miRNA-451逆转非小细胞肺癌A549/DDP细胞对顺铂的耐药性及其机制研究

目的:探讨microRNA-451(miR-451)逆转非小细胞肺癌A549/DDP细胞对顺铂的耐药性及其可能的作用机制.方法:应用实时荧光定量PCR法(real-time fluorescent quantitative PCR,qRT-PCR)检测耐DDP细胞株A549/DDP及其亲本细胞株A549中miR-451的表达差异,同时检测A549/DDP细胞转染miR-451 mimic后miR-451表达的变化;分别应用MTT法、克隆形成实验、流式细胞术检测转染后A549/DDP细胞对DDP药物敏感度,细胞增殖能力,联合DDP处理后细胞凋亡变化;Western印迹法检测转染后A549/DDP细胞Akt、p-Akt( Ser473)、bcl-2和bax的表达变化.结果:miR-451在耐DDP细胞株A549/DDP中的表达量显著低于敏感细胞株A549 (P ＜0.05),A549/DDP细胞转染miR-451 mimic24h后,细胞中miR-451的表达水平较对照组明显提高(P＜0.05).在A549/DDP细胞中过表达miR-451可产生以下效应:相较于对照组,DDP对A549/DDP/miR-451细胞的半数抑制浓度(half inhibition concentration,IC50)减低(P＜0.05),A549/DDP/miR-451细胞的增殖能力减弱,A549/DDP/miR-451经过DDP处理后细胞凋亡增多(P＜0.05).Western印迹法结果显示,与对照组比较,转染miR-451 mimic的A549/DDP细胞p-Akt ( Ser473)、bcl-2表达水平降低;bax表达水平升高.结论:miR-451可能通过诱导细胞凋亡,抑制细胞增殖,上调bax蛋白及下调p-Akt( Ser473)、bcl-2蛋白表达而逆转A549/DDP细胞对DDP的耐药性.     

miRNA-192对非小细胞肺癌A549／DDP细胞顺铂耐药性的影响

目的 探讨抑制microRNA-192（miR-192）在非小细胞肺癌A549／DDP细胞对顺铂（DDP）耐药性方面的影响及可能机制。方法 通过实时荧光定量PCR（qRT-PCR）法检测人肺腺癌耐DDP细胞株A549／DDP及其亲本细胞株A549细胞中miR-192的表达水平,A549／DDP细胞转染miR-192抑制剂（inhibitor）和miR-阴性对照（NC）48h后采用qRT-PCR检测转染效率,分别采用MTT法、克隆形成实验及流式细胞术检测转染48h后A549／DDP细胞对DDP的药物敏感性、细胞增殖能力及细胞凋亡变化,Western blotting检测转染48h后细胞中Bax和Bcl-2的表达变化。结果 miR-192在A549／DDP细胞中的表达水平高于A549细胞（P＜0.05）;转染miR-192 inhibitor 48h后的A549／DDP细胞miR-192水平低于转染miR-NC者（P＜0.05）;转染miR-192 inhibitor后,A549／DDP细胞的增殖能力减弱、凋亡细胞增多、DDP对其半数抑制浓度降低、Bax蛋白水平升高和Bcl-2蛋白水平下降,与转染miR-NC者比较,差异均有统计学意义（P＜0.05）。结论 抑制miR-192能够降低A549／DDP细胞对DDP的耐药性,其作用机制可能是通过增加细胞凋亡以及下调Bcl-2蛋白和上调Bax蛋白表达来实现的。     

