多肽:N-乙酰氨基半乳糖转移酶2的原核表达、纯化及酶活检测

目的：以人类多肽：N-乙酰氨基半乳糖转移酶2（ppGalNAc-12）为研究对象，利用载体pGEX-5X-3在大肠杆菌（E．Coli）BL21中原核表达其编码序列，并对表达产物进行纯化、复性及酶活检测。方法：首先利用PCR技术从克隆载体pDONR201-T2得到ppGalNAc-T2全长编码序列，将其亚克隆至原核表达载体pGEX-5X-3，形成重组表达质粒pGEX-5X-3／T2。重组质粒转化大肠杆菌DH5α，测序鉴定后转化BL21，异丙基硫代半乳糖（IPTG）诱导后，表达产物为主要以包涵体形式存在的融合蛋白。对其复性后用谷胱甘肽-琼脂糖（Glutathione-Sepharose）4B亲和层析柱进行纯化。然后根据ppGalNAc-T2的催化功能，设计底物，建立酶促反应体系，利用高效液相色谱（HPLC）进行酶活分析。结果：成功构建了原核表达重组载体pGEX-5X-3／T2，通过蛋白质电泳检测到分子量约为90 kD的融合蛋白的表达，利用亲和层析得到纯化的酶蛋白，并经Western印迹得以验证。反应后体系上柱洗脱后出现酶促反应的产物洗脱峰。结论：成功构建了重组表达载体pGEX-5X-3／T2，ppGalNAc-T2伞长编码序列被成功表达、纯化及复性，检测到具有酶活性。     

血管内皮生长因子受体结合肽介导颗粒酶靶向性抗肿瘤血管生成

目的：观察血管内皮生长因子受体（VEGFR）结合肽－颗粒酶B（GraB）融合蛋白抗血管生成的作用。方法：抽提人外周血淋巴细胞总RNA，进行RT－PCR克隆GraBcDNA；抽提LoVo细胞总RNA，进行RT－PCR克隆VEGFR结合肽cDNA，用限制性酶切和DNA测序进行鉴定，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS－PAGE）分析表达产物，表达产物经亲和层析纯化后，以人血管内皮细胞（ECV304）和鸡胚尿囊膜血管测定其生物学活性。结果：表达产物以可溶性分子形式存在于菌体中，具有良好的抗原性和特异性，且具有抑内管内皮细胞增殖及破坏鸡胚尿囊膜血管形成的活性，结论：VEGFR结合肽－GraB融合蛋白具有抑制血管生成的功能，在肿瘤生物靶向治疗中有一定潜在价值。     

卫氏并殖吸虫基因片段的亚克隆及其表达的研究

目的：获得诊断肺吸虫病的特异性重组抗原，以了解其作为免疫诊断抗原的价值。方法：将免疫筛选获得的卫氏并殖吸虫基因克隆双酶切，所得cDNA片段亚克隆入表达载体pRESETB，经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导表达，以聚丙烯凝胶电泳（SDS-PAGE）和免疫印迹法（Western blotting)对表达产物进行鉴定。结果：成功地将文库中2个大小不同的卫氏并殖吸虫基因片段连接到载体中，其中Pw-2重组子特异性表达产物是分子质量约为32ku的蛋白带，可被卫氏并殖吸虫免疫免血清特异性识别。结论：成功构建了编码卫氏并殖吸虫特异性抗原的重组克隆Pw-2。     

人TRAIL分子胞外区的克隆及新型表达载体的构建

目的：利用基因工程技术克隆人TRAIL分子胞外区41－281片断的cDNA，构建其原核表达载体，从而建立原核表达体系。方法：采用RT－PCR方法从人早幼粒白血病细胞系HL－60的总RNA中扩增TRAIL分子41－281片断的cDNA，以限制性酶切和DNA测序进行鉴定，并将目的片断克隆至原核表达载体pQE-80L。结果：克隆到人TRAIL分子41－281片断的cDNA,DNA测序结果与报道的完全一致；构建了该片断的原核表达载体，为后续基因工程研究打下了基础。结论：成功克隆人TRALL分子41－281片断的cDNA并构建了其原核表达载体。     

大鼠寡霉素敏感相关蛋白原核表达载体的构建

目的:克隆大鼠寡霉素敏感相关蛋白(OSCP)基因全长cDNA,构建原核表达载体pQE30-Xa-OSCP。方法:利用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术从大鼠脑组织中扩增出目的基因,先以A-T连接方式克隆到pTA2载体中,再将其克隆到原核表达载体pQE30-Xa中,并进行酶切、测序鉴定。结果:RT-PCR扩增出约700bp特异性片段,重组原核表达载体经酶切鉴定结果同预期相符,经测序鉴定序列同源性与GeneBank报道一致。结论:成功构建了重组原核表达载体pQE30-Xa-OSCP。     

