浙贝母鳞茎总RNA提取方法的研究

建立适合功能基因分析的浙贝母Fritillaria thunbergiiMiq.鳞茎总RNA的提取方法,将为后续与药效成分相关功能基因的分析奠定良好的工作基础。本研究通过紫外分光光度法、非变性琼脂糖电泳法以及DDRT-PCR方法比较异硫氰酸胍法、改良的异硫氰酸胍法、改良的SDS法和改良CTAB法提取浙贝母鳞茎总RNA的质量。结果表明,通过改良的CTAB法提取出的总RNA的完整性好(28 s/18 s约为2),纯度高(其A260/A280和A260/A230分别为1.95和2.30),以其为模板进行DDRT-PCR分析时能获得清晰的差异条带。通过本研究建立的改良CTAB法可于浙贝母鳞茎总RNA的提取,并可为其它植物鳞茎的总RNA提取提供参考。     

红花总RNA的快速提取方法

目的：建立从红花组织中快速分离总RNA的方法，为进行反转录PCR（RT—PCR）、快速扩增cDNA末端（RACE）、蛋白质印迹法及其他分子生物学实验奠定基础。方法：采用改良Trizol法提取红花苞叶总RNA时，加入DNaseⅠ消化残留DNA，并加入RNase抑制剂，利用琼脂糖凝胶电泳及紫外分光光度法进行纯度和浓度检测。RT—PCR后，进行cDNA-序列相关扩增多态性（SRAP）分析。结果：抽提的RNA经电泳检测，可见28S、18S、5S RNA三条带，带的亮度强，且28S的宽度是18S的2倍左右。紫外吸光度D260／D280为1．8～2．0，D260／D230为2．0～2．3。总RNA产物进行cDNA-SRAP扩增，出现清晰的条带。结论：改良Trizol法所提取的RNA纯度高，质量好，完整性好，可成功进行cDNA-SRAP扩增。     

一种适于ISSR分析的太子参DNA提取方法

目的获得能用于中药太子参简单序列重复区间DNA标记技术等分析研究的高质量DNA。方法以太子参为材料,采用改良CTAB法提取太子参DNA,经紫外分光光度计和琼脂糖凝胶电泳检测。结果改良的CTAB法能获得高质量的太子参DNA,OD260/OD280>1.8,蛋白质、多糖、RNA等去除较彻底,适于简单序列重复区间分析。结论改良的CTAB法所提取太子参DNA适于简单序列重复区间分析。     

蒙药材山野豌豆总DNA提取方法研究

目的 寻找快速、简便的山野豌豆总DNA提取方法。方法 采用4种不同方法(CTAB法、SDS法及改进CTAB法、改进SDS法)提取山野豌豆总DNA,通过琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测其纯度,以筛选出最优提取方法。结果 改进CTAB法和改进SDS法所得的山野豌豆总DNA纯度都较高,A260和A280分别为(1.9128±0.0827)和(1.8767±0.0408)。改进CTAB法提取到的总DNA电泳时DNA条带亮度明显,无拖尾现象。结论 改进CTAB法是提取山野豌豆中高质量总DNA的有效方法。     

川贝母鳞茎总RNA提取方法的研究

以暗紫贝母(Fritillaria unibracteata Kisao et K.C.Hisa)新鲜鳞茎为试材,选取3种有效提取富含油脂、多糖和酚类植物材料总RNA的方法,比较提取总RNA的效果。结果表明,改良SDS酸酚法能有效去除大部分多糖和DNA,RNA条带清晰、亮度好,28S rRNA的亮度约为18S rRNA的2倍,A260nm/A280nm为1.85,A260nm/A230nm为2.06,得率为73μg/g。提取的总RNA经RT-PCR获得了3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase,HMGR)基因的特异性条带,说明改良SDS酸酚法从川贝母中提取的RNA质量好、产率高、完整性强,完全适合于进一步的分子生物学研究。     