miRNA-223对非小细胞肺癌A549／DDP细胞顺铂耐药性的影响

目的 探讨microRNA-223（miR-223）在非小细胞肺癌（NSCLC）A549／DDP细胞对顺铂（DDP）耐药性方面的影响及可能机制。方法 采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测DDP耐药肺腺癌细胞株A549／DDP及其亲本细胞株A549中miR-223的水平,将A549／DDP细胞分为3组：对照组、空转染组（转染无关序列）和抑制组（转染miR-223 inhibitor）,于转染24、48、72及96 h后分别采用qRT-PCR和CCK-8法检测转染效果及细胞增殖情况,CCK-8法评价转染后A549/DDP细胞对DDP的药物敏感性变化,采用流式细胞术检测转染48 h后的细胞凋亡和细胞周期情况,Western blotting检测转染48 h后耐药基因蛋白P 糖蛋白（P-gp）、多药耐药相关蛋白1（MRP1）及肺耐药相关蛋白（LRP）的表达。结果 A549／DDP细胞中的miR-223水平较高,为A549细胞的（7.14±0.26）倍（P＜0.05）;抑制组转染后的miR-223水平降低,转染96 h后的miR-223水平分别降至对照组的（67.15±2.84）％和空转染组的（65.80±3.47）％,差异均有统计学意义（P＜0.05）;与对照组相比,抑制组转染后的增殖抑制率、凋亡率及G0／G1期细胞比例均升高,而S和G2／M期细胞比例及3种耐药基因蛋白水平均降低,以上差异均有统计学意义（P＜0.05）。DDP对抑制组细胞的半数抑制浓度（IC50）值为（15.67±1.30） μg／ml,低于对照组的（33.71±2.61） μg／ml（P＜0.05）。结论 miR-223可增加A549／DDP细胞对DDP的耐药性,可能与耐药基因蛋白表达上调有关;降低miR-223水平可抑制A549／DDP细胞增殖、诱导凋亡及细胞周期阻滞,并下调耐药蛋白的表达,从而增加A549/DDP细胞对DDP的敏感性。     

非小细胞肺癌顺铂化疗耐药相关微RNA的筛选及鉴定

 目的　探讨肿瘤细胞微RNA（miRNA）对化疗药物敏感性的作用。方法　通过miRNA芯片技术检测顺铂（DDP）耐药细胞株A549／DDP与非耐药细胞株A549的miRNA表达的差异,利用荧光定量聚合酶链反应（PCR）技术验证相应miRNA的表达情况,通过在细胞株中抑制或过表达目标miRNA,研究其对细胞化疗药物敏感性的影响。结果　A549／DDP细胞对DDP的耐药为A549细胞的18倍。A549／DDP细胞与A549细胞存在51个表达水平差异在4倍以上的miRNA,其中24个表达上调,27个表达下调。PCR进一步证实miR-376c、miR-31、miR-29a、miR-221在A549／DDP细胞中显著上调,miR-196a、miR-20a、miR-20b、miR-17、miR-451在A549／DDP细胞中显著下调。在提高A549／DDP细胞中miR-17的表达后,细胞对DDP的敏感度增加了11.7 %,提高miR-451的表达或者抑制miR-29a的表达后,对DDP的敏感度分别下降了15.5 %、12.9 %,抑制miR-376c、miR-31、miR-221或过表达miR-196a、miR-20a、miR-20b均不影响A549／DDP细胞对DDP的敏感度。结论　非小细胞肺癌DDP耐药细胞与非耐药细胞的miRNA表达谱有差异,miRNA参与肺癌化疗耐药,miR-17具有逆转非小细胞肺癌DDP耐药的潜力。     

miRNA-200c对非小细胞肺癌A549细胞甲氨蝶呤耐药性的影响

目的 探讨miRNA-200c（miR-200c）在非小细胞肺癌A549细胞耐甲氨蝶呤（MTX）（A549/MTX）中的影响及可能的作用机制。方法 通过实时荧光定量（qRT-PCR）法检测人肺癌亲本细胞株A549细胞、转染miR-200c模拟物（mimic）的A549/MTX细胞（A549/MTX-M）及转染miR- 阴性对照（NC）A549/MTX细胞（A549/MTX-N）中miR-200c的表达水平。分别采用MTT法、锥虫兰染色及流式细胞术检测三组细胞对MTX的药物敏感度、细胞增殖能力及细胞凋亡变化,并采用qRT-PCR检测其P53和P21基因表达的变化。结果 miR-200c在A549细胞中的表达水平显著高于A549/MTX-N细胞;A549/MTX-M细胞miR-200c水平高于A549/MTX-N细胞;用不同浓度MTX刺激细胞,与A549/MTX-N细胞比较,A549/MTX-M细胞的增殖能力减弱、凋亡细胞增多,并呈剂量依赖性,差异均有统计学意义。转染miR-200c mimic后,P53和P21基因表达水平上升,与转染miR-NC细胞比较,差异有统计学意义。结论 miR-200c能够逆转A549/MTX细胞对MTX的耐药性,其作用机制可能是通过P53/P21信号转导通路诱导细胞凋亡来实现的。     

