可溶性抗原联合超抗原诱导的 CTL 抗瘤作用的实验研究

目的:探讨肿瘤可溶性抗原联合超抗原SEC诱导的细胞毒性T细胞(CTLs)对肿瘤细胞杀伤机理.方法:外周血淋巴细胞经肿瘤可溶性抗原、超抗原SEC联合作用,进行体外培养.对其增殖、细胞因子分泌、杀瘤活性和形态学变化进行观察和测定.结果:经肿瘤可溶性抗原、超抗原SEC联合刺激的淋巴细胞组增殖活性最强,诱导的CTLs对靶细胞杀伤活性显著高于单纯淋巴细胞组(P＜0.05),对TSA来源的肺癌细胞具有选择性杀伤作用,能够诱导肿瘤细胞出现凋亡的形态学变化.结论:肿瘤可溶性抗原与超抗原SEC联合应用能诱导效应细胞明显增殖、活化、并产生高效特异性的抗肿瘤效果.     

胶质瘤抗原联合超抗原SEC诱导杀瘤性免疫细胞的实验研究

目的:使用胶质瘤可溶性抗原(GSA)联合超抗原SEC刺激外周血淋巴细胞,诱导产生杀瘤性免疫细胞,对胶质瘤细胞进行杀伤,探讨肿瘤免疫治疗新方法.方法:提取健康人外周血淋巴细胞,体外培养,并经GSA、超抗原SEC联合处理.流式细胞术(FCM)和细胞毒试验测定效应细胞表型和杀伤活性.结果:经GSA、超抗原SEC联合刺激的淋巴细胞组增殖活性最强,于72h达到高峰,并且上调CD8+T细胞群,联合刺激诱导的效应细胞对靶细胞杀伤活性显著高于单纯淋巴细胞组(P＜0.05).结论:GSA与SEC联合应用诱导的效应细胞增殖快,细胞毒活性高,对抗原来源肿瘤细胞具有选择性杀伤作用.该实验研究为肿瘤免疫治疗提供了新的思路.     

肺癌可溶性抗原联合超抗原修饰致敏ＤＣ诱导抗瘤免疫的研究

目的　观察经肺癌肿瘤可溶性抗原（ＴＳＡ）和超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素Ａ（ＳＥＡ）联合修饰致敏树突状细胞（ＤＣ）体外诱导抗肺癌的免疫效应。方法　３ｍｏｌ／Ｌ氯化钾提取法获得人肺癌细胞ＧＬＣ ８２的可溶性抗原;从人外周血单个核细胞（ＰＢＭＣ）中诱导扩增ＤＣ,并用流式细胞仪（ＦＣＭ）检测表型;以肺癌ＴＳＡ和ＳＥＡ联合修饰致敏的ＤＣ、单纯肺癌抗原致敏的ＤＣ和未经抗原修饰的ＤＣ分别与同种异体外周血Ｔ淋巴细胞共同孵育,刺激Ｔ淋巴细胞活化增殖（作为效应细胞分别称为ＴＳＡ-ＳＥＡ-ＤＣＬ、ＴＳＡ-ＤＣＬ、ＤＣＬ）,直接活细胞计数法观察增殖倍数;ＭＴＴ法检测不同ＤＣ∶Ｔ淋巴细胞比例的效应细胞对靶细胞ＧＬＣ-８２的体外杀伤效应。结果　诱导出高表达ＣＤ１ａ、ＣＤ８０、ＨＬＡ-ＤＲ的ＤＣ,光镜下具有典型的ＤＣ特性;联合抗原修饰后的ＤＣ具有较强的免疫刺激活性,少量致敏ＤＣ即可强烈激发Ｔ细胞的增殖;ＴＳＡ-ＳＥＡ-ＤＣＬ对靶细胞ＧＬＣ-８２的杀伤率明显高于ＴＳＡ-ＤＣＬ及ＤＣＬ;联合抗原修饰的ＤＣ以１∶１００与Ｔ淋巴细胞共孵后的杀伤肿瘤细胞效应最强。结论　经肺癌ＴＳＡ和ＳＥＡ联合修饰致敏的ＤＣ可强烈激发同种异体Ｔ淋巴细胞活化增殖;肺癌ＴＳＡ联合超抗原ＳＥＡ诱导的ＤＣ疫苗对肺癌细胞有高效杀伤作用,经肺癌ＴＳＡ与超抗原ＳＥＡ联合修饰ＤＣ的活性明显强于单用肺癌ＴＳＡ。     

