人Elf5基因真核表达质粒的构建及其亚细胞定位

目的：构建人Elf5真核细胞表达质粒,并研究其在乳腺癌MCF7细胞中的亚细胞定位。方法：PCR扩增人Elf5基因,将其克隆入真核表达载体pEGFP-C1中,构建含人Elf5基因的真核表达质粒pEGFP-hElf5。利用酶切鉴定,DNA测序,免疫印迹及免疫荧光方法鉴定Elf5真核表达质粒及Elf5蛋白的亚细胞定位。结果：经酶切鉴定、DNA测序、免疫印迹方法确认Elf5基因成功导入真核表达载体pEGFP-C1。瞬时转染MCF7细胞,Elf5蛋白表达在细胞核中。结论：pEGFP-Elf5真核表达质粒构建成功,Elf5定位在细胞核中。     

紫杉醇耐药基因TXR1 对乳腺癌细胞耐药性的影响

目的：构建人紫杉醇耐药基因1（TXR 1）的表达载体并对MCF-7 人乳腺癌细胞系进行转染且检测其表达。方法：RT-PCR 方法扩增TXR 1 CDS 片段,并将扩增的片段插入pEGFP-C3 真核表达载体,构建成含TXR 1 cDNA 的重组载体pEG ?FP-TXR1,以脂质体介导该质粒转染人乳腺癌细胞系MCF-7,应用RT-PCR、Western Blot和荧光显微镜鉴定转染细胞中TXR 1 的表达。用MTT 法对转染前后的MCF-7 细胞进行紫杉醇耐药性分析。结果：成功构建含TXR 1 cDNA 的重组载体pEGFP-TXR1,转染MCF-7 细胞后成功表达TXR 1 蛋白,在转染的细胞中,证实有TXR 1 mRNA 和蛋白表达上调。MTT 法显示转染了TXR 1 的MCF-7 细胞获得紫杉醇耐药性。结论：成功构建TXR 1 表达载体,并在人乳腺癌细胞系MCF-7 得到表达,获得紫杉醇耐药性。     

ECM1-pEGFP-N2 真核表达载体的构建及其在人乳腺癌细胞系MCF-7中的表达

目的构建细胞外基质蛋白1基因（ECM1）的真核表达载体ECM1-pEGFP-N2,检测其在人乳腺癌细胞系MCF-7中表达。方法采用PCR方法,以ECMleDNA为模板,扩增出ECM1基因,用Bg1 Ⅱ和KpnⅠ双酶切ECM1基因和pEGFP-N2载体,连接酶切目的片段,转化大肠杆菌DH5,筛选阳性克隆酶切、测序鉴定;利用脂质体介导的转染技术转染MCF-7细胞,荧光显微镜检测报告基因表达产物EGFP,免疫组化检测ECM1蛋白表达。结果利用PCR克隆出约1．6kb的ECM1基因;PCR鉴定、酶切鉴定及测序结果证实成功构建ECM1-pEGFP-N2真核表达载体;转染MCF-7细胞后,可在细胞内观察到报告基因产生的绿色荧光,用免疫组化方法可检测到ECM1蛋白。结论成功构建了ECM1-pEGFP-N2真核表达载体,并在MCF-7细胞中表达,为进一步研究ECM1的功能奠定了基础。     

人源FOXG1基因真核表达载体的构建、表达及其对HeLa细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响

目的:构建人源FOXG1真核表达载体,瞬时转染HeLa细胞实现FOXG1过表达,观察FOXG1对HeLa细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响,为后续研究人源FOXG1基因在肿瘤中的作用机制奠定理论基础。方法:利用One Step Cloning法构建重组质粒pEGFP-C1-FOXG1,并通过酶切、测序对重组质粒进行鉴定;采用脂质体介导的转染法将pEGFP-C1-FOXG1瞬时转染至HeLa细胞,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达,Western blot检测HeLa细胞中EGFP-FOXG1融合蛋白的表达;进一步,分别通过CCK8、伤口愈合和Transwell实验检测FOXG1对HeLa细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响。结果:酶切鉴定和测序表明重组质粒pEGFP-C1-FOXG1构建成功;瞬时转染HeLa细胞24小时后,能够在荧光显微镜观察到绿色荧光,48小时后转染效率达到90%;Western blot显示EGFP-FOXG1融合蛋白正确表达;CCK8实验表明过表达FOXG1能够促进HeLa细胞的增殖;伤口愈合和Transwell实验表明FOXG1过表达可以促进HeLa细胞的迁移和侵袭。结论:成功构建了pEGFP-C1-FOXG1重组质粒,并在HeLa细胞中正确表达;功能实验表明FOXG1能够促进HeLa细胞增殖、迁移和侵袭。     

