Tie2基因RNA干扰慢病毒表达载体的构建与鉴定

目的构建并鉴定Tie2基因的RNA干扰慢病毒表达载体。方法先构建pNL-EGFP-U6-Tie2-siRNA慢病毒转移质粒,通过XbaⅠ酶切电泳及测序鉴定,再以pNL-EGFP-U6-Tie2-siRNA慢病毒转移质粒,pVSVG包膜质粒和pHelper包装质粒三质粒共转染293T细胞,产生慢病毒,收集病毒上清液并测定病毒滴度。结果成功构建pNL-EGFP-U6-Tie2-siRNA慢病毒转移质粒2条,通过XbaⅠ酶切及测序鉴定,Tie2-siRNA核苷酸序列插入正确,利用三质粒慢病毒包装系统生产EGFP-Tie2-siRNA病毒,收集病毒上清,并测得病毒滴度为9×103/μL。结论成功构建了Tie2基因的RNA干扰慢病毒表达载体。     

人PTEN基因RNA干扰及其RESC救援慢病毒载体的构建与鉴定

目的:构建人PTEN基因RNA干扰(RNAi)及其逃避RNAi策略结构(RESC)救援的慢病毒载体.方法:利用Invitrogen公司在线软件,针对已筛选确定的PTEN基因RNAi有效靶序列,设计并合成靶序列的oligoDNA,退火形成双链DNA,与经Xba I和XhoⅡ酶切后的pFLRu-GFP载体连接构建成pFLRu-U6-shPTEN慢病毒载体.在此基础上,引入外源设计的PTEN mRNA,与经EcoR I和BamH I酶切后的pFLRu-U6-shPTEN载体连接,从而产生在同一个载体内兼有人PTEN基因shRNA及其救援cDