不同浓度雌激素对人源性牙周膜干细胞成骨分化能力的影响

目的：对比研究不同浓度的雌激素对人源性牙周膜干细胞成骨分化的影响。方法：采用DMEM完全培养基将人牙周膜干细胞制成单细胞悬液,分别加入浓度为0、10×10^-10、10×10^-9、10×10^-8、10×10^-7、10×10^-6、10×10^-5mol/L的雌激素,以未加入雌激素的成骨诱导液组（普通DMEM培养基中加入10mMβ-甘油磷酸钠、50μM维生素C及10nM地塞米松）作为阴性对照。培养后实时定量PCR方法分别检测成骨早中晚期关键指标Runx2、ALP和OCN mRNA表达。结果：浓度为10×10^-10、10×10^-9、10×10^-8、10×10^-7、10×10^-6、10×10^-5mol/L的雌激素对人源性的牙周膜干细胞培养均无毒性;不同浓度组间差异无统计学意义（P＞0.05）;在成骨诱导7、14、21天时,Runx2、ALP及OCN mRNA表达在10×10^-7组最高（P＜0.05~0.01）。在不同浓度雌激素组中成骨相关基因的表达均高于阴性对照组（P＜0.05）。结论：当雌激素浓度＜10×10^-7mol/L时,雌激素能够以剂量依赖的方式促进人牙周膜干细胞成骨分化过程中成骨相关基因的表达。当雌激素浓度＞10×10^-7mol/L时,雌激素浓度的增加并未促进成骨相关基因的表达。     

Smad蛋白在BMP-2诱导成骨分化过程中的作用

目的研究Smad蛋白在骨形态发生蛋白-2（BMP-2）诱导成骨分化过程中作用,探讨Smad蛋白在成骨分化期间信号传导的机制。方法将取自MDX大鼠颅盖骨组织分离获得成骨细胞进行培养,培养的成骨细胞分组,加入不同浓度的BMP-2或BMP-2与Trx2SARA混合物后,用反义PCR和Western Blot斑点杂交对各组诱导成骨分化的情况进行分析。体内实验中肌肉局部埋植BMP-2或BMP-2和Trx2SARA,取不同时间点处死动物,制备组织切片,用SO染色进行组织学观察。结果BMP-2处理的成骨细胞碱性磷酸酶增加,降钙素mRNA增加,Smad蛋白的表达水平呈剂量依赖性增加。Trx2SARA处理组出现碱性磷酸酶和降钙素mRNA下调。体内实验组织切片SO染色显示,BMP-2处理组大部分异位组织由增殖中、肥厚前和肥厚软骨细胞构成,而Trx2SARA处理组很少向软骨源细胞分化。结论Smad蛋白在BMP-2诱导成骨分化中发挥重要的信号传导作用。     

纯钛表面二氧化钛纳米管对人牙周膜干细胞增殖及成骨分化的影响

目的:探讨纯钛表面二氧化钛(TiO2)纳米管改性后对人牙周膜干细胞(human periodontal ligament stem cells,hPDLSCs)增殖?成骨分化能力的影响?评价TiO2纳米管改性作为种植体表面改性方法的作用?方法:将实验组钛片进行阳极氧化TiO2纳米管处理,对照组仅进行抛光处理?将hPDLSCs与两组钛材分别复合培养,检测其增殖及成骨相关蛋白的表达水平?结果:成功在钛材表面制备了多孔?有序?管径约为100 nm的TiO2纳米管;实验组hPDLSCs较对照组1 d的增殖活性及4 d的ALP活性没有明显差异;而4?7 d实验组细胞的增殖活性低于对照组;而7 d?14 d及21 d实验组细胞ALP活性高于对照组;21 d时,实验组 Col-I?OCN?Runx-2的基因表达水平明显高于对照组?结论:通过阳极氧化可在钛材表面制备多孔有序的TiO2纳米管层;且TiO2纳米管能有效促进hPDLSCs在钛表面的骨向分化?     