人肥胖基因的克隆与原核表达载体的构建

目的：克隆人肥胖基因瘦素蛋白（leptin）编码区cDNA序列，并构建其原核表达载体。 方法：在人体脂肪组织中提取mRNA，利用RT-PCR扩增人肥胖基因，将其插入pMD18-T载体，经双酶切、鉴定后将肥胖基因片段亚克隆入pET-28a表达载体，提取质粒。将阳性重组质粒转化表达受体菌E.coliBL21(DE3)，经IPTG诱导肥胖基因表达产物,以聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）检测产物蛋白。 结果：经测序证实获得的肥胖基因序列与相关文献报道一致，其表达产物的相对分子质量约为20 000。 结论：利用pMD18-T克隆载体和pET-28a表达载体可以有效地在原核生物中表达重组人类瘦素蛋白。     

蜂毒肽表达克隆的初步构建

（1）目的 构建重组蜂毒肽的原核表达克隆。（2）方法 人工合成含特异性酶切位点的A,B两条寡核苷酸片段,在Klenow酶作用下形成目的基因,用限制性内切酶HindⅢ,XmnI同时酶切目的基因和表达载体Pmal-p2质粒,在T4连接酶的作用下构建两者的重组体,通过α-互补筛选出阳性克隆,并通过特异性酶切和测序分析进行鉴定。（3）结果 筛选出的阳性克隆为重组的蜂毒肽表达克隆。（4）结论 用分子生物学的方法重组构建的蜂毒肽基因表达克隆,是蜂毒肽蛋白表达及活性鉴定的基础。     

Sjcb2基因原核表达载体的构建及表达

目的 探讨日本血吸虫（Schistosoma japonicum，Sj）中国大陆株（Chinese strain）组织蛋白酶B肽链内切酶基因（Cathepsin B endopeptidase）的原核表达载体pWR450-1的构建及表达情况。方法根据Genbank中Cathepsin B endopeptidase全序列（Genbank登录号为AY226984）设计特异性引物应用聚合酶链反应技术扩增基因全长，克隆入pUCm—T载体，酶切后亚克隆入原核表达载体pWR450-1并进行表达；利用SDS—PAGE及Western blotting观察日本血吸虫组织蛋白酶B肽链内切酶表达情况。结果成功构建了Sjcb2／pWR450-1原核表达重组质粒，该重组质粒在大肠杆菌中可经IPTG诱导表达分子量约为86kD的融合蛋白，Western blotting分析表明，该融合蛋白能被兔阳性血清所识别。结论 日本血吸虫组织蛋白酶B肽链内切酶可在原核表达载体pWR450-1中表达，为研究其功能打下了必要的基础。     

人心脏发育相关基因ZNF382的原核表达及多克隆抗体的制备

目的 表达、纯化ZNF382融合蛋白及制备兔多克隆抗体.方法 通过PCR扩增ZNF382编码区,将其克隆到pRSET C载体中,重组载体酶切鉴定,测序,转化大肠杆菌BL21(DE3)并用IPTG进行诱导表达,原核表达产物经鉴定、纯化后,免疫新西兰大白兔.通过ELISA和Western blot检测抗血清的效价和特异性.结果 成功构建了pRSET C-ZNF382原核表达重组质粒,His6-ZNF382融合蛋白被强烈诱导表达,以包涵体的形式存在,其相对分子质量约为 64×103,纯化后免疫产生的多克隆抗体效价约为1∶10 000,与ZNF382原核表达蛋白特异性结合.结论 获得了大量高效价、高特异性的兔抗人ZNF382多克隆抗体.     

大鼠血红素氧化酶 1的基因克隆和原核表达

目的：从大鼠脾中克隆出血红素氧化酶1（RHO-1）基因，构建其原核表达载体，并在大肠杆菌中表达其蛋白。方法：用RT-PCR从大鼠脾总RNA中扩增出RHO-1 cDNA，并将其克隆入pMD18-T载体， 经TA克隆测序分析后,将阳性TA克隆RHO-1片段亚克隆入pET28a(+)原核表达载体，转化大肠杆菌BL-21，经限制性内切酶图谱鉴定后，阳性菌株经IPTG诱导，SDS-PAGE分析。结果：TA克隆测序分析证实该基因全长870 bp,编码289个氨基酸,所克隆的基因序列与GenBank中登录的RHO-1基因序列完全一致；限制性内切酶图谱结果表明成功构建了RHO-1的原核表达载体；SDS-PAGE结果显示RHO-1基因在大肠杆菌中获得表达。结论：用RT-PCR正确克隆RHO-1基因，构建pET28a(+)/RHO-1表达载体，并成功表达RHO-1融合蛋白。     

