重组质粒hTERT-siRNA对胰腺癌细胞移植瘤hTERT相关基因及蛋白表达的影响

目的探讨重组质粒pSilencer4.1CMV neo-hTERT-siRNA对胰腺癌细胞BxPC-3裸鼠皮下移植瘤hTERT相关基因及蛋白表达的影响.方法建立人原发性胰腺癌裸鼠皮下移植瘤模型,将荷瘤裸鼠随机分为4组：（1）肿瘤对照组,未作任何处理;（2）空载组,即pSilencer4.1-CMV neo空质粒组;（3）T1组,即重组质粒pSilencer4.1-CMV neo-hTERT1-siRNA组;（4）T2组,即重组质粒pSilencer4.1-CMV neo-hTERT2-siRNA组）.荷瘤裸鼠分组处理30d后,RT-PCR检测各组瘤体中hTERT、Bcl-2、Bax mRNA的表达,免疫组织化学检测各组瘤体中Bcl-2、Bax、p53、VEGF、端粒酶蛋白表达,Western blot检测各组瘤体中端粒酶蛋白表达情况.结果 T1组和T2组hTERT和Bcl-2 mRNA表达较肿瘤对照组和空载组明显降低,BaxmRNA表达明显升高（P〈0.01）.与肿瘤对照组和空载组比较,T1组和T2组Bcl-2 Telomerase、p53和VEGF蛋白表达明显降低,Bax蛋白表达明显升高（P〈0.01）.结论 （1）重组质粒T1和T2能够下调裸鼠移植瘤体内抗凋亡基因hTERT mRNA、Bcl-2 mRNA和蛋白、p53和端粒酶蛋白表达水平,上调促凋亡基因Bax mRNA和蛋白表达水平,其抗胰腺癌作用可能与促进胰腺癌细胞凋亡有关.（2）重组质粒T1和T2能够显著下调裸鼠移植瘤体内VEGF蛋白表达水平,可能具有抑制肿瘤血管生成的作用。     

肿瘤靶向NGR/LPD复合物对人乳腺癌裸鼠移植瘤作用的研究

目的观察肿瘤靶向NGR／LPD复合物对人乳腺癌裸鼠移植瘤的抑制作用。方法抑瘤实验设有空白对照组、反义核酸组、正义NGR／LPD组、PEI／ASODN组、LPD组、NGR／LPD组。其中,PEI／ASODN组、LPD组及NGR／LPD3组分别设置高低浓度组（100μl,200μl）作对照考察剂量-效应相关性。通过激光共聚焦显微镜观察药物在裸鼠体内的分布情况。RT—PCR检测hTERTmRNA表达水平,免疫组化检测hTERT蛋白表达的变化。TUNEL法观察肿瘤细胞的凋亡情况。结果体内分布实验表明,NGR／LPD复合物具有肿瘤靶向性,未经NGR修饰的ASODN、LPD及PEI／ASODN则极少分布在肿瘤组织中。NGR／LPD组的瘤体生长最为缓慢,其最大抑瘤率与其他各组相比具有显著差异（P〈0．05）,hTERT mRNA和端粒酶活性表达明显低于各对照组（P〈0．05）,hTERT蛋白表达量下降,肿瘤细胞的凋亡指数明显高于各对照组（P〈0．05）。结论NGR／LPD在体内有很好的肿瘤靶向性和抑制肿瘤细胞生长的作用。     

反义血管内皮生长因子原位表达抑制白血病细胞系K562在裸鼠体内生长并诱导其凋亡

目的观察反义血管内皮生长因子(anti-VEGF)原位表达对白血病细胞系K562在裸鼠体内生长的影响。方法选用白血病细胞系K562裸鼠体内接种成瘤后,肿瘤内注射重组反义VEGF真核表达质粒及空载体和PBS,检测反义VEGF体内转染情况及其对肿瘤生长的影响;免疫组化法比较实验组和对照组移植瘤微血管密度(MVD)及白血病细胞的凋亡情况。结果注射反义VEGF表达质粒能抑制肿瘤的生长,使肿瘤的MVD显著降低(25.6±5.77VS41±3.8,P<0.05),并且使肿瘤细胞凋亡增加。结论肿瘤内注射反义VEGF重组表达质粒在体内能有效转染肿瘤及其周围组织,反义VEGF体内的表达能抑制白血病细胞肿瘤的生长,降低肿瘤内MVD,促进白血病细胞的凋亡。反义VEGF基因治疗策略提供了一种新的白血病辅助治疗方案。     