全反式维甲酸对人牙周膜细胞向成骨分化的影响

目的检测全反式维甲酸(AT-RA)对人牙周膜细胞(hPDLCs)向成骨分化的影响。方法原代培养hPDLCs,用噻唑盐(MTT)方法检测AT-RA作用于细胞hPDLCs及对其增殖的影响,用酶动力方法检测对其碱性磷酸酶(ALP)活性的影响,用茜素红染色方法检测对其形成钙盐沉积的影响。结果 AT-RA不影响hPDLCs的增殖活性,但能增强hPDLCs的ALP活性,并明显促进钙盐沉积。结论 AT-RA可以促进hPDLCs向成骨分化。     

purmorphamine促进人牙周膜干细胞应力成骨

目的研究purmorphamine在动态张应力促人牙周膜干细胞(human periodontal ligament stem cells,PDLSCs)向成骨细胞分化过程中的作用。方法分离培养鉴定PDLSCs,在矿化诱导环境中加入purmorphamine,采用Flexcell FX-4000T应力加载系统对细胞加力24 h,以Real-time PCR检测成骨相关指标Runx2、alkaline phosphatase(ALP)以及Hedgehog(Hh)通路的标志物GLI1、Pathed1(PTCH1)、Smoothend(SMO)。结果动态张应力作用24 h后,成骨相关指标Runx2、ALP,Hh通路的标志物GLI1、PTCH1、SMO的表达水平明显升高(P<0.05);加入purmorphamine后,成骨相关指标Runx2、ALP,Hh通路的标志物GLI1、PTCH1、SMO的表达水平较加力组均有增强,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 purmor-phamine可能通过激活Hh通路,进而增强人PDLSCs应力条件下向成骨细胞分化。     

侵入细胞内的牙龈卟啉单胞菌影响人牙周膜细胞的增殖及成骨分化

目的探究活体牙龈卟啉单胞菌（P. gingivalis）侵入人牙周膜细胞（HPDLCs）后,对细胞增殖性能及成骨向分化作用的影 响。方法将P. gingivalis与HPDLCs以感染复数（MOI）为10、100共培养90 min、8、24 h后,利用细胞侵袭实验比较不同时间及 MOI值下,P. gingivalis对HPDLCs的侵袭效能。用CFDA-SE（Carboxyfluorescein diacetate, succinimidyl ester, C29H19NO11） 标记HPDLCs,加入P. gingivalis后共培养8、24、48、72 h,流式细胞仪检测细胞增殖性能的变化。将SYTO9标记的P. gingivalis 与HPDLCs共培养24 h后,流式细胞荧光分选技术（Fluorescence activated Cell Sorting, FACS）分选出被感染细胞,利用实时荧 光定量PCR对Runx2基因进行检测,并且对分选出的细胞进行矿化诱导,分别于7、14、21 d,进行茜素红染色检测HPDLCs矿化 结节形成。结果P. gingivalis 与HPDLCs 共培养90 min 后,即可进入细胞内,共培养24 h 后,侵袭效能达到最大值。被P. gingivalis感染后,细胞的Runx2基因表达明显下调,且其矿化结节的形成明显低于对照组。结论侵袭进入HPDLCs内的活体 P. gingivalis,未对细胞的增殖产生明显的影响,但可以明显抑制细胞的成骨分化作用,这可能是通过下调Runx2 的表达来实 现的。     

炎症微环境下miR-30a调控Runx相关转录因子2对人牙周膜干细胞成骨分化的影响

目的:探究炎症微环境下微小RNA-30a(miR-30a)调控Runt相关转录因子2(Runx2)对人牙周膜干细胞成骨分化的影响.方法:体外培养人牙周膜干细胞(hPDLSCs),随机分为对照组、模型组、miR-30a mimics(模拟物)组、miR-30a mimics阴性对照组、miR-30a inhibitor(...     

Sirt1促进炎症牙周膜干细胞成骨分化的机制

目的 探讨去乙酰化酶1(Sirt1)对炎症牙周膜干细胞(PDLSCs)成骨分化的作用,并研究其可能的分子机制。方法 分离、培养正常及炎症PDLSCs,观察Sirt1在两种细胞中的表达;将炎症PDLSCs进行成骨诱导,同时使用Sirt1激动剂白芦藜醇上调炎症PDLSCs中的Sirt1,观察炎症PDLSCs的成骨分化情况,Western blot检测Runx2、乙酰化NF-κB、乙酰化FoxO1和FoxO1的表达。结果 炎症PDLSCs中Sirt1的表达较正常PDLSCs减少(P<0.01);白芦藜醇可上调炎症PDLSCs中Sirt1的表达;与成骨诱导组比较,成骨诱导+白芦藜醇组炎症PDLSCs中BSP(t=14.045,P<0.01)、Runx2(t=3.349,P<0.01)、OCN(t=7.218,P<0.01)和Osx (t=4.544,P<0.01)mRNA的表达增加,ALP染色增强(P<0.01);炎症PDLSCs成骨诱导后FoxO1(t=8.737,P<0.01)和Runx2(t=6.152,P<0.01)的表达增强;使用白芦藜...     

