分子信标实时定量PCR法检测胃癌中Survivin基因mRNA的表达

目的 采用分子信标实时定量PCR方法检测胃癌样本中Survivin基因mRNA的表达量，并分析其与临床资料之间的关系。方法 设计Survivin基因特异性分子信标探针和引物，以cDNA克隆重组质粒为标准品，建立Survivin基因实时定量检测方法；并检测胃癌样本中Survivin基因mRNA的模板拷贝数。结果 Survivin基因mRNA分子信标实时定量检测方法的线性范围为10^3-10^10拷贝数，批间变异为28．16％，批内变异为13．34％，灵敏度为42个拷贝数，平均回收率为109．83％；胃癌组织、癌旁组织和正常组织以及胃良性病变组织间比较，mRNA模板拷贝数差异有显著性（P〈0．05）；胃癌样本中mRNA模板拷贝数与淋巴结转移和2年生存期以及病理类型相关（P〈0．05）。结论 成功建立Survivin基因分子信标实时定量检测方法。胃癌中该基因表达的模板拷贝数可作为预测淋巴结转移、评价预后的一个重要指标。     

荧光定量RT-PCR检测OATP-E基因表达

目的：建立荧光定量RT-PCR检测肿瘤细胞有机阴离子转运多肽E(organic anion transporting polypeptide-E,OATP-E)mRNA的方法，了解乳腺癌细胞株MCF-7和对阿霉素耐药的乳腺癌细胞株MCF-7/ADR中OATP-E mRNA的表达水平。方法：构建重组质粒，绘制荧光定量RT-PCR检测OATP-E mRNA的标准曲线，并运用此方法检测MCF-7/ADR和MCF-7细胞株中OATP-E mRNA的表达。结果：荧光定量RT-PCR检测MCF-7和MCF-7/ADR细胞OATP-E的基因表达，重复10次实验所得结果平均分别为5.47×105拷贝数/μg RNA和2.82×104拷贝数/μg RNA，两者相差约19.4倍，P＜0.05。结论：成功建立了荧光定量RT-PCR检测OATP-E基因表达的方法，检测结果用绝对拷贝数表示，定量准确可靠，并有利于标准的统一。初步应用发现乳腺癌耐药株MCF-7/ADR中OATP-E mRNA的表达量比不耐药株MCF-7减少。     

Satb2基因实时荧光定量聚合酶链反应标准品的制备及应用研究

目的:制备用于Satb2基因实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)的标准品。方法:提取胚胎上颌突组织总RNA,行逆转录反应获得第一链的cDNA,再通过PCR回收获得预期Satb2基因片段;通过T-A克隆将该片段插入pGMT质粒载体;大量提取质粒,定量后进行标准曲线的制作和实时荧光定量PCR。结果:重组质粒经PCR扩增及序列测定表明,pGMT/Satb2基因已成功克隆。结论:所构建的pGMT/Satb2基因实时荧光定量PCR检测标准品应用Taqman荧光探针技术建立的标准曲线线性关系好,灵敏度和特异性高,准确可靠,此法可作为实时荧光定量PCR检测Satb2基因的标准方法。     

荧光定量PCR检测B19病毒方法的建立

中图分类号R373摘要目的:建立采用荧光定量聚合酶链反应(FQPCR)检测人微小病毒B19的方法。方法:根据B19病毒VP2基因序列,设计并合成引物和荧光标记探针。将PCR扩增的B19病毒VP2区基因片段克隆入pGEMT载体,重组质粒pGEM-T-VP2经筛选、鉴定后,作为阳性模板,用于标准曲线的制定和样品检测;对15例B19病毒感染血标本和几种其他病毒进行PCR测定。结果:应用重组质粒制作的定量曲线循环阈值与模板浓度具有良好的线性关系;与定量对照曲线比较计算,15例B19病毒感染标本中B19拷贝数为4.8×105μl-1～8.7×108μl-1;对其他几种病毒的扩增均无信号出现。结论:成功建立了检测B19的荧光定量PCR方法,较常规PCR技术更为简便、快速、准确,有很好的应用前景和研究价值。     