靶向hTERT基因的microRNA前体质粒抑制鼻咽癌细胞生长的体内实验研究

目的 构建并筛选靶向人端粒酶逆转录酶基因的microRNA前体(pre-microRNA)质粒,通过体内实验验证该质粒对鼻咽癌CNE-2细胞生长的抑制作用.方法 设计3对针对hTERT基因不同位点的pre-microRNA(茎环结构的前体)片段,构建携带比序列的真核表达质粒(pre-miR-Htert1-3)并测序鉴定.脂质体法瞬时转染重组质粒到鼻咽癌CNE-2细胞,采用pre-time RT-PCR筛选出对hTERT基因表达抑制作用最强的质粒;在稳定转染的CNE-2细胞中,用软琼脂集落形成实验和Western blot进一步确认该质粒作用;在裸鼠体内实验中,观察肿瘤生长情况,并以免疫组化检测肿瘤中hTERT的表达.结果 重组质粒经测序证实构建成功.与PBS组相比,3种质粒分别使hTERT基因mRNA水平下降77.3%、15.1%和9.5%;筛先的出pre-miR-Htert1在稳定转染的CNE-2细胞中,使细胞hTERT蛋白下调、细胞集落形成能力下降;建立了人鼻咽癌裸鼠移植瘤模型,发现pre-miR-Htert1对裸鼠移植瘤生长抑制率为64.8%,并且使肿瘤内hTERT表达下降.结论 成功构建并筛选出靶向hTERT基因的pre-microRNA真核表达质粒,通过体外和体内实验证实,该质粒对鼻咽癌CNE-2细胞内的hTERT 基因表达具有明显抑制作用,并且有效抑制了肿瘤的生长.     

LncRNA MEG3对人脑胶质瘤细胞增殖、侵袭及凋亡的影响

目的 应用靶向长链非编码RNA母系表达基因3(LncRNA MEG3)的过表达重组质粒来转染体外培养的人脑胶质瘤细胞,从而观察其对人脑胶质瘤细胞增殖、侵袭和凋亡的影响.方法 应用qRT-PCR法检测正常脑组织细胞(N)和胶质瘤细胞系U251中LncRNA MEG3 mRNA的表达情况.构建pCI-MEG3真核过表达载体,转染体外培养的人脑胶质瘤细胞系U251,作为pCI-MEG3过表达质粒组(pCI-MEG3组);空pCI质粒转染体外培养的人脑胶质瘤细胞系U251,作为空载体pCI组(pCI组);无质粒转染的人脑胶质瘤细胞系U251,作为空白对照组(Control组).采用qRT-PCR 分析LncRNA MEG3基因表达变化,Western blot法分析LncRNA MEG3相关蛋白MDM2和p53表达变化,MTT法和细胞克隆技术分析胶质瘤细胞增殖能力,Transwell技术分析胶质瘤细胞侵袭能力,流式细胞技术分析胶质瘤细胞凋亡率.结果 与正常脑组织细胞比较,胶质瘤细胞中LncRNA MEG3 mRNA表达水平降低.体外实验显示,与Control组和pCI 组比较,pCI-MEG3组 LncRNA MEG3 mRNA 及 p53蛋白表达水平均有上调(P＜0.05),MDM2蛋白表达下调(P＜0.05),细胞增殖能力受到抑制(P＜0.01),细胞侵袭能力也受到抑制(P＜0.01),细胞凋亡率升高(P＜0.01).结论 人脑胶质瘤细胞中LncRNA MEG3的表达水平低于正常人脑组织细胞,靶向LncRNA MEG3基因的过表达重组质粒能够增加人脑胶质瘤细胞内LncRNA MEG3的表达,从而抑制胶质瘤细胞的增殖和侵袭能力,同时增加其凋亡率.     