可溶性胃癌抗原和抗CD3单抗共同诱导杀瘤细胞的实验

用盐析法提取胃癌可溶性抗原（ＴＳＡ），并用抗ＣＤ３单抗和ＩＬ－２共同刺激正常人的外周血单核细胞，培养１０天后，经流式细胞仪表型分析，表明其免疫效应细胞以ＣＤ８Ｔ细胞为主，其细胞增殖速度、增殖水平与ＣＤ３ＡＫ和ＬＡＫ相比明显升高，且对其抗原来源的胃癌细胞具有极强的杀伤活性（９８．５％），高于ＣＤ３ＡＫ（８２．１％）和ＬＡＫ（６２．０％）。     

白血病细胞可溶性蛋白抗原诱导抗白血病作用

目的探讨白血病细胞可溶性蛋白抗原诱导的抗急性白血病的特异性CTL作用。方法采用急性粒细胞白血病细胞可溶性蛋白抗原致敏体外培养的DC,并通过MTT法测定CTL活性。结果利用反复冻融法可获取可溶性蛋白抗原;在效应细胞:靶细胞为20∶1时,可溶性蛋白抗原组CTL活性达(38.83%±5.42%),不同效靶比对CTL活性无明显影响。结论可溶性蛋白抗原可诱导产生一定程度的抗白血病特异性CTL,为急性白血病微小残留病免疫治疗提供了1种有临床应用前景的方法。     

卵巢癌细胞系SKOV3冻融抗原诱导CTL特异性杀瘤效应的研究

目的探讨卵巢癌冻融抗原对T淋巴细胞的增殖作用及其诱导的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)在体外杀伤卵巢癌细胞的抗原特异性细胞毒性效应。方法采用免疫磁珠分离法(magnetic activated cell sorting，MACS)分离纯化正常人外周血CD3^ 细胞，体外以SKOV3卵巢癌细胞中提取的可溶性肿瘤抗原加以刺激。溴标法检测肿瘤抗原对T细胞增殖的影响；MTT法测定肿瘤抗原诱导的CTL体外杀伤卵巢癌细胞的能力；利用绒毛膜癌细胞抗原对比观察肿瘤抗原诱导CTL杀伤肿瘤细胞的抗原特异性。结果卵巢癌细胞抗原有很强的促进T淋巴细胞增殖的作用，且存在时间依赖性，在24h时促进作用最强。SKOV3抗原诱导的CTL在体外对SKOV3细胞的杀伤率为68．38％，显著高于它对JAR绒毛膜癌细胞的杀伤率(18．31％)；而JAR细胞抗原诱导的CTL对JAR和SKOV3细胞的杀伤率分别为61．02％和14．79％，有显著的抗原特异性(P=0．0001)。结论卵巢癌细胞冻融抗原诱导的CTL在体外具有很强的增殖能力和抗原特异性杀伤卵巢癌细胞的作用。     

可溶性胃癌抗原和抗CD_3单抗共同诱导杀瘤细胞的实验研究

用盐析法提取胃癌可溶性抗原（ＴＳＡ），并用抗ＣＤ３单抗和ＩＬ－２共同刺激正常人的外周血单核细胞，培养１０天后，经流式细胞仪表型分析，表明其免疫效应细胞以ＣＤ８Ｔ细胞为主，其细胞增殖速度、增殖水平与ＣＤ３ＡＫ和ＬＡＫ相比明显升高，且对其抗原来源的胃癌细胞具有极强的杀伤活性（９８．５％），高于ＣＤ３ＡＫ（８２．１％）和ＬＡＫ（６２．０％）。     