RUNX3基因真核表达载体的构建及其在乳腺癌T47D细胞中的表达

目的:构建真核表达载体pcDNA3.1(+)-RUNX3,并在乳腺癌T47D细胞株中表达。方法:应用基因重组技术和限制性内切酶EcoRI和XhoI酶切,构建并鉴定pcDNA3.1(+)-RUNX3真核表达载体,经脂质体Lipofectamine2000介导质粒转染T47D细胞后应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot实验,检测RUNX3在T47D细胞中的表达。结果:重组真核表达载体pcDNA3.1(+)-RUNX3经限制性内切酶EcoRI和XhoI酶切,电泳后显示1.3kb的RUNX3目的片段和5.4kb的pcDNA3.1(+)载体片段。测序证实酶切片段与gene bank中登记的RUNX3序列相同,证实pcDNA3.1(+)-RUNX3真核表达载体构建成功。经RT-PCR和Western blot检测,表明转染pcDNA3.1(+)-RUNX3的T47D细胞RUNX3阳性表达。结论:重组真核表达载体构建正确,并建立稳定表达RUNX3的T47D细胞系,从而为后续研究提供有用的细胞研究模型。     

人细胞周期素D1和B1真核表达载体的构建及对HeLa细胞的转染

目的：构建人细胞周期素cyclin D1和cyclin B1的真核表达载体,并将其瞬时转染到HeLa细胞株中。方法：以HeLa细胞总RNA为模板,通过RT-PCR扩增cyclin D1和cyclin B1基因编码的cDNA,并将扩增的cDNA片段插入p3XFLAG-CMV~（TM）-14真核表达载体,分别构建p3XFLAG-cyclin D1和p3XFLAG-cyclin B1重组质粒,重组子经酶切分析和测序鉴定后,用脂质体介导的基因瞬时转染法,将重组正确的表达载体转染HeLa细胞,用Western-blot技术检测细胞中FLAG融合蛋白的表达。结果：经酶切鉴定和Western印迹分析证实人cyclin D1和cyclin B1的真核表达载体构建成功,并能在瞬时转染的HeLa细胞中表达分子量大小相符的重组蛋白。结论：成功构建了人cyclin D1和cyclin B1的真核表达载体,为两种细胞周期素及其相关蛋白的功能研究奠定了基础。     

Hsa-miR-133b影响人乳腺癌MCF-7细胞增殖及FSCN1蛋白表达的研究

目的:研究Has-miR-133b真核表达载体在人乳腺癌MCF-7细胞中的表达及对细胞增殖和对靶蛋白FSCN1表达的影响。方法:构建pEZX MR04-133b真核表达载体,瞬时转染乳腺癌MCF-7细胞,RT-PCR法检测miRNA-133b在转录水平的表达,MTT检测其对细胞增殖的影响。利用生物信息学的方法,根据Tarbase数据库预测miR-133b的靶基因,并进行基因功能初步分析。Western blot检测miR-133b对细胞中FSCN1蛋白表达情况的影响。结果:真核表达载体pEZX MR04-133b成功转染MCF-7细胞,并经RT-PCR检测可有效表达,MTT结果显示miR-133b能明显降低MCF-7细胞的相对增殖率。Western blot结果显示FSCN1为miR-133b在MCF-7细胞中的作用靶点之一。结论:构建了真核表达载体pEZX MR04-133b,转染乳腺癌MCF-7细胞后能有效表达,并以FSCN1基因作为作用靶点。     

表达的siRNA对人乳腺癌SKBr-3细胞中survivin基因的干涉作用

目的:构建针对人survivin基因的siRNA真核表达载体,检测其对人乳腺癌SKBr-3细胞中survivin基因表达的干涉作用.方法:将合成的寡核苷酸链退火形成双链,连接入经HindⅢ和BglⅡ双酶切后的pSUPER真核表达载体.对重组质粒进行酶切分析和测序鉴定.通过脂质体介导,把重组质粒稳定转染入SKBr-3细胞,RT-PCR、Western blot印记杂交和细胞免疫化学法检测其对mRNA和蛋白表达的干涉效果.结果:经酶切鉴定及基因测序证实,重组质粒中已插入目的基因片段.RT-PCR显示两个干涉载体均抑制了目的基因的转录;Western blot印记杂交和细胞免疫化学检测结果显示pSUPER-S1对蛋白表达的抑制作用更强.结论:成功地构建了针对人survivin基因的RNA干涉真核表达载体pSUPER-S1和pSUPER-S2,并在人乳腺癌细胞株SKBR-3中有效发挥了对survivin基因的干涉作用.     