早产孕妇血浆中游离胎儿DNA-SRY基因片段的定量检测

目的 建立实时荧光定量聚合酶链反应(RQ-PCR)检测早产孕妇血浆中游离胎儿DNA的男性性别决定基因(SRY)的方法. 方法 利用RQ-PCR技术检测25例正常孕妇和102例早产孕妇血浆中游离胎儿DNA-SRY基因,用一系列稀释的标准品建立此检测方法的标准曲线. 结果 RQ-PCR检测到早产孕妇血浆中游离胎儿DNA-SRY基因的存在,其特异性为100%,灵敏度92.7%,准确率96.1%.早产孕妇血浆中游离胎儿DNA-SRY的中位浓度为321.8拷贝数/mL,较正常孕妇高(P＜0.05). 结论 RQ-PCR能简单、快速、方便地对孕妇血浆的游离胎儿DNA-SRY基因进行检测,其灵敏度高,特异性好,能定量分析,对进一步了解早产的病理生理情况可能有一定的应用价值.     

早产孕妇血浆中游离胎儿DNA-SRY基因片段的定量检测

目的建立实时荧光定量聚合酶链反应(RQ-PCR)检测早产孕妇血浆中游离胎儿DNA的男性性别决定基因(SRY)的方法。方法利用RQ-PCR技术检测25例正常孕妇和102例早产孕妇血浆中游离胎儿DNA-SRY基因,用一系列稀释的标准品建立此检测方法的标准曲线。结果RQ-PCR检测到早产孕妇血浆中游离胎儿DNA-SRY基因的存在,其特异性为100%,灵敏度92.7%,准确率96.1%。早产孕妇血浆中游离胎儿DNA-SRY的中位浓度为321.8拷贝数/mL,较正常孕妇高(P<0.05)。结论RQ-PCR能简单、快速、方便地对孕妇血浆的游离胎儿DNA-SRY基因进行检测,其灵敏度高,特异性好,能定量分析,对进一步了解早产的病理生理情况可能有一定的应用价值。     

慢性粒细胞白血病BCR-ABL融合基因实时定量检测平台的建立

目的：建立慢性粒细胞白血病（chronic myelogenous leukemia ,CML）患者BCR-ABL融合基因检测及微小残留病变实时定量监测的诊断平台。方法依据GenBank中编码P210蛋白的融合基因M（ b2a2,b3a3）及ABL的基因序列,分别设计引物及Taqman探针,以BCR-ABL阳性的CML患者cDNA为模板,通过PCR扩增出587 bp的基因片段,连入pMD 18-T载体,制备成标准品并绘制标准曲线,运用实时荧光定量PCR（ real-time quantitative PCR,RQ-PCR）技术监测BCR-ABL转录水平的变化。结果成功构建BCR-ABL标准品。应用RQ-PCR探针法,以ABL为内参,对CML患者进行BCR-ABL融合基因的检测,得到比较稳定的定量数据,与定性结果一致。结论自行构建BCR-ABL质粒为标准品,运用RQ-PCR实时监测BCR-ABL融合基因的表达变化,敏感性好,稳定性高,对临床检验具有普遍意义。     

博尔纳病病毒荧光定量套式RT-PCR检测方法的建立

目的：建立博尔纳病病毒(BDV)荧光定量套式RT-PCR检测方法，为快速、准确地定量检测BDV奠定基础。方法：根据BDV P24基因序列，设计并合成引物和荧光标记探针。将PCR扩增的BDV P24基因片段克隆入载体，重组质粒经筛选、鉴定后，作为阳性模板，用于标准曲线的制定和样品检测。结果：应用量组质粒制作的定量曲线循环阈值与模板具有良好的线性关系，相关系数为0．998，建立了检测BDV的荧光定量套式RT-PCR方法。检测58例神经精神病患者及50例健康人外周血单核细胞(PBMC)中BDV P24基因片段，3例精神分裂症及1例帕金森病患者呈阳性，其余均为阴性。结论：荧光定量套式RT-PCR方法能够避免PCR后处理导致的假阳性污染，并实现准确定量，对于研究BDV感染与人类神经精神疾病的关系有很好的应用价值。     

HBVDNA荧光定量PCR标准曲线初探

目的 通过比较分析，讨论HBV-DNA荧光定量PCR每次检测是否均带标准品，建标准曲线，从而增加仪器通量，减低检测成本。方法 通过分析软件引进标准曲线，计算五份不同拷贝数样本批内、批间的CV。结果 批内CV可以接受，批间在低拷贝数CV较大。结论 同一试剂批号时，可以通过引进标准曲线来计算样本原始模板数，而批号不同时，为保证结果的可靠性，必须重新建立标准曲线。     