HOXA4调控Wnt/β-cateni n信号通路对裸鼠移植胶质瘤的抑制作用

目的：建立人胶质瘤荷瘤裸鼠模型,探讨HOXA4对胶质瘤U251细胞体内生长的影响以及对Wnt/β-catenin信号通路的调控作用及其机制。方法：采用慢病毒转染,建立胶质瘤U251细胞稳转同源异型盒基因A4（HOXA4） siRNA细胞系（si-HOXA4）和稳转空载体阴性对照U251细胞系（si-NC）。取对数生长期U251、si-NC和si-HOXA4细胞接种于BALB/c裸鼠颈背部皮下,建立荷瘤裸鼠模型,命名为对照组、si-NC组和si-HOXA4组。观察各组裸鼠成瘤情况并绘制肿瘤生长曲线;培养21 d处死裸鼠后剥离肿瘤组织,测量肿瘤体积和质量;qRT-PCR法检测各组裸鼠肿瘤组织中HOXA4、CTNNB1和Gsk3β mRNA相对表达量;免疫组织化学（IHC）法检测各组裸鼠肿瘤组织中HOXA4、β-catenin、Gsk3β、CyclinD1和P53蛋白表达水平。结果：si-HOXA4组裸鼠肿瘤体积和质量小于si-NC组和对照组（P<0.05）;si-HOXA4组裸鼠肿瘤组织中HOXA4 mRNA相对表达量和HOXA4蛋白表达水平低于其他2组（P<0.05）;与si-NC组和对照组比较,si-HOXA4组裸鼠肿瘤组织中CTNNB1 mRNA相对表达量降低（P<0.05）,β-catenin和CyclinD1蛋白表达水平亦降低（P<0.05）,但Gsk3β和P53蛋白表达水平明显升高（P<0.05）。结论：抑制人胶质瘤U251细胞HOXA4表达可在体内通过Wnt/β-catenin信号通路调控CyclinD1和P53蛋白的表达,从而抑制荷瘤裸鼠肿瘤的生长。     

婴儿双歧杆菌介导HSV-TK/GCV自杀基因治疗系统对裸鼠肾细胞癌肿瘤细胞凋亡及NF-κB活性的影响

目的：证实婴儿双歧杆菌（bifidobacterium infantis,BI）介导单纯疱疹病毒胸苷激酶（herpes simplex virus thymidine ki－nase,HSV-TK）/丙氧鸟苷（ganciclovir,GCV）自杀基因系统对裸鼠肾癌的治疗作用,检测其诱导裸鼠肾癌组织细胞凋亡的作用及对核因子-κB（nuclear factor-κB,NF-κB）信号通路的影响。方法：引瘤后原代细胞培养注射细胞悬液法建立裸鼠皮下荷瘤肾癌模型,并随机分为BI-pGEX-TK/GCV组（重组质粒组）、BI-pGEX-5X-1/GCV组（空质粒组）、BI/GCV组（空ＢＩ组）和生理盐水/GCV对照组（生理盐水组）。分别经尾静脉注射BI-pGEX-TK、BI-pGEX-5X-1、BI和生理盐水,联合腹腔注射GCV,4周后,称取裸鼠质量及肿瘤质量。TUNEL法检测各组肿瘤细胞凋亡情况,qRT-PCR、Western blot检测各组肿瘤组织Rel A、Caspase-3 mRNA及蛋白表达水平。结果：（1）重组质粒组荷瘤裸鼠体质量明显高于其余3组（P=0.006）,肿瘤组织质量明显降低（P=0.003）。（2）TUNEL法检测发现各组均有不同程度的肿瘤细胞凋亡,以重组质粒组最为明显（P=0.000）。（3）与空质粒组、空BI组及生理盐水组比较,重组质粒组Rel A蛋白表达明显下调（P=0.000）,Caspase-3蛋白表达明显上调（P=0.000）。结论：BI介导HSV-TK/GCV自杀基因系统对荷瘤裸鼠肾癌有明显的抑制作用,可能通过影响NF-κB信号通路的活性,诱导荷瘤裸鼠肾癌肿瘤细胞的凋亡,发挥抑癌作用。     