血管内皮生长因子受体结合肽介导颗粒酶B靶向性抗肿瘤血管生成

目的　观察血管内皮生长因子受体 (VEGFR)结合肽 -颗粒酶 B(Gra B)融合蛋白抗血管生成的作用 .方法　抽提人外周血淋巴细胞总 RNA,进行 RT- PCR克隆 Gra B c DNA;抽提 L o Vo细胞总 RNA,进行 RT- PCR克隆 VEGFR结合肽c DNA,用限制性酶切和 DNA测序进行鉴定 ;通过聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS- PAGE)分析表达产物 .表达产物经亲和层析纯化后 ,以人血管内皮细胞 (ECV30 4 )和鸡胚尿囊膜血管测定其生物学活性 .结果　表达产物以可溶性分子形式存在于菌体中 ,具有良好的抗原性和特异性 ,且具有抑制血管内皮细胞增殖及破坏鸡胚尿囊膜血管形成的活性 .结论　 VEG-FR结合肽 - Gra B融合蛋白具有抑制血管生成的功能 ,在肿瘤生物靶向治疗中有一定潜在价值     

人granzyme B基因在HeLa细胞中的表达

目的 构建携带人granzyme B基因的真核表达载体，并将其在HeLa细胞中的表达。方法 用反转录PCR获取人granzyme B全长cDNA序列，将其活性型序列克隆进pcD-NA3重组表达质粒。脂质体法转染HeLa细胞，间接免疫荧光检测目的蛋白表达，HE染色观察其对转染HeLa细胞形态的影响。结果工成功获得了野生型granzyme B cDNA，构建了编码活性型granzyme B的真核表达载体pcDNA3-G。转染HeLa细胞后观察到目的的蛋白表达，转染细胞形态发生变化，出现多核大细胞及固缩小细胞。结论 活性型granzyme B哺乳动物表达系统的建立，为进一步研究granzyme B的生物学效应奠定了基础。     

人EC-SOD的克隆及高效表达

将编码人胞外超氧化物歧化酶（EC-SOD）成熟肽的cDNA插入含T7启动子的质粒pET-28a( )中构建表达质粒pET-EC-SOD，表达菌株用1mmol/L异丙基硫代-β-D半乳糖苷（IPTG）诱导表达3h-5h后，产生较多的重组人EC-SOD，并形成包含体。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析表明，表达的重组蛋白占菌体可溶性蛋白质的26%以上。经纯化和复性后的EC-SOD比活为每毫克纯化酶蛋白1200U。将EC-SOD转染粉纹夜蛾Tn-5Bl-4细胞，经扩增后在细胞内进行表达。SOS-PAGE分析结果表明，粉纹夜蛾细胞中表达一相对分子质量约为28ku的特异蛋白质带，Western blot分析表明，该特异条带即为EC-SOD蛋白，连苯三酚自氧化法测得表达产物比活为每毫克细胞裂解物260U。     

人钠/二羧基转运蛋白2融合蛋白载体的构建及其原核表达

目的：观测和鉴定人钠／二羧基转运蛋白2(hSDCT2)在大肠杆菌中的表达，并分离、纯化其蛋白产物。方法：应用：DNA重组技术，构建重组表达质粒pGEX-hSDCT2；IPTG诱导其表达。采用谷胱甘肽偶联的Sepharose4B亲和层析纯化GST-hSDCT2，经Factor Xa酶切和二次亲和层析后，采用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western Blotting进行鉴定。结果：成功构建hSDCT2基因融合蛋白载体，SDS-PAGE及Western Blotting显示GST-hSDCT2融合蛋白表达于原核细胞，蛋白产量约占菌体总蛋白量的25％。经酶切及二次纯化后，获得纯化的hSDCT2蛋白。结论：人钠／二羧基转运蛋白2可在大肠杆菌中稳定表达。     

luxS基因敲除临床分离大肠杆菌株生物膜形成能力的变化

目的探讨LuxS基因对临床分离大肠杆菌生物膜形成能力的影响。方法以临床分离大肠杆菌S17为研究对象,PCR分别扩增S17 LuxS基因的上下游序列和质粒pEGFP-N1的卡那抗性基因,分别连入T载体pAT2,再通过酶切连接的方法分别将LuxS基因的上、下游序列连接入pAT2-kana质粒,构建同源重组质粒pAT2-△luxS,同源重组质粒转化大肠杆菌DH5α扩增后,提取质粒后双酶切获得同源重组片段,将同源重组片断电转入感受态S17,通过同源重组构建LuxS基因缺失的S17,96孔板结晶紫染色法分析LuxS基因缺失株生物膜形成能力的变化。结果 LuxS基因缺失株基因组PCR扩增出1678的片断,测序鉴定正确,成功构建临床分离大肠杆菌S17 LuxS基因缺失株,S17与S17LuxS基因缺失株形成生物膜的微孔板法半定量OD值的结果分别为(1.51±0.09)和(0.43±0.13)。结论 LuxS基因对细菌生物膜的形成具有重要调控作用。     