脂氧合酶抑制剂NDGA对胰腺癌细胞PCNA-1增殖和凋亡的影响

目的：探讨脂氧合酶抑制剂NDGA对人胰腺癌细胞株PCNA-1生长抑制、诱导凋亡及其对bcl-2、bax表达的影响。方法：采用MTT法检测NDGA对胰腺癌细胞株PCNA-1增殖活性的影响,流式细胞术检测NDGA处理的胰腺癌细胞株PCNA-1的细胞周期及凋亡相关蛋白bcl-2、bax的表达。结果：NDGA抑制胰腺癌细胞株PCNA-1的增殖活性,呈剂量依赖效应关系;细胞经100μmol／L的NDGA处理后G0／G1期细胞减少（P〈0．05）、S期细胞增多（P〈0．05）,G2／M期细胞无明显变化;细胞经100μmol／L的NDGA处理48h后bcl-2蛋白与对照组相比表达下调（P〈0．01）、bax蛋白与对照组相比表达上调（P〈0．01）。结论：NDGA对胰腺癌细胞株PCNA-1有抑制增殖、诱导其凋亡作用,诱导细胞凋亡的机制可能与细胞凋亡相关基因bcl-2表达下调、bax表达上调有关。     

MicroRNA-18a对非小细胞肺癌细胞A549/DDP顺铂耐药性的调控研究

目的：探讨microRNA-18a（miR-18a）对顺铂（DDP）耐药非小细胞肺癌（NSCLC）A549/DDP细胞耐药性的影响及其作用机制。方法将A549/DDP细胞随机分为3组,分别为空白对照组（正常培养的A549/DDP细胞）、阴性对照组（在正常培养的A549/DDP细胞中转染无关序列）和miR-18a转染组（在正常培养的A549/DDP细胞中转染miR-18a）。每组重复5次,待转染进行24、48、72、96 h后检测转染效果。实时荧光定量PCR检测A549/DDP细胞中miR-18a的表达水平;流式细胞术检测转染后的细胞周期情况;MTT法测定转染miR-18a对A549/DDP细胞的增殖抑制;Western Blot检测转染后A549/DDP细胞的共济失调-毛细血管扩张症突变基因蛋白（ATM）及磷酸化ATM的表达。结果 miR-18a转染组、阴性对照组、空白对照组的miR-18a相对表达量分别为（101.1±2.50）、（1.18±0.21）、（1.00±0.02）,差异有统计学意义（P﹤0.05）;miR-18a转染组DDP的半数抑制浓度（IC50）值为（17±0.51）μmol/L,低于阴性对照组和空白对照组;与阴性对照组和空白对照组相比,miR-18a转染组A549/DDP的S期和G2/M期细胞比例、ATM及磷酸化ATM蛋白水平均降低,差异均有统计学意义（P﹤0.05）。结论 miR-18a的表达水平可以调控A549/DDP细胞对DDP的耐药性,可能与ATM及磷酸化ATM的表达有关。     

地塞米松联合顺铂对肺腺癌 A549 细胞增殖和凋亡的影响

目的：探讨地塞米松（dexamethasone,DEX）联合顺铂（cisplatin,DDP）在体外对肺腺癌2,549细胞增殖和凋亡的影响及可能的机制。方法：体外培养人肺腺癌A549细胞。MTF法检测DDP和DEX对A549细胞增殖的影响。流式细胞术分析细胞周期及细胞凋亡。Westernblot检测DEX和DDP对A549细胞内VDR表达水平的影响。结果：地塞米松≥500nmol／L浓度时对A549细胞有一定的增殖抑制作用（P〈0．05）;〈500nmol／L浓度时对A549细胞无明显抑制作用（P〉0．05）;DDP浓度在0．3125-10ug／ml范围内对A549细胞增殖有明显的抑制作用,并呈浓度及时间依赖性（P〈0．05）。流式细胞仪检测到DDP＋DEX组的G．期细胞比例下降,s期比例上升（P〈0．05）,且细胞凋亡数目增加（P〈0．05）。Westernblot观察到DDP＋DEX组VDR表达水平明显升高（P〈0．05）。结论：DEX可能通过上调A549细胞内VDR表达水平,与顺铂协同促进细胞凋亡、诱导细胞周期阻滞,进而提高顺铂化疗敏感性。     