靶向生存素siRNA抑制人喉鳞癌裸鼠动物模型的实验研究

目的 研究靶向生存素siRNA对喉鳞癌动物模型的抑制作用,探讨其可能的抑瘤机制.方法 建立人喉鳞癌裸鼠移植瘤模型,将33只裸鼠随机分为3组,对照组瘤体内注射PBS液,空载体组瘤体内注射空慢病毒载体(Ad-control),治疗组应用生存素siRNA (Ad-survivin)进行瘤内注射治疗,观察各组肿瘤生长情况,光镜及透射电镜观察肿瘤超微结构变化,TUNEL法检测细胞凋亡,免疫组化法检测Bcl-2蛋白的表达情况.结果 治疗组体内注射生存素siRNA(100 ng·mL-1·d-1),裸鼠肿瘤生长受到明显抑制,与对照组及空载体组相比,差异有统计学意义(P＜0.05).光镜、电镜下观察到治疗组肿瘤组织发生坏死和凋亡改变,Tunel证实治疗组肿瘤细胞凋亡数目明显增多,与对照组及空慢病毒组相比,差异有统计学意义(P＜0.05),免疫组化示治疗组Bcl-2表达下降.结论 生存素siRNA抑制喉鳞癌裸鼠生长,其作用机制可能与抑制Bcl-2表达诱导肿瘤细胞凋亡相关.     

一个编码4个不同基因RNAi的shRNA质粒的构建及其对CNE-2Z细胞增殖、凋亡和小鼠鼻咽癌移植瘤的影响

目的：构建同时表达VEGF、c-myc、survivin和hTERT基因的shRNA真核表达质粒,研究其对人鼻咽癌细胞系CNE-2Z的干扰作用。方法：根据VEGF、c-myc、survivin和hTERT基因序列,各设计2条寡核苷酸序列,合成互补DNA链,插入真核表达质粒pGenesil-1中,同时构建单基因（VEGF）质粒pGenesil-2。分别转染CNE-2Z细胞,分为多基因质粒（P-1）组和单基因质粒（P-2）组,并设空白对照（BC）组和阴性对照（NC）组。采用MTT法检测细胞增殖活性。采用实时定量PCR和Western-blot检测4种基因在人鼻咽癌细胞系CNE-2Z中的表达。体内裸鼠成瘤实验观察单基因和多基因质粒干预对肿瘤的抑制作用。结果：通过酶切和测序证实重组真核表达载体构建正确。MTT显示细胞增殖受到抑制,且多基因质粒对细胞增殖的抑制作用明显强于单基因质粒。目的基因在mRNA和蛋白水平上表达均下降。裸鼠实验显示P-1组抑制肿瘤细胞增长的作用要强于P-2组。结论：成功构建一个载体编码4个不同基因的shRNA质粒载体系统。转染鼻咽癌细胞后,与单独沉默VEGF相比,同时干扰VEGF、c-myc、survivin和hTERT基因可以更好地抑制细胞增殖。     

人21．5kDaMBP基因沉默对神经胶质瘤细胞增殖与凋亡的作用研究

目的：研究人21．5kDa人脑髓鞘碱性蛋白（MBP）基因沉默对神经胶质瘤U251细胞增殖与凋亡的影响。方法将21．5kDaMBP序列特异性短发夹RNA（shRNA）重组质粒pGenesil‐1‐MBP‐3转染神经胶质瘤细胞株（U251）作为MBP基因沉默组,以空质粒转染为阴性对照组,脂质体转染为脂质体空转组;用实时定量PCR（RT‐PCR）和Westernblot方法检测各组21．5kDaMBPmRNA和蛋白的表达水平,CCK‐8法测定细胞增殖曲线,流式细胞法分析细胞凋亡率。结果与阴性对照组相比,MBP基因沉默组细胞中21．5kDaMBP在mRNA和蛋白水平的表达均显著下降（P＜0．05）、细胞增殖活性明显降低（P＜0．05）、细胞凋亡率显著增高（P＜0．05）。结论人21．5kDaMBP基因沉默对神经胶质瘤细胞U251具有显著的抑制增殖和促进凋亡的双重调节作用。     