人肝脏再生增强因子cDNA的克隆、表达及纯化

克隆人肝脏再生增强因子（ｈＡＬＲ）ｃＤＲＮＡ,构建重组表达载体并对其诱导表达,纯化。方法：提取胎儿肝组织总ＲＮＡ,利用ＲＴ－ＰＣＲ技术扩增出ｈＡＬＲｃＤＮＡ,克隆于载体ｐＧＥＭ－Ｔ,酶切鉴定后亚克隆至表达载体ｐＧＥＸ－４Ｔ－３,测序证实序列正确并转化大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）,ＩＰＴＧ诱导表达融合蛋白ＧＳＴ－ｈＡＬＲ,表达物通过谷胱甘肽Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ亲和层析纯化后进行Ｔｈｒｏｍｂｉｎ酶切,     

人胶质细胞源性神经营养因子(hGDNF)成熟肽基因的克隆及原核表达

目的分离人胶质细胞源性神经营养因子(hGDNF)成熟肽基因，并在E．coil中获得表达。方法以人的白细胞基因组DNA为模板，合成特异引物，采用PCR技术分离得到hGDNF成熟肽基因，并构建表达载体pET-21a( )-hGDNF，转化大肠杆菌BL21(DE3)，分别用IPTG和乳糖诱导表达，SDS-PAGE电泳检测hGDNF蛋白表达。结果PCR扩增出了400bp的DNA片段，构建的表达载体pET-21a( )-hGDNF经酶切、PCR鉴定均出现400bp左右的条带，测序结果正确，用IPTG或乳糖诱导转化菌均有15kd大小的目的条带，表达的目的蛋白占菌体总蛋白30％以上，以包涵体形式存在。结论克隆得到人GDNF成熟肽基因并在大肠杆菌中得到了高效表达。     

重组mOP-1原核细胞高效表达和纯化的研究

①目的 探讨重组mOP-1(rmOP-1)的克隆化、原核高效表达载体的构建以及rmOP-1制备和纯化简单有效方法。②方法 于胎龄为2周的CD-1小鼠胚胎组织中提取、纯化mRNA，应用ligo(dT)引物反转录酶合成cDNA，PCR筛选扩增OP-1全长开放读框，产物TA克隆人质粒载体pCR3．1-Uni；亚克隆人高效原核表达载体pTrcHis2B，经大肠杆菌JM109、IPTG诱导表达rmOP-1蛋白；经Ni-NTA树脂纯化，SDS-PAGE分析。③结果 限制性酶切分析、DNA测序确认mOP-1的全长开放读框，Ni—NTA亲和层析纯化重组蛋白PAGE分析满意。④结论 胚胎期约2周的CD-1小鼠有OP-1mRNA的高水平表达，RT—PCR筛选OP-1全部开放读框，产物TA克隆化方法便捷，原核高效表达质粒pTrcHis2B能够方便、快速回收和纯化重组蛋白。     

小鼠TSR2-3/TSP-1基因片段的克隆及其GST融合蛋白的表达和纯化

目的：获取小鼠TSR2—3／TSP-1基因片段，并高效表达和纯化GST—TSR2—3融合蛋白。方法：应用RT—PCR技术，从小鼠肺总RNA中，获得编码TSR2—3的基因片功能片段，测序后，通过酶切克隆至表达载体pGEX-5X-2，构建重组表达载体，并导入E.coli BL21宿主菌中，IPTG诱导表达重组的GST融合蛋白，亲和层析纯化表达产物，SDS—PAGE和Westem blot进行分析鉴定。结果：获得小鼠TSR2-3基因片段，测序结果与GenBank的基因序列一致，重组GST融合蛋白经SDS-PAGE和Westem blot分析，在相对分子量39kDa处，出现特异性蛋白条带，重组蛋白经GST亲和层析柱纯化后，得到了高纯度的融合蛋白。结论：成功克隆小鼠TSR2—3基因片段，并在Ecoli BL21中高效表达，亲和层析后获得高纯度GST—TSR2—3融合蛋白。