寡核苷酸YW002对人牙周膜干细胞增殖、周期、凋亡和早期成骨分化的影响

目的：探讨免疫刺激型寡核苷酸（ODN） YW002对人牙周膜干细胞（hPDLSCs）增殖、周期、凋亡和成骨分化的影响,阐明ODN YW002对hPDLSCs生物学性能的调控作用。方法：原代培养hPDLSCs至3~5代,将细胞分为空白对照组、免疫抑制型ODN MT01组和ODN YW002组,共培养1、2、3和5d后采用MTT法检测各组hPDLSCs的增殖活性,采用流式细胞术检测各组hPDLSCs的细胞周期和凋亡情况,采用磷酸苯二钠微板法检测各组hPDLSCs中碱性磷酸酶（ALP）活性。结果：与空白对照组比较,ODN YW002组在培养1和3d时hPDLSCs增殖活性升高（P<0.01）;培养5d时hPDLSCs细胞增殖活性升高,但差异无统计学意义（P>0.05）。与ODN MT01组比较,ODN YW002组培养1d时hPDLSCs增殖活性下降（P<0.05）;培养3和5d时细胞增殖活性升高,但差异无统计学意义（P>0.05）。与空白对照组和ODN MT01组比较,ODN YW002组培养1 d时G₀/G₁期hPDLSCs百分比降低,但差异无统计学意义（P>0.05）;S期hPDLSCs百分比升高,但差异无统计学意义（P>0.05）。与空白对照组比较,ODN YW002组培养1 d时hPDLSCs早期和晚期细胞凋亡率降低（P<0.05）;培养2 d时早期和晚期细胞凋亡率降低,但差异无统计学意义（P>0.05）。与ODN MT01组比较,ODN YW002组培养2d时hPDLSCs早期和晚期细胞凋亡率降低（P<0.05）。与空白对照组比较,培养1、3和5d时ODN YW002组hPDLSCs中ALP活性升高（P<0.01）;与ODN MT01组比较,ODN YW002组培养1和5d时hPDLSCs中ALP活性升高（P<0.05）,培养3d时ALP活性降低（P<0.05）。结论：ODN YW002可通过抑制细胞凋亡以促进hPDLSCs增殖,且诱导ALP活性升高,提示其有潜在的促hPDLSCs成骨分化功能。     

p38 丝裂原活化蛋白激酶在炎症微环境作用下对牙周膜干细胞成骨分化的影响

目的 探讨p38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)在慢性牙周炎组织来源的牙周膜干细胞中的表达及其对炎症微环境作用下牙周膜干细胞成骨分化能力的影响。方法 2012年10月至2013年5月收集中国人民解放军总医院口腔科因治疗需要拔除的无龋前磨牙及慢性牙周炎牙齿,培养正常及炎症微环境下的牙周膜干细胞(H-PDLSCs,P-PDLSCs)。采用酶联免疫吸附试验及实时定量PCR检测肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-1β的分泌及基因表达量,免疫荧光检测p38在细胞内的表达,Western blot法检测两种细胞成骨诱导7 d后p38及磷酸化p38(p-p38)的表达。使用p38 MAPK特异性抑制剂SB-203580干扰后体外成骨诱导7 d,实时定量PCR检测细胞成骨关键基因Runx2和碱性磷酸酶(ALP)的基因表达水平,成骨诱导21 d后茜素红染色检测PDLSCs的矿化结节形成情况。结果 P-PDLSCs的TNF-α和IL-1β分泌量均显著高于 H-PDLSCs(68.80±6.70比34.10±3.07,P=0.001;57.10±4.23比26.90±2.58,P=0.000)。P-PDLSCs中TNF-α的基因表达水平较H-PDLSCs上升1.4倍(P=0.011),IL-1β的基因表达水平也上升1.7倍(P=0.009)。P-PDLSCs的p38表达量高于H-PDLSCs;成骨诱导后两种PDLSCs 中的p-p38表达均升高,但p38表达水平有所降低。SB-203580干扰后PDLSCs 的Runx2和ALP表达水平显著降低(H-PDLSCs:P=0.044、0.036;P-PDLSCs:P=0.017、0.004),矿化结节形成数量减少。结论 在慢性炎症微环境中,p38 MAPK参与细胞的炎性反应,抑制p38后炎症微环境作用下PDLSCs的成骨分化能力也被显著抑制。     