miRNA-139-5p通过靶向调控CXCR4/CXCL12信号通路逆转非小细胞肺癌A549细胞顺铂耐药

目的:探讨miRNA-139-5p对非小细胞肺癌A549细胞顺铂（cisplatin,DDP）耐药的影响,及其可能的分子机制。方法:采用DDP浓度递增法诱导A549细胞建立DDP耐药细胞株A549/DDP,将miR-139-5p mimics、无义序列（mimics-NC）、CXCR4过表达质粒（pcDNA3.1-CXCR4）、pcDNA3.1空载质粒（Vector）转染至A549/DDP细胞中,将细胞分为mimics-NC组（转染无义序列）、mimics组（转染miR-139-5p mimics）、mimics+Vector组（共转染miR-139-5p mimics和空载质粒）和mimics+CXCR4组（共转染miR-139-5p mimics和CXCR4过表达质粒）,另设置空白对照组（blank）。不同浓度DDP处理,MTT法检测细胞增殖活性,并计算IC50值和耐药指数（resistance index,RI）;qRT-PCR法检测细胞中miR-139-5p和CXCR4 mRNA表达水平;流式细胞术检测细胞凋亡率;Western blot法检测细胞中耐药相关蛋白P-糖蛋白（P-gp）、多药耐药相关蛋白1（MRP1）及CXCR4/CXCL12信号通路相关蛋白表达水平;双荧光素酶报告基因实验验证miR-139-5p与CXCR4的靶向关系。结果:不同浓度DDP处理24 h后,耐药株A549/DDP及其亲本A549细胞IC50值分别为（208.87±27.89）μmol/L和（31.66±6.30）μmol/L,RI=6.59。与亲本A549细胞比较,耐药株A549/DDP中miR-139-5p的表达水平明显降低（P＜0.05）,而CXCR4 mRNA和蛋白表达水平明显升高（P＜0.05）。与mimics-NC组比较,mimics组A549/DDP细胞增殖活性明显降低（P＜0.05）,细胞凋亡率明显升高（P＜0.05）,细胞中CXCR4 mRNA和蛋白以及P-gp、MRP1、PI3K（p110α）和p-AKT/AKT等蛋白表达水平显著降低（P＜0.05）。与mimics+Vector组比较,mimics+CXCR4组A549/DDP细胞增殖活性显著升高（P＜0.05）,细胞凋亡率显著降低（P＜0.05）,而细胞中CXCR4、P-gp、MRP1、PI3K（p110α）和p-AKT等蛋白表达水平显著升高（P＜0.05）。双荧光素酶报告基因实验证实,miR-139-5p靶向负调控CXCR4表达。结论:miRNA-139-5p通过靶向下调CXCR4表达,提高非小细胞肺癌DDP耐药细胞株A549/DDP对DDP的药物敏感性。     

人Id3基因在肺腺癌A549细胞中的表达及其对细胞生长的抑制

目的：研究外源性分化抑制因子3（Inhibitor of differentiation3，Id3）基因表达对人肺腺癌细胞系A549细胞生长的抑制作用。方法：构建磁，和EGFP的融合基因表达载体pEGFP／Id3，采用脂质体转染技术将pEGFP／Id3导入A549细胞。FCM分析转染细胞EGFP表达效率，荧光显微镜观察EGFP表达情况；半定量RT—PCR、免疫细胞化学分析转染后A549细胞Id3mRNA和蛋白的表达。MTT法检测转染后A549细胞生长抑制情况，FCM分析A549细胞周期进程，AnnexinV／7-AAD和Hoechst33258染色检测转染后细胞的凋亡情况。结果：成功构建入肚，与EGFP融合基因表达载体pEGFP／Id3；荧光显微镜和FCM观察到EGFP的有效表达，转染48—72h时EGFP表达率最高；Id3mRNA及蛋白在转染后的A549细胞中能有效表达。转染后48h和72h，pEGFP／Id3转染组A549细胞生长受到明显抑制（P〈0．01）；细胞周期分析表明，pEGFP／Id3转染组G0／G1期细胞显著高于对照组（P〈0．05）；AnnexinV／7-AAD双染结果显示，pEGFP／Id3转染组细胞的早期凋亡率[（10．67±2．60）％]显著高于pEGFP组[（3．39±2．21）％]和未转染组[（2．35±0．95）％]（P〈0．05）；Hoechst33258染色结果也证实pEGFP／Id3组A549细胞出现明显凋亡形态特征。结论：外源性加基因在肺腺癌A549细胞中的表达能抑制细胞增殖，并诱导细胞凋亡。     