hSesn3基因真核表达载体的构建及在骨肉瘤细胞中的蛋白表达和定位

目的:通过构建人Sesn3真核表达载体同时证实融合蛋白在细胞中的表达及定位.方法:提取Hela工具细胞的mRNA,反转录至cDNA.进一步通过PCR来扩增人Sesn3基因的cDNA全长片段,并将其亚克隆于pEGFP-C1真核表达载体中,进而将构建的重组质粒进行酶切及测序鉴定,转染到MG-63骨肉瘤细胞中,获取细胞总蛋白,通过Western blot方法检测表达.进一步利用激光共聚焦扫描显微镜方法观察MG-63细胞内pEGFP-hSesn3的定位,最后利用免疫沉淀方法纯化人源hSesn3蛋白.结果:hSesn3基因cDNA全长片段克隆于真核表达载体pEGFP-C1中,酶切鉴定片段为1 410 bp,并成功测序.Western blot检测到了GFP-hSesn3融合蛋白表达,分子量约为79 kDa.在MG-63细胞中pEGFP-hSesn3主要定位于细胞质,进一步成功纯化了hSesn3蛋白.结论:成功构建了hSesn3基因cDNA全长的真核表达载体,在MG-63细胞中pEGFP-hSesn3蛋白主要定位于细胞质,最终成功纯化了hSesn3蛋白.     

V型腺病毒纤维蛋白基因真核表达质粒的构建及表达

目的：构建腺病毒纤维蛋白基因的真核表达质粒,并检测其在真核细胞中的表达,为腺病毒靶向性载体构建创造条件。方法：采用限制性内切酶技术,酶切腺病毒骨架质粒pAdEasy-1,经多次亚克隆,最后完成克隆纤维蛋白基因并构建其真核表达质粒,用脂质体法将构建好的真核表达质粒瞬时转染COS-7细胞,于转染后72h,用Western blot法检测所表达的蛋白。结果：克隆成功纤维蛋白基因,并构建纤维蛋白基因真核表达质粒pcDNA/Fiber,经限制性内切酶酶切鉴定及测序证实了其正确性,Western blot结果显示,新表达蛋白在变性条件下大小为62kD,而在非变性条件下为186kD。结论：纤维蛋白基因真核表达质粒能在真核细胞中表达,产物具有三聚体结构。可用于腺病毒靶向性载体的构建。     

Ellagic Acid Exerts Anti-proliferation Effects via Modulation of Tgf-Β/Smad3 Signaling in MCF-7 Breast Cancer Cells

Ellagic acid has been shown to inhibit tumor cell growth. However, the underlying molecular mechanismsremain elusive. In this study, our aim was to investigate whether ellagic acid inhibits the proliferation of MCF-7 human breast cancer cells via regulation of the TGF-β/Smad3 signaling pathway. MCF-7 breast cancer cellswere transfected with pEGFP-C3 or pEGFP-C3/Smad3 plasmids, and treated with ellagic acid alone or incombination with SIS3, a specific inhibitor of Smad3 phosphorylation. Cell proliferation was assessed by MTTassay and the cell cycle was detected by flow cytometry. Moreover, gene expression was detected by RT-PCR,real-time PCR and Western blot analysis. The MTT assay showed that SIS3 attenuated the inhibitory activityof ellagic acid on the proliferation of MCF-7 cells. Flow cytometry revealed that ellagic acid induced G0/G1 cellcycle arrest which was mitigated by SIS3. Moreover, SIS3 reversed the effects of ellagic acid on the expression ofdownstream targets of the TGF-β/Smad3 pathway. In conclusion, ellagic acid leads to decreased phosphorylationof RB proteins mainly through modulation of the TGF-β/Smad3 pathway, and thereby inhibits the proliferationof MCF-7 breast cancer cells.     