实时定量聚合酶链反应技术研究进展

聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)是通过对基因的选定片段进行体外高效的扩增,实现对目的基因的检测。传统的PCR定量方法,如溴乙锭染色,测定的是PCR的终产物,而不是初始模板拷贝数,由于PCR的终产物量与起始模板量之间没有线性关系,所以根据最终的PCR产物量不能计算     

淋巴瘤Bcl-2/IgH融合基因实时定量PCR检测方法的研究

目的建立Bcl-2/IgH融合基因实时定量PCR检测方法。方法以淋巴瘤患者Bcl-2/IgH融合基因的纯化DNA作为标准品,淋巴瘤患者骨髓和外周血为样本,建立SYBR GreenⅠ荧光染料实时定量PCR（Real-time Quantitative PCR,RQ-PCR）,并对方法的灵敏性、稳定性、重复性进行测定。结果构建的RQ-PCR方法检测Bcl-2/IgH融合基因的敏感性达10^-7水平;标准曲线的斜率和相关系数分别为-3.13,0.99;管间变异和批间变异分别为6.54%,6.73%,1.90%和3.59%,6.30%,5.49%。结论建立的SYBR GreenⅠ荧光染料RQ-PCR方法灵敏,标准曲线的相关性好,方法的稳定性和重复性较好。     

定量检测E-cadherin基因启动子区甲基化芯片的建立

目的：拟建立一种能够定量检测抑癌基因E-cadherin甲基化改变的基因芯片.方法：用亚硫酸氢盐处理基因组DNA,并以此为模板进行PCR扩增.目的序列中未甲基化的CpG住点被翻转成TpG,而甲基化的CpG位点保持不变.设计5组探针构建一种检测E-cadherin基因启动子区17个CpG住点甲基化改变的芯片,每组探针包括一对非甲基化探针和甲基化探针,检测相邻的3或4个CpG位点.结果：绘制标准曲线显示,芯片上探针的可重复性和精确性很好,并定量检测了1例白血病样本的甲基化改变.结论：基因芯片能够作为一种定量检测基因多个CpG位点甲基化改变的有效工具,并用于肿瘤的研究.     

荧光实时定量RT-PCR观察伤寒杆菌鞭毛z66和d/j抗原基因表达方法的建立

目的：构建荧光实时定量RT-PCR测定伤寒杆菌鞭毛抗原z66和d／j编码基因mRNA的方法。方法：根据伤寒杆菌鞭毛抗原z66和d／i编码基因序列,设计引物扩增其读码框架内片段,克隆进pGEM-TEasy质粒。质粒经PCR鉴定后,纯化并定量,作为荧光实时定量PCR的标准品,并制作标准曲线。利用不同渗透压下的鞭毛素基因表达差异,比较三种随机引物(6、8、10核苷酸)与特异性引物的逆转录效果,以确定一种最佳的随机引物用于多基因表达观察。结果：标准曲线有较好的线性(r=0．999),cDNA和标准品的PCR产物溶解曲线峰值一致。用8核苷酸随机引物进行逆转录的敏感度高于6、10核苷酸随机引物,低于特异性引物,但用其观测z66抗原基因和d／j抗原基因在高、低渗时表达变化趋势与用特异性引物测得结果一致。结论：成功构建用8核苷酸随机引物进行逆转录同时测定伤寒杆菌鞭毛抗原z66和d／j基因表达的荧光实时定量RT-PCR方法。     

实时荧光定量PCR与酶联定量PCR技术在 HBV-DNA载量检测中的比较研究

目的:比较实时荧光定量PCR(RQ-PCR)与酶联定量PCR(ELQ-PCR)技术在检测HBV感染血清HBV-DNA载量的灵敏度,精确性.为乙型肝炎临床抗病毒治疗和评价药物疗效提供可靠的依据.方法:应用RQ-PCR方法检测212例(4组)HBV感染者血清,ELQ-PCR方法检测228例(4组)HBV感染者血清.结果:RQ-PCR和ELQ-PCR方法检测HBV-DNA,其阳性检出率分别为HBsAg,HBeAg,HBcAb-IgG( )组100%和82.61%;HBsAg,HBeAb,HBcAb-IgG( )组90.63%和73.21%;HBsAg,HBcIgG,HBcAb-IgM( )组80.00%和57.58%;HBsAg,HB-cAb-IgG( )组70.15%和51.43%.HBV-DNA载量的阳性检出率,经统计学处理有显著性差异(P＜0.05).结论:RQ-CPR方法检测HBV-DNA载量在实时监测,节时快速,高灵敏,高精确度等方面都更优于ELQ-PCR.     

