINC00886与miR-451a的靶向关系。结果:与人乳腺上皮细胞MCF-12A相比,BC细胞系中lncRNA LINC00886表达水平降低,miR-451a表达水平升高（P＜0.05）;过表达lncRNA LINC00886可升高MDA-MB-231细胞凋亡率、Bax和Cleaved caspase-3蛋白表达,降低miR-451a表达、集落形成数、EdU阳性细胞百分比、侵袭细胞数、迁移率以及PCNA、Bcl-2、MMP-2、MMP-9蛋白表达（P＜0.05）;上调miR-451a表达可减弱lncRNA LINC00886过表达对MDA-MB-231细胞的影响（P＜0.05）;lncRNA LINC00886可靶向调控miR-451a表达。结论:过表达lncRNA LINC00886可通过靶向抑制miR-451a表达促进MDA-MB-231细胞凋亡并抑制MDA-MB-231细胞增殖、侵袭和迁移。     

RNA干扰沉默Survivin表达提高131I对甲状腺癌FTC-133细胞增殖的抑制作用

目的:探讨RNA干扰沉默Survivin表达对131I抑制甲状腺癌FTC-133细胞生长的作用及其机制。方法:采用脂质体法将Survivin-siRNA及其阴性对照NC-siRNA转染至干扰组和NC组细胞中,Real-time PCR和Western blot检测Survivin mRNA和蛋白的表达;以131I孵育后,MTT法、流式细胞仪检测Survivin对FTC-133细胞增殖、周期和凋亡的影响,Western blot检测细胞中CDK2、Cyclin E、Bax和Bcl-2蛋白的表达变化。结果:转染Survivin-siRNA成功沉默FTC-133细胞中Survivin mRNA和蛋白的表达,抑制FTC-133细胞增殖,诱导细胞阻滞于G0/G1期和细胞凋亡,并下调细胞中CDK2、Cyclin E和Bcl-2蛋白的表达,上调Bax蛋白的表达;131I孵育后,干扰组细胞中的上述变化较NC组明显增强。结论:沉默Survivin表达可提高131I对FTC-133细胞增殖的抑制作用和对细胞凋亡的促进作用,其作用机制可能与下调CDK2、Cyclin E、Bcl-2和上调Bax蛋白的表达有关。