人微管不稳定蛋白基因真核表达载体的构建与表达及对食管癌细胞的作用

目的 构建人微管不稳定蛋白基因(stathmin)真核表达载体,研究其对食管癌细胞EC9706的作用.方法 采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增stathmin cDNA,克隆至pMDl8-T载体并酶切鉴定后,亚克隆至pEGFP-C2真核表达载体.将测序鉴定正确的重组载体和空载体经脂质体转染EC9706细胞,G418筛选获得稳定转染的细胞株.通过荧光显微镜观察转染细胞荧光蛋白的表达,采用Western blot检测转染细胞中增强型荧光蛋白(EGFP)和stathmin融合蛋白的表达.选取稳定转染的细胞株,采用细胞计数法绘制细胞生长曲线,采用流式细胞仪分析细胞的增殖状态,平板克隆形成实验、裸鼠移植瘤实验分析转染细胞成瘤性.结果 RT-PCR扩增获得450 bp的cDNA编码序列;克隆至pMD18-T载体,经酶切鉴定后获反向插入质粒;亚克隆至pEGFP-C2载体后,经酶切与测序鉴定,重组载体pEGFP-stathmin构建成功.重组载体和空载体转染EC9706细胞,G418筛选获得稳定转染的细胞株.通过荧光显微镜观察到,转染细胞中呈现绿色荧光;经Western blot证实,重组载体表达46 000的融合蛋白.与空载体转染细胞相比,转染重组载体的EC9706细胞形态变大,增殖速度减慢,细胞分裂阻滞于G2/M期,细胞克隆形成数减少,裸鼠体内成瘤性降低(P＜0.05).结论 构建的真核表达载体pEGFP-stathmin在食管癌EC9706细胞中能够稳定表达,并抑制肿瘤细胞的增殖和成瘤性.     

过表达PNRC对MCF-7乳腺癌细胞生长的影响

目的：探讨核受体辅活化子（coactivator）PNRC（proline—rich nuclear receptor coregulatory protein）对乳腺癌细胞生长的影响。方法：以pACT2／PNRC为模板，采用PCR扩增全长PNRC编码序列，将BclⅠ和XhoⅠ消化的PCR产物插入pCMVtaq2c，构建pCMVtaq2c／PNRC真核表达质粒。酶切和测序鉴定后，采用脂质体转染法，分别将pCMVtaq2c／PNRC表达质粒和pCMVtaq2c空质粒转染MCF-7细胞，经G418筛选4周后，分别采用RT—PCR、Northern blot和Western Blot鉴定稳定表达PNRC的MCF-7细胞株。最后，采用MTT法和^3H-胸腺嘧啶掺入法观察了过表达PNRC的MCF-7乳腺癌细胞和pCMVtaq2c空质粒转染的MCF-7乳腺癌细胞生长速率和增殖的差异。结果：成功构建了PNRC的真核表达质粒pCMVtaq2c／PNRC，并筛选到稳定表达PNRC的MCF-7乳腺癌细胞株，转染PNRC的MCF-7细胞的生长速率和增殖明显慢于对照组细胞。结论：过表达的PNRC对MCF-7乳腺癌细胞的生长具有抑制作用。     

TFPI-2基因克隆及其在胰腺癌细胞中的表达

目的克隆人TFPI-2基因全长cDNA,构建其真核表达载体,并将其转染到人胰腺癌细胞Panc-1中,检测其表达。方法用RT-PCR法从人胎盘组织中扩增人TFPI-2基因,并将其与真核表达载体pEGFP-C1连接,构建真核表达载体pEGFP-C1-TFPI-2。将构建的重组载体转染到人胰腺癌细胞系Panc-1细胞,Westernblot检测TFPI-2在Pane-1细胞中的表达。结果RT-PCR成功的扩增出一条约708bp的片断,扩增片断与载体连接后,经限制性内切酶酶切电泳分析和DNA序列测定证实该基因已经成功构建到载体上,转染Panc-1细胞后,荧光显微镜观察到稳定转染细胞发出较强绿色荧光,Westernblot技术证明TFPI-2基因能在Panc-1细胞中稳定表达。结论成功构建了人TFPI-2基因的真核表达载体pEGFP-C1-TFPI-2,获得了稳定表达TFPI-2的Panc-1细胞,证实TFPI-2基因能够在人胰腺癌细胞系Panc-1中高效、稳定的表达,为进一步研究其胰腺癌迁移、浸润及转移中的作用打下基础。     