EGF对人牙周膜细胞增生与ALP活性表达的影响

探讨表皮生长因子 (EGF)对人牙周膜细胞的增生与碱性磷酸酶 (ALP)活性表达的影响 ,为EGF应用于牙周组织的再生与修复提供实验依据。采用MTT和ALP活性检测法 ,观察不同质量浓度 ( 0 .1～ 1 0 μg/L)EGF第 2 4、4 8和 72h对体外培养的第 3代人牙周膜细胞 (PDLCs)的作用。与对照组比较 ,在 2 4～ 72h ,0 .1～ 5 μg/L的EGF可显著抑制PDLCs的增生 (P <0 .0 1～ 0 .0 5 ) ;1 0 μg/LEGF培养 4 8h对PDLCs有促进增生的作用 (P <0 .0 5 ) ,培养 72h有稳定增生的作用 (P >0 .0 5 )。 0 .1、0 .5 μg/LEGF可显著抑制PDLCs的ALP活性 (P <0 .0 1～ 0 .0 5 ) ;1～ 1 0 μg/LEGF在 2 4h可显著增强PDLCs的ALP活性 (P <0 .0 1～ 0 .0 5 ) ,在培养 4 8和 72h有稳定ALP活性的作用 (P >0 .0 5 )。提示在一定的作用时间内 ,1 0 μg/LEGF对人PDLCs的生长和分化可同时具有促进作用。     

骨形成蛋白2基因转染的人牙周膜成纤维细胞的生物学特性

目的 建立表达骨形成蛋白2（BMP2）的人牙周膜成纤维细胞（HPDLFs）并观察其生物学特性。方法 利用脂质体将BMP2噬菌粒表达载体pBK－B2转染至HPDLFs,免疫组化ABC法检测BMP2基因的表达,并检测转染细胞的碱性磷酸酶（ALP）活力、骨钙素（OC）含量和矿化能力。结果 转染BMP2基因后,HPDLFs内有BMP2蛋白的表达,ALP活力、OC含量和矿化结节数量均显著增加。结论 BMP2基因在HPDLFs中得到表达并促进其向成骨样细胞分化。     

R-spondin1在促进人骨髓间充质干细胞成骨分化中的作用

目的:研究Wnt信号通路激活剂R-spondin1在人骨髓间充质干细胞(hBMSC)成骨分化中的作用.方法:用0、5、10、20 μg/L R-spondin1处理hBMSC,利用荧光素酶实验检测R-spondin1对hBMSC中Wnt信号通路的作用,Western blot检测R-spondin1对Wnt信号通路下游靶基因β-catenin蛋白表达的影响;在成骨分化培养基中添加20 μg/L R-spondin1诱导hBMSC成骨分化,检测R-spondin1对早期成骨分化指标ALP活性及成骨分化晚期钙沉积、成骨分化标志物OSX、OCN和成骨分化关键转录因子RUNX2表达的影响.结果:R-spondin1增强hBMSC中Wnt信号通路,R-spondin1增强ALP活性和钙沉积,促进OSX、OCN及RUNX2的表达.结论:R-spondin1增强hBMSC中Wnt信号通路的作用,促进hBMSC成骨分化.     

大鼠骨髓间充质干细胞体外分离培养及成骨成脂诱导

目的建立大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）体外分离、纯化、扩增的方法及诱导BMSCs成骨成脂分化,提供理想的组织工程种子细胞。方法采用贴壁筛选法分离BMSCs,通过不断传代进行纯化和扩增培养,并绘制细胞生长曲线。诱导后检测油红O染色和矿化结节。结果 BMSCs在体外分离培养扩增,细胞形态为长梭形,流式检测分析P3和P5细胞表面标记物CD44、CD90为阳性,CD45为阴性。细胞生长曲线呈S形。经成脂诱导培养,脂肪的特异性油红O染色为阳性;经成骨诱导培养,形成了矿化结节。结论本实验分离培养的细胞具有BMSCs的表面标记特征和诱导分化为脂肪细胞和成骨细胞的潜能,为BMSCs在组织工程中的应用提供基础理论和实验依据。     