高脂对家兔免疫功能的影响

目的探讨高脂喂养对家兔血脂水平及动脉粥样硬化的影响。方法将23只家兔随机分为二组:A组为高脂喂养组(n=20),B组为正常饲料喂养组(n=3);为对照组。分别于高脂喂养前、喂养后2w、4w、8w和12w取家兔耳缘静脉取血各1次,行血清总胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白和低密度脂蛋白测定。结果A组高脂喂养2w后血清总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白水平较高脂喂养前及对照组均明显升高(P0.01)。而4w后高密度脂蛋白也明显升高(P0.01)。结论家兔血脂水平在高脂喂养2-4w即达峰值,并开始下降,而其促动脉粥样硬化作用将延续。     

辅助诊断冠心病新指标探讨

目的 研究总胆红素(TBIL)、直接胆红素(DBIL)、间接胆红素(IBIL)、高敏C反应蛋白(hs-CRP)、同型半胱氨酸(HCY)等新指标与冠心病的关系.方法 选取2014年12月至2016年4月在我院心内科住院并行冠脉造影的患者497例,其中冠心病组333例,非冠心病组164例.记录每例患者的基本资料,以及TBIL、DBIL、IBIL、hs-CRP、HCY等检测水平,分析各项指标与冠心病的关系.结果 冠心病组患者的TBIL、IBIL明显低于非冠心病组[(10.54±3.5)μmol/L vs(14.03±3.78)μmol/L,(7.85±2.73)μmol/L vs(11.44±3.24)μmol/L],而hs-CRP、HCY明显高于非冠心病组[(6.91±3.15)mg/L vs(3.24±2.21)mg/L,(11.79±3.80)μmol/L vs(6.87±2.40)μmol/L],差异均有显著统计学意义(P<0.01);两组患者的DBIL比较差异无统计学意义[(3.46±1.55)μmol/L vs(3.68±1.54)μmol/L,P>0.05);随着冠心病冠脉病变支数的增加,TBIL、IBIL逐渐降低(P<0.01),hs-CRP、HCY逐渐增加(P<0.01),而DBIL随冠心病的病变支数增加则无明显变化(P>0.05);多因素Logistic回归分析结果显示,TBIL、IBIL与冠心病的发生呈负相关性(OR分别为0.838、0.787,P<0.01);DBIL与冠心病的发生未见明显相关性(P=0.651);hs-CRP、HCY与冠心病的发生呈现正相关性(OR分别为1.399、1.539,P<0.01).结论 TBIL、IBIL水平降低,hs-CRP、HCY水平升高与冠心病密切相关,低水平TBIL、IBIL与高水平hs-CRP、HCY均为冠心病患者的独立危险因素,可以作为评估冠状动脉病变的辅助新指标.     

TPO对体外巨核细胞增殖、分化的影响

目的研究血小板生成素(TPO)对人巨核细胞白血病细胞(DAMI)增殖、分化的影响。方法采用体外培养巨核细胞,将不同浓度TPO加入细胞培养液,CCK-8法检测TPO最佳刺激浓度;培养液中加入TPO,台盼蓝检测细胞增殖活力,巨核细胞乙酰胆碱脂酶染色检测细胞集落。流式细胞仪检测巨核细胞CD4l表达。结果 TPO浓度为250ng/ml时刺激作用明显。培养液中加入TPO后,巨核细胞集落计数、CD4l表达均明显增加。结论 TPO促进体外巨核细胞增殖、分化。     

交联聚乙烯基吡咯烷酮的合成及其性能研究

以乙烯基吡咯烷酮（NVP）为单体，二乙烯基苯为交联剂，AIBN为引发剂，采用悬浮聚合法合成了性能稳定的交联聚乙烯基吡咯烷酮（PVPP），研究了聚合温度，引发剂用量，交联剂用量和反应气氛等因素对产率，溶胀性能和吸附性能的影响，并用红外光谱和扫描电镜等对产物的结构、性能和表面形貌进行了表征。     

固本保元浸膏敷脐对大鼠溃疡性结肠炎氧自由基及其清除作用的影响

目的:研究固本保元浸膏对溃疡性结肠炎治疗作用.方法:应用大鼠溃疡性结肠炎的模型,给予固本保元浸膏敷脐,观察固本保元浸膏(GE)对大鼠血液和组织中氧自由基清除能力.结果:研究表明,GE能提高血液和组织中SOD及GSH-PX活性,降低LPO的含量,与病理组比较有显著差异(p＜0.01,P＜0.001).结论:固本保元浸膏具有抗自由基及其清除的能力.     