pEGFP-BLCAP真核表达载体的构建和鉴定

目的：构建真核表达载体pEGFP—BLCAP并转染骨肉瘤细胞SOSP—M。方法：从培养的人骨肉瘤细胞系SOSP—M细胞中提取总RNA，经RT—PCR获得BLCAP基因的cDNA，测序正确后插入真核表达载体pEGFP—C2中。构建的重组质粒经脂质体介导转染SOSP—M细胞，经观察荧光蛋白表达和Western blot鉴定目的蛋白在转染后的SOSP—M细胞中的表达情况。结果：RT—PCR成功地扩增出一条约280bp的片段，经限制性内切酶分析和DNA序列测定证实目的基因cDNA已插入重组质粒；荧光显微镜下观察到转染后的SOSP—M细胞发出较强绿色荧光，Western blot证明BLCAP能以融合蛋白的形式在SOSP—M细胞中获得表达。结论：构建了真核表达载体pEGFP—BLCAP并成功表达目的蛋白。     

重组质粒BFP—cyclin D1的构建及表达对乳腺癌MCF-7细胞增殖和迁移能力的影响

目的构建含人cyclinD1基因全长编码区的蓝色真核荧光表达载体BFP—cyclinD1,并观察cvclinD1的表达对MCF-7增殖和迁移能力的影响。方法以人乳腺癌MCF-7细胞总RNA为模板,经PCR扩增和酶切后与pEBFP-N1质粒连接,得到重组质粒BFP-cyclinD1。转染到人乳腺癌MCF-7细胞后分为3组：实验组转染BFP—cyclinD1,阴性对照组转染pEBFP—N1;空白对照组为MCF-7,以荧光定量PCR检测基因表达;MTT实验检测细胞生长速度;细胞划痕实验检测细胞迁移能力。结果成功构建了BFP-cyclinD1,并在人乳腺癌MCF-7细胞中呈高表达,荧光定量PCR检测示实验组cyclinD1在转染后12h开始增高,48h达到高峰并持续高表达,与激光共聚焦显微镜观察实验组蓝色荧光表达量的趋势一致;MTT实验证实实验组细胞增殖速度（48、72、96h）显著高于对照组（P〈0．01）;细胞迁移实验表明实验组细胞迁移能力显著高于对照组细胞（P〈0．01）。结论cyclinD1的高表达促进了人乳腺癌MCF-7细胞的增殖和迁移,这可能与其缩短细胞周期、促进DNA合成和复制功能有关。     

HuR基因克隆及其在肝癌细胞中的表达

目的:克隆人抗原R基因（HuR）的cDNA,构建重组真核表达载体pEGFP-HuR,并稳定转染肝癌细胞株。方法:应用逆转录聚合酶链反应技术,从肝癌细胞中扩增得到人HuR基因的cDNA序列,克隆至增强型绿色荧光蛋白表达载体中,经Xho I和EcoR I双酶切和DNA测序鉴定后,将重组真核表达载体通过脂质体法导入肝癌细胞中,利用新霉素(G418)筛选出稳定转染pEGFP-HuR的肝癌细胞株,并用Western blot技术检测HuR基因的表达。结果:Xho I和EcoR I双酶切和PCR结果证实真核表达载体pEGFP-HuR构建成功。Western blot结果显示,在稳定转染重组真核表达载体的肝癌细胞中HuR基因表达水平上调。结论:成功构建了真核表达载体pEGFP-HuR,并筛选获得其稳定转染后HuR表达上调的肝癌细胞株,作为进一步研究HuR基因生物学功能的前期工作。     

IL-24-TRAIL基因载体的构建及其对乳腺癌干细胞迁移和凋亡的影响

目的 构建真核表达载体pIRES-IL-24-TRAIL,探讨其对乳腺癌干细胞迁移和凋亡的影响。方法 以人胎盘组织总RNA为模板,采用RT-PCR二步法,扩增TRAIL的cDNA序列,将其克隆入pIRES载体,扩增IL-24的cDNA序列,将其克隆入pIRES- TRAIL载体,构建重组真核表达载体pIRESIL-24- TRAIL,以Lipofectamine2000转染技术,将质粒pIRES- IL-24-TRAIL导入乳腺癌干细胞MCF-7和MDA-MB-231,流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况,划痕实验比较不同组间细胞迁移情况。结果（1）克隆到TRAIL、IL-24基因的cDNA序列,成功构建其真核表达载体。（2）流式细胞仪发现,实验组比对照组细胞凋亡率高(P<0.05)。（3）细胞划痕实验显示实验组细胞迁移能力明显低于对照组（P＜0.05）。结论 pIRES-IL-24-TRAIL构建成功,并能诱导乳腺癌干细胞凋亡、降低其迁移能力。