肺癌可溶性抗原联合超抗原诱导的DC疫苗对肺癌细胞杀伤作用的研究

背景与目的 通过经肺癌肿瘤可溶性抗原(TSA)和超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA)联合修饰致敏树突状细胞(DC)体外诱导对肺癌细胞杀伤作用的研究,为以DC为基础的肺癌免疫瘤苗的临床应用提供一定的实验依据.方法 3M KCI法提取人肺癌可溶性抗原;从人外周血单个核细胞(PBMC)中诱导扩增DC并鉴定;肺癌TSA和不同质量浓度的SEA联合修饰致敏DC;以联合抗原修饰后的DC、单纯肺癌抗原致敏的DC和未经抗原修饰的DC分别与同种异体T淋巴细胞共同孵育,MTT法测定混合淋巴细胞反应中DC的免疫刺激活性,诱导产生具有识别肺癌抗原的特异性CTL(作为效应细胞分别称为TSA-SEA-DCL、TSA-DCL、DCL);用流式细胞仪FCS及免疫染色法分析鉴定DC和效应细胞表型;M1T法检测各效应细胞对靶细胞体外杀伤效应.结果 诱导出表达CD1a,CD80,HLA-DR分子的DC;经肺癌TSA和SEA联合修饰致敏后,上述分子表达上调;联合修饰后的DC具有较强的免疫刺激活性,DC/T比例1:10可能为最适比例;TSA-SEA-DCL中CD3+CD8+细胞的比例大幅度增加;TSA-SEA-DCL对靶细胞GLC-82的杀伤率明显高于TSA-DCL及DCL,亦明显高于对肺癌CALU-6和人红白血病K562细胞的杀伤率.结论 经肺癌TsA和sE^联合修饰致敏的DC可诱导同种异体T淋巴细胞活化增殖产生CD8+表达增加的CTL;联合抗原诱导的DC疫苗对肺癌细胞有高效特异性的杀伤作用,肺癌TSA和超抗原SEA联合修饰的DC的活性明显强于单用肺癌TSA修饰.     

肿瘤抗原肽及CTL杀伤机理的研究进展

目前,对肿瘤抗原及其特异性T细胞介导的抗肿瘤免疫机理的研究,已成为抗肿瘤免疫治疗的一个热点［1］。本文对此领域的研究进展作简要综述如下：1肿瘤抗原肽肿瘤的抗原性是细胞毒T淋巴细胞（CTL）介导特异性抗肿瘤免疫治疗的关键。现已发现肿瘤细胞表面抗原分子是由MHC分子提呈的,这种肿瘤源性的多肽是通过分析MHCI类分子抗原结合沟槽的结构,以及与之相结合的抗原肽的序列所发现的。研究表明,与MHCI类分子结合的抗原肽来源于细胞内抗原,这些蛋白抗原被酶解成短肽后即转运至粗面内质网,在此与MHCI类分子结合的抗原肽片段一般为…     

肿瘤可溶性抗原免疫活性的实验研究

肿瘤抗原是肿瘤免疫中的核心问题,待别是在肿瘤疫苗的研制过程中,面临的首要问题是需要具有免疫原性的抗原.如何制备肿瘤抗原和估价肿瘤抗原免疫原性是制备肿瘤疫苗过程中亟待解决的问题,为此,我们提取了卵巢癌细胞的可溶性成分,用这种物质在体外先后两次刺激正常人外周血单个核细胞(PBMC),能够使其活化、增殖、分泌淋巴因子(TNF,INF),而只用抗原进行一次刺激时,则不能使PBMC活化、增殖和分泌淋巴因子,从而确定这种提取物具有免疫原性.提取这种卵巢癌细胞DNA、RNA、热休克蛋白(HSP)、膜蛋白、多肽等成分进行进一步的免疫原性分析发现:膜蛋白和多肽具有免疫原性.     

膀胱肿瘤抗原致敏的树突状细胞诱导 T 淋巴细胞抗肿瘤效应的研究

目的：研究经膀胱肿瘤抗原致敏后的树突状细胞（Dc）对T淋巴细胞的激活、增殖作用及对T24膀胱肿瘤细胞的抑癌效应。方法：分离健康供血者外周血单个核细胞及T淋巴细胞，联合应用粒／巨噬细胞集落刺激因子（GM—CSF）及白介素-4（IL-4）从单个核细胞中培养出Dc，以人膀胱癌细胞系T24肿瘤细胞裂解物刺激Dc，检测经膀胱肿瘤抗原致敏后的DC对T淋巴细胞的细胞增殖动力学影响并用M1rr显色法测定致敏Dc诱导的T淋巴细胞对T24膀胱肿瘤细胞体外的抗肿瘤效应。结果：膀胱癌细胞裂解物致敏的Dc可诱导T淋巴细胞强烈的增殖反应，与对照组比较具有显著性差异（P〈0．01）；增殖后的T淋巴细胞对T24膀胱肿瘤细胞有明显的细胞毒作用。结论：经膀胱肿瘤抗原致敏的Dc能诱导产生显著的T淋巴细胞增殖，在体外有明显的抑癌效应。     