安定治疗异烟肼急性中毒的实验研究

对异烟肼(INH)急性中毒的小白鼠,腹腔注射安定(DZ)25mg/Kg有明显的保护作用。在1～3倍LD_(50)INH中毒时,DZ使所有动物免于死亡;对6倍LD_(50)INH中毒者,DZ虽未能降低死亡率,但能明显延长动物的存活时间。本文还就作用原理加以讨论。     

血液灌流对长期血液透析病人各项指标改善的临床研究和护理体会

目的:探讨血液灌流、血液透析联合治疗比单独血液透析治疗尿毒症的优越性。方法:回顾分析66例使用血液灌流血液透析联合治疗患者,随机抽取其中30例,计算肌酐、尿素氮、中分子毒素(middlemoleculesubstancesMMS)下降率,患者睡眠、食欲、高血压、皮肤瘙痒等症状改善情况,另以30例单纯运用血液透析患者作对照,比较其透析效果。结果:血液灌流、血液透析联合治疗患者透后血肌苷和尿素氮均下降60%,顽固性皮肤瘙痒等临床症状明显改善,无明显并发症,其透析效果远远超出单纯血液透析患者。结论:血液灌流是一种安全、有效的方法,配合血液透析使用可以提高患者生存质量,延长患者生命。     

缺氧缺血(HI)新生大鼠脑损伤后NO水平的变化及GM1对其影响

目的:观察新生大鼠缺氧缺血性(HI)脑损伤后NO水平的变化,探讨单唾液酸四己糖神经节苷脂(GM1)对NO水平的影响.方法: 选择新生7日龄Sprague-Dawley大鼠108只,随机分为三组:缺氧缺血组(HI组,36只),假手术对照组(Control组,36只),缺氧缺血 神经节苷脂组(GM1组,36只) .采用结扎右侧颈总动脉并吸入低氧混合气体制备HIBD模型.采用镀铜镉还原法测定血浆一氧化氮(NO)水平.结果: Control组、HI组、和GM1组新生大鼠血浆NO-2/NO-3含量分别为(41.6±8.9 ) 、(60.9±14.7 )和(43.8±10.6) μmol/L.HI组明显高于对照组和GM1组(P<0.05);GM1组与对照组比较,无明显差异(P>0.05).结论:GM1能抑制新生大鼠缺氧缺血性(HI)脑损伤后NO生成,对缺氧缺血(HI)新生大鼠的脑具有保护作用.     

咽喉草对肝功能的影响

本文于正常及四氯化碳(CCl_4)引起的肝功能损害大鼠上观察了咽喉草提取物的胆汁分泌及保护肝功能的作用,实验表明咽喉草水溶性及脂溶性生物碱液,对正常大鼠有一定的促胆汁分泌作用:预先给药并连用6日,对CCl_4(0.5ml/kg)引起的肝功能损害有保护作用,对照组(n=14)SGPT170.3±15.6u ml,水溶性生物碱(n=5)及脂溶性生物碱液(n=10) 分别为59.0±33.6及96.2±60.0。     

四君子汤对小鼠免疫功能的影响

本文观察了四君子汤对正常小鼠和免疫抑制小鼠免疫功能的影响。实验发现每日灌服该中药煎剂15g/kg体重,连续6日,能纠正免疫抑制剂地塞米松或环磷酰胺的免疫抑制作用,使免疫抑制小鼠的巨噬细胞吞噬率、淋巴细胞转化率、外周血ANAE~+淋巴细胞比率以及血清特异性抗体水平均有显著的回升。同时观察到该方剂对正常小鼠有促进细胞免疫、抑制体液免疫的作用,对巨噬细胞吞噬功能无显著影响。结果表明四君子汤有调节机体免疫功能的作用。