贝母属药用贝母总DNA提取方法的比较研究

目的 比较筛选最适于贝母属药用贝母的总DNA提取方法。方法 利用试剂盒法、改良的CTAB法、改良的SDS法提取贝母属药用贝母的总DNA;通过核酸蛋白检测仪及琼脂糖凝胶电泳方法检测其浓度和纯度;进行ISSR-PCR扩增检测所得总DNA质量。结果 3种方法均可提取出产量较高的基因组DNA,但试剂盒法相较提取的总DNA纯度最高,质量最好,并且均能扩增出丰富清晰的条带,稳定性高,操作简单耗时短。改良的CTAB法、SDS法提取的总DNA纯度、质量均次于试剂盒法,操作复杂耗时长,不适用于下游的分子生物学实验。结论 试剂盒法为贝母属药用贝母总DNA提取的最佳方法,其所得样品适用于PCR及其他分子生物学研究。     

牡丹皮基因组DNA提取的影响因素研究

目的:研究牡丹皮基因组DNA提取的影响因素。方法:以根皮类中药材牡丹皮为材料,在快速少量抽提(CTAB)法的基础上对提取缓冲液中氯化钠、β-巯基乙醇浓度,水浴温度、时间,RNA酶(RNaseA)、聚合酶链(PCR)反应体系等条件进行考察。结果:使用经过改进后的CTAB法获得的DNA纯度和完整性较好,A260/A280值在1.8～2.0之间,PCR扩增条带清晰且亮,从而为接下来的分子生物学实验打下了良好的基础。结论:本方法经济、快速、高效,可作为根皮类中药材基因组DNA的提取方法,可为大规模生产提供理论依据。     

尿激酶受体反义RNA真核表达质粒的构建

目的构建尿激酶受体(UPAR)基因pcDNA3.1(-)真核表达质粒,为进一步研究通过UPAR干预类风湿关节炎的发生发展提供实验基础。方法取冰冻保存的小鼠肝癌组织,应用TRIzol法提取总RNA,琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性,并用紫外分光核酸蛋白分析仪测定RNA浓度和纯度。使用一步法逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)试剂盒获得目的基因(UPAR)cDNA片段。用CaCl2法诱导感受态细胞。将真核载体pcDNA3.1(-)在多克隆位点处用HindⅢ、BamHⅠ双酶切线性化,切胶纯化回收;将纯化回收的pcDNA3.1(-)线性化载体和UPAR基因片段定向及反向连接,构建以pcDNA3.1(-)为载体的反义UPAR基因表达质粒;转化JM109大肠杆菌;酶切证实的阳性克隆行测序分析。结果琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性,见28S,18S条带完整,而且28S条带亮度为18S的1倍左右,认为RNA完整性良好,并用紫外分光核酸蛋白分析仪测定RNA纯度A260/A280=1.9051,认为RNA纯度良好;RNA浓度为450mg/L;阳性克隆经双酶切后行10g/L琼脂糖电泳,在DNAMarker500bp和5.3bp附近可见两条明显条带,与所需目的片段大小相符,证实为阳性克隆,重组质粒构建成功;DNA测序结果与预期目的片段序列一致。结论反义UPAR真核表达重组质粒构建成功。     

药用百合鳞叶中总DNA提取方法的研究

目的:对药用百合DNA的提取过程进行改良和优化,筛选出较理想的DNA提取方法。方法:在传统十六烷基三甲基氯化铵(CTAB)提取方法基础上,进行改良和优化,寻找出一种实用的DNA提取方法。结果:用改良CTAB法提取的总DNA的OD260/OD280在1.6~2.0之间,电泳条带清晰,其含量和纯度完全满足引物扩增分析的要求。结论:本试验中的百合鳞叶总DNA的提取方法简便实用,所得DNA的产量和纯度均能满足基因工程操作的要求。     

人脂肪细胞总RNA的抽提及对脂联素mRNA的扩增

目的建立一种提取脂肪组织总RNA并能够有效地进行反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)的方法。方法利用Trizol试剂提取人皮下脂肪组织总RNA,用紫外分光光度法鉴定其产率及纯度,用琼脂糖凝胶电泳和RT-PCR鉴定所提取的总RNA的完整性。结果采用选择性mRNART-PCR试剂盒特异性地扩增出脂联素(adiponectin)和β肌动蛋白(β-actin)的mRNA。结论在脂肪组织总RNA抽提中容易混入基因组DNA,而采用选择性mRNART-PCR只针对mRNA进行特异的扩增。     