膀胱肿瘤抗原致敏的树突状细胞诱导T淋巴细胞抗肿瘤效应的研究

目的：研究经膀胱肿瘤抗原致敏后的树突状细胞（Dc）对T淋巴细胞的激活、增殖作用及对T24膀胱肿瘤细胞的抑癌效应。方法：分离健康供血者外周血单个核细胞及T淋巴细胞，联合应用粒／巨噬细胞集落刺激因子（GM—CSF）及白介素-4（IL-4）从单个核细胞中培养出Dc，以人膀胱癌细胞系T24肿瘤细胞裂解物刺激Dc，检测经膀胱肿瘤抗原致敏后的DC对T淋巴细胞的细胞增殖动力学影响并用M1rr显色法测定致敏Dc诱导的T淋巴细胞对T24膀胱肿瘤细胞体外的抗肿瘤效应。结果：膀胱癌细胞裂解物致敏的Dc可诱导T淋巴细胞强烈的增殖反应，与对照组比较具有显著性差异（P〈0．01）；增殖后的T淋巴细胞对T24膀胱肿瘤细胞有明显的细胞毒作用。结论：经膀胱肿瘤抗原致敏的Dc能诱导产生显著的T淋巴细胞增殖，在体外有明显的抑癌效应。     

IL-18基因增强肿瘤抗原致敏DC诱导的CTL特异性杀伤肝癌细胞

目的:探讨腺病毒介导的白细胞介素18(IL18）基因转染能否使肿瘤抗原冲击的树突状细胞(dentritic cell,DC) 在体外诱导出更强的抗肝癌免疫反应。方法：携IL18 的重组腺病毒载体感染经肝癌细胞株HepG2冻融抗原致敏的DC(AdIL18HepG2/DC), FACS分析AdIL18HepG2/DC表面分子的表达, ELISA法检测IL18的分泌水平, 3HTdR掺入法检测T淋巴细胞增殖能力, MTT法检测细胞毒性T 淋巴细胞杀伤效应。结果： AdIL18HepG2/DC较未转染DC能高水平地表达CD1a、CD11c、CD80、CD86以及HLADR;较未经IL18转染的DC分泌较高水平的IL18。AdIL18HepG2/DC 能非常有效地刺激自体T 细胞增殖(CPM 值为228 018±1 079),其刺激强度显著强于AdIL18DC、HepG2/DC、AdlzcZ/DC及DC（均P＜0.05）。当靶细胞为HepG2时,AdIL18HepG2/DC诱导的CTL杀伤活性显著高于其他各组（均P＜0.05）,并且其杀伤能力与效应细胞数量成正比。结论： IL18 基因转染且肝癌抗原致敏的DC可以显著增强DC的特异性抗肝癌效应。     

Regulation of tumor growth by soluble spleen factors: effect of tumor resection

Supernatants of cultured spleen cells (SCS) from small-tumor-bearing mice (STBM) and large-tumor-bearing mice (LTBM) were tested in vivo by their ability to modify tumor development. We found that when inoculated with S13 tumor cells into the foot-pad of syngeneic normal BALB/c mice, SCS enhanced tumor growth as well as accelerated tumor takes. When STBM and LTBM were operated on, the persistence of the enhancing activity by SCS was found to be associated with tumor size at the time of tumor removal. As early as 24 hours after small-tumor resection, enhancing activity disappeared or diminished to undetectable levels. On the other hand, enhancing activity by SCS from large-tumor-resected mice (LTRM) persisted until 15 days after surgery, and then faded. Enhancing activity associated with SCS from S13-tumor-bearing mice (TBM) was also seen when injected with M3 cells, a syngeneic unrelated tumor. Normal SCS did not affect tumor development. It seems that the rate of disappearance of enhancing activity observed in SCS from S13-tumor-resected mice (TRM) is mainly dependent on the size of tumor burden at the time of surgery.     