siRNA沉默K-C1协同转运子1基因的表达对肺腺癌细胞顺铂敏感性的影响

%0 Journal Article %A 徐然;赵俊刚;石文君; 目的：探讨降低K-Cl协同转运子1（KCC1）基因在肺腺癌A549细胞中的表达及对化疗药物顺铂（DDP）敏感性的影响。方法：设计并合成KCC1特异性siRNA,转染A549细胞;RT-PCR检测RNA干扰后KCC1基因的表达改变;应用DDP处理后,MTT法测定细胞毒性指数,流式细胞仪检测细胞凋亡情况。结果：siRNA-KCC1能够抑制KCC1基因在A549细胞中的表达;而KCC1表达降低后,A549细胞的凋亡明显升高（P〈0.05）,增殖能力明显下降（P〈0.05）。结论：KCC1基因表达降低能够抑制A549细胞的增殖并促进细胞凋亡,并能够在一定程度上增强A549细胞对化疗药物DDP的敏感性。     

Upregulation of microRNA-451 increases cisplatin sensitivity of non-small cell lung cancer cell line (A549)

Background

Recently, miR-451 as a tumor suppressor has been reported in other studies. However, whether miR-451 can affect the sensitivity of non-small cell lung cancer (NSCLC) cells to cisplatin (DDP) remains unclear. The aim of this study is to evaluate the roles of miR-451 in the sensitivity of NSCLC cells to DDP.

Methods

Quantitative RT-PCR assay was performed to detect the expression of miR-451 in 10 pairs of NSCLC and noncancerous tissue samples. pcDNA-GW/EmGFP-miR-451 was stably transfected into NSCLC cell line (A549). Then, the effects of miR-451 upregulation on growth, colony formation and apoptosis of A549 cells were investigated. Finally, the effects of miR-451 upregulation on in vitro and in vivo sensitivity of A549 cells of DDP were also determined.

Results

The level of miR-451 expression in NSCLC tissues was significantly higher than that in corresponding noncancerous tissues. Ectopic overexpression of miR-451 could significantly inhibit growth and induce apoptosis of A549 cells. Moreover, ectopic overexpression of miR-451 could sensitize A549 cells to DDP possibly by increasing DDP-induced apoptosis which might be associated with the inactivation of Akt signaling pathway.

Conclusions

This study demonstrated for the first time that combination of DDP application with miR-451 upregulation might be a potential strategy for the treatment of human NSCLC.     

Akt及磷酸化Akt308和473在结直肠癌中的表达及其临床意义

目的：探讨Akt及磷酸化的Akt在人结直肠癌的发生和演进中的作用。方法：应用组织芯片结合免疫组化染色方法检测323例结直肠癌和107例对应的非癌粘膜组织中Akt、苏氨酸308位点磷酸化的Akt（pAkt308）和丝氨酸473位点磷酸化Akt（pAkt473）的表达和结直肠癌临床病理参数的关系,并分析三者以及VEGF和Ki67表达的相关性。结果：结直肠癌中Akt、pAkt308和pAkt473的阳性率分别为63.2%、64.7%、72.4%,在非癌粘膜组织中分别为37.4%、13.1%、16.8%。结直肠癌中三者的表达显著高于癌旁正常粘膜的表达（P〈0．001）。肿瘤中Akt和pAkt473表达与肿瘤高分化具有统计学相关性（P=0．027,P=0．039）,但与患者年龄、性别、肿瘤大小、淋巴管或静脉转移、淋巴结转移及Dukeg分期无关（P〉0．05）。pAkt308表达与淋巴结转移相关（P=0．017）,但与其他临床病理参数无关（P〉0．05）。而且,Akt表达与Akt308,pAkt473,VEGF和Ki67表达均有统计学相关性（P〈0．01）。结论：在结直肠癌发生过程中,Akt、pakt308和pAkt473表达明显上调。pAkt308是预示肿瘤演进和预后的良好指标,pAkt308和pAkt473可能是有效的结直肠癌的分子治疗新靶点。