Exosomes Derived from Human Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells Enhance the Osteoblastic Differentiation of Periodontal Ligament Stem Cells Under High Glucose Conditions Through the PI3K/AKT Signaling Pathway

ObjectiveHigh glucose (HG) can influence the osteogenic differentiation ability of periodontal ligament stem cells (PDLSCs). Human umbilical cord mesenchymal stem cell-derived exosomes (hUCMSC-exo) have broad application prospects in tissue healing. The current study aimed to explore whether hUCMSC-exo could promote the osteogenic differentiation of hPDLSCs under HG conditions and the underlying mechanism.MethodsWe used a 30 mmol/L glucose concentration to simulate HG conditions. CCK-8 assay was performed to evaluate the effect of hUCMSC-exo on the proliferation of hPDLSCs. Alkaline phosphatase (ALP) staining, ALP activity, and qRT-PCR were performed to evaluate the pro-osteogenic effect of hUCMSC-exo on hPDLSCs. Western blot analysis was conducted to evaluate the underlying mechanism.ResultsThe results of the CCK-8 assay, ALP staining, ALP activity, and qRT-PCR assay showed that hUCMSC-exo significantly promoted cell proliferation and osteogenic differentiation in a dose-dependent manner. The Western blot results revealed that hUCMSC-exo significantly increased the levels of p-PI3K and p-AKT in cells, and the effect was inhibited by LY294002 (PI3K inhibitor) or MK2206 (AKT inhibitor), respectively. Moreover, the increases in osteogenic indicators induced by hUCMSC-exo were significantly suppressed by LY294002 and MK2206.ConclusionhUCMSC-exo promote the osteogenic differentiation of hPDLSCs under HG conditions through the PI3K/AKT signaling pathway.     

高糖环境下FGF-21对人骨髓间充质干细胞成骨分化的影响

目的 研究高糖环境下成纤维细胞生长因子21(FGF-21)对人骨髓间充质干细胞（hBMSCs）骨向分化的作用及其机制。方法 取健康成人骨髓,分离培养hBMSCs,成骨、成脂诱导分化后,茜素红、油红O染色鉴定,流式细胞仪检测第3代细胞表面标志物CD105、CD90、 CD73和CD44水平。将hBMSCs分为对照组〔以葡萄糖（Glu）浓度5.5 mmol/L模拟正常生理状态糖浓度〕,Glu A、B、C高糖浓度梯度组（Glu 16.5、25、40 mmol/ L）,FGF-21干预组(Glu 5.5 mmol/ L+ FGF-21),高糖环境FGF-21干预组(Glu B+FGF-21)和Glu B+FGF-21干预+细胞丝裂原活化蛋白激酶(MAPK) 信号转导阻断剂（包括PD98059、SP600125、SB203580）组。成骨诱导第14天,检测碱性磷酸酶（ALP）活性;成骨诱导第21天,以RT-PCR检测骨向分化的相关因子ALP、骨钙素（OCN）、Runx2的mRNA水平,以Western blot检测MAPK通路中细胞外信号调节激酶(ERK1/ 2)、P38丝裂原活化蛋白激酶(P38)、c-Jun 氨基末端激酶(JNK)蛋白磷酸化水平。结果 ①分离培养得到的hBMSCs成骨、成脂诱导后茜红素、油红O染色阳性,hBMSCs被成功地诱导向成骨细胞（OB）和脂肪细胞分化。流式细胞仪鉴定为hBMSCs。②与对照组相比,高糖组的骨向分化标志物ALP、OCN、Runx2的mRNA水平明显增加,MAPK通路中ERK、P38、JNK磷酸化水平表达增加。③与Glu B组相比,Glu B+FGF-21组的ALP、OCN、Runx2的mRNA水平降低,ERK、P38和JNK的磷酸化水平降低。④与Glu B+FGF-21组相比,Glu B+FGF-21+MAPK信号转导阻断剂组的ALP、Runx2的mRNA水平进一步降低,且相应的ERK、JNK和P38及其磷酸化水平进一步降低。结论 高糖能促进hBMSCs的骨向分化。高糖环境下FGF-21具有抑制hBMSCs的成骨分化或矿化作用。