肿瘤基因工程纳米疫苗NL(MH)抗肿瘤复发的实验研究

目的：在小鼠体内观察纳米疫苗NL（MH）抗肿瘤复发作用。方法：以PBS、空白脂质体、MH、MH／NL、NL（MH）免疫C57BL／6小鼠3次后，IFN-γ ELISPOT和LDH杀伤实验检测纳米疫苗激活小鼠特异性细胞免疫反应的情况；以肿瘤攻击实验和肿瘤切除后复发实验来评价纳米疫苗预防肿瘤复发作用。结果：与对照组相比，NL（MH）组小鼠脾淋巴细胞中分泌IFN-γ的T细胞数量明显增多（P〈0．05），CTL对B16-MAGE3细胞具有显著的特异性杀伤作用；在肿瘤攻击实验中，NL（MH）组B16-MAGE3肿瘤成瘤时间长、成瘤率低；肿瘤切除后，NL（MH）组B16-MAGE3肿瘤复发时间延迟，复发率明显降低。结论：NL（MH）能够刺激机体产生强烈的MAGE3特异性的细胞免疫反应，对表达MAGE3的肿瘤细胞具有显著的杀伤作用，能有效预防B16-MAGE3切除后复发。     

肿瘤特异性抗原纳米脂质体的制备及特性鉴定

目的:制备包裹肿瘤特异性抗原MAGE3/HSP70-FITC的纳米脂质体,研究其特性及树突状细胞(DC)对其摄取的情况。方法:采用薄膜分散法,制备包裹MAGE3/HSP70-FITC的纳米脂质体(简称NEMH-FITC),观察其形态并测量其粒径,凝胶层析法检测纳米脂质体的包裹率和载药量,并检测其稳定性。将人外周血DC与NEMH-FITC共育后,用激光共聚焦显微镜观察DC摄取NEMH-FITC的情况。结果:成功地制备出平均粒径为95nm左右的纳米脂质体,其包裹率为37%,载药量为0.037g/L,于4℃放置6个月后性质稳定。激光共聚焦显微镜下观察到NEMH-FITC可被DC摄取。结论:纳米脂质体具有良好的包裹率和载药量,可有效地增强抗原递呈细胞对所载药物的摄取,可作为肿瘤抗原疫苗的新型载体。     

肿瘤特异性抗原纳米脂质体的制备及特性鉴定

目的：制备包裹肿瘤特异性抗原MAGE3／HSP70-FITC的纳米脂质体，研究其特性及树突状细胞（DC）对其摄取的情况。方法：采用薄膜分散法，制备包裹MAGE3／HSP70-FITC的纳米脂质体（简称NEMH—FITC），观察其形态并测量其粒径，凝胶层析法检测纳米脂质体的包裹率和载药量，并检测其稳定性。将人外周血DC与NEMH—FITC共育后，用激光共聚焦显微镜观察DC摄取NEMH—FITC的情况。结果：成功地制备出平均粒径为95nm左右的纳米脂质体，其包裹率为37％，载药量为0．037g／L，于4℃放置6个月后性质稳定。激光共聚焦显微镜下观察到NEMH—FITC可被DC摄取。结论：纳米脂质体具有良好的包裹率和载药量，可有效地增强抗原递呈细胞对所载药物的摄取，可作为肿瘤抗原疫苗的新型载体。     

MHC class I-deficient metastatic tumor variants immunoselected by T lymphocytes originate from the coordinated downregulation of APM components

Previous reports from our group indicated that the MHC class I phenotype of metastatic lung colonies produced by a mouse fibrosarcoma tumor clone (B9) were, depending on the immune status of the host, MHC class I negative in immunocompetent mice and MHC class I positive in immunodeficient athymic nude/nude mice. Now we report the identification of the molecular alterations responsible for the changes of MHC class I molecules in both situations. Metastatic nodes were analyzed for the mRNA level of H-2 class I and beta2-microglobulin genes, and several gene components of the major histocompatibility complex (MHC) class I antigen-processing machinery (APM). These included the genes coding for the low-molecular-weight proteins LMP2, LMP7, LMP10, the transporter associated with antigen processing (TAP-1, TAP-2), and calnexin, calreticulin, tapasin, PA-28-alpha, PA-28-beta, ERP-59 and ER-60. Analyses with RT-PCR showed that TAP-1, TAP2, LMP-2, LMP7, LMP10, tapasin and calnexin mRNA specific for these genes was absent in metastases produced in immunocompetent mice. In contrast, similar techniques with mRNA preparations obtained from metastatic nodes from immunodeficient mice showed that the mRNA expression level of these genes was highly positive. Interestingly, the MHC class I-positive or negative phenotypes of the metastatic colonies correlated with in vivo immunogenicity. H-2 positive metastasis grew more slowly than the H-2 negative ones when injected intrafootpat in syngeneic immunocompetent animals and were finally rejected. These results provide evidence of the role of T cells in immune surveillance against tumors and identify a mechanism targeted by antitumor T lymphocytes to generate MHC class I-negative tumor escape variants.