亨氏马尾藻多糖的分离、纯化和鉴定

目的：研究南澳岛海域亨氏马尾藻多糖的提取工艺,并对其进行纯化和鉴定。方法：用热水提取多糖,乙醇沉淀,并用正交实验确定提取的最佳条件,Sevage法去蛋白,用CTAB结合不同浓度盐离子溶液对多糖进行分级。SephadexG200柱层析及聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定。硅胶薄层层析分析多糖中单糖组分。结果：最佳提取条件：100℃,pH7,提取4h,得率可达22．7％,分级沉淀后得四组分F1、F2、F3、P,纯度鉴定证明其中F1、F2、P为均一级分,薄层层析发现其中含有岩藻糖。结论：亨氏马尾藻多糖的分离、纯化和鉴定能够为该多糖的进一步开发利用提供一定的理论依据。     

香港特有止泻中药材红党参的化学和分子生物学鉴定

目的鉴定香港特有止泻中药材红党参的基源植物和表面红色物质。方法将红党参的5SrRNA基因间隔区序列和HPLC色谱指纹谱与正品党参5SrRNA基因间隔区序列和HPLC色谱指纹谱进行比较研究;将红党参表面红色物质的X-衍射光谱与中药赤石脂X-衍射光谱进行比较研究。结果红党参的HPLC色谱指纹谱和党参药材具有相同的特征色谱峰;红党参的5SrRNA基因间隔区序列与党参正品之一的素花党参（Codonopsis pilosula var.modesta）的5SrRNA基因间隔区序列最为相似;红色物质的X-衍射光谱与中药赤石脂X-衍射光谱完全相同。结论红党参的基源是素花党参（Codonopsis pilosula var.modesta）的根,红党参表面的红色物质是传统中药赤石脂（Halloysitum Rubrum）。红党参是素花党参根用中药赤石脂炮制而成,科学名可定为Radix Codonopsis Praeparata Halloysita Rubra。     

改良TRIZOL法从矿化骨组织中提取总RNA

目的：通过对TRIZOL法加以改进，建立一种快速、有效提取矿化骨组织中总RNA的方法。方法：改进TRIZOL法提取骨组织中的总RNA，在异丙醇沉淀RNA时加入高浓度的盐溶液。通过紫外分光光度法和1％甲醛变性琼脂糖凝胶电泳鉴定所提取的RNA。进而以其逆转录所得的cDNA为模板经PCR扩增OPG基因予以鉴定。结果：改良TRIZOL法获得的总RNA完整，纯度好，产量高。结论：改良TRIZOL法是一种从矿化骨组织中提取总RNA的高效、便捷、可靠的方法。     

小柴胡颗粒质量标准研究

目的制订小柴胡颗粒的质量标准。方法采用薄层色谱法对小柴胡颗粒中的黄芩、甘草、党参进行定性鉴别,用高效液相色谱法测定黄芩中黄芩苷的含量。结果黄芩、甘草、党参的定性鉴别灵敏度高、专属性强;黄芩苷含量测定的平均回收率为99.30％,RSD=0.86％（n=6）。结论建立的定性、定量方法简便、准确、灵敏、重现性好。     

潞党、川党、西党的生药学初步研究

本文通过对潞党参、川党参、西党参的性状、组织特征、化学成分预试、薄层层析定性、氨基酸种类与含量等方面的初步研究,为进一步合理开发利用和发展党参资源、评价党参质量提供了科学依据。     

反相高效液相色谱法测定党参中苍术内酯Ⅲ含量

目的建立一种用反相高效液相色谱法测定党参中苍术内酯Ⅲ含量的方法。方法采用Kro masilC18(2 5 0mm× 4 6mm ,5 μm)色谱柱 ,甲醇 水 (60∶40 ,V∶V)为流动相 ,以尼莫地平为内标 ,检测波长 2 2 0nm。结果线性范围为 0 5～ 1 0 0mg/L ,三水平的平均回收率 (% )分别为 82 1、85 4和88 4,RSD(% )分别为 2 9、1 3和 2 7。结论本法简便 ,准确 ,可作为党参药材的质量控制方法。