建立RQ-PCR方法检测急性早幼粒细胞白血病患者６种不同PML/RARα异构体

［摘要］目的: 建立检测急性早幼粒细胞白血病（acute promyelocytic leukemia, APL）患者PML/RARα融合基因６种特异性异构体（bcr1/2、P4R3、P46R3、bcr3及P2R3）的实时定量PCR（RQ-PCR）技术,并评价其特异性。方法: 设计不同异构体的特异性引物和探针,建立异构体特异性RQ-PCR方法对６种特异性异构体PML/RARα阳性模板进行扩增,评价异构体定量检测的特异性,并检测10例APL患者中不同异构体的含量。结果： 所建立的各异构体特异性RQ-PCR法最大敏感性均达10拷贝/μL,但其重复性较差,108~102拷贝/μL阳性模板的重复性良好,正常对照及空白对照无扩增信号,每个异构体特异性RQ-PCR均不能扩增其他异构体。5例长型（bcr1）和1例变异型（bcr2）阳性APL患者中bcr1/2异构体表达量为7.71%~89.71%（中位数13.70%）,P4R3异构体表达量为0.71%~16.26%（中位数4.48%）,P46R3异构体表达量为3.57%~14.09%（中位数6.33%）。4例短型（bcr3）患者中bcr3异构体表达量为21.43%~197.04%（中位数100.69%）,P2R3异构体表达量为0.34%~9.07%（中位数2.45%）。1例短型患者经诱导治疗缓解后bcr3和P2R3异构体转录本明显下降,复发时又明显升高。结论： 检测PML/RARα异构体特异性RQ PCR方法敏感、可靠,可用于APL患者不同异构体的定量检测和微小残留病灶的随访监测。     

建立SYBR Green实时RT-PCR定量检测大鼠I型胶原mRNA水平方法

目的：基于双链嵌合荧光染料SYBR Green Ⅰ,建立一种快速、灵敏的检测大鼠Ⅰ型胶原mRNA表达水平的实时逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）方法．方法：提取大鼠肝脏总RNA,RT-PCR扩增Ⅰ型胶原基因部分片段,将其克隆入pMD18-T载体用作参比品．基于SYBR GreenⅠ双链嵌合染料建立检测大鼠Ⅰ型胶原mRNA表达水平方法．其中对一系列连续稀释的参比品进行实时PCR分析,评价所建立方法的检测灵敏度;对PCR产物的熔解曲线进行分析评价其特异性．结果：重组质粒构建成功,经测序鉴定,目的片段已插入pMD18-T载体内．所建立的实时RT-PCR方法的最低检测限度为1个拷贝／反应,在每反应10^0～10^7拷贝范围内,CT值（C代表cycle,T代表threshold;CT值指荧光信号达到设定的阈值所经历的循环数）与起始模板浓度具有良好的线性关系,相关系数为0．991．结论：所建立的基于SYBR GreenⅠ双链嵌合染料的大鼠Ⅰ型胶原PCR检测方法具有敏感性高、特异性强和线性检测范围广等特点,适用于进一步的各种组织的大量样本检测．     

人FHIT基因实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

目的：建立检测人脆性组氨酸三联体（fragile histidine triad,FHIT）基因的荧光定量RT-PCR方法。方法：根据GenBank中人FHIT基因序列,在保守区设计合成一对特异引物,将PCR扩增得到的FHIT基因克隆至PMD18-T载体上,构建的重组质粒标准品倍比稀释后运用SYBR Green I染料法绘制标准曲线,并进行融解曲线分析。结果：FHIT基因的标准品稀释度在1×107～1×103copies/μl范围内具有良好的线性关系,Ct值线性范围为14.28～28.36,相关系数为0.998,融解曲线分析表明,产物为特异的单峰,Tm为92.3±0.1℃。结论：建立了人FHIT基因实时荧光定量RT-PCR方法,为在mRNA水平对人FHIT的定量分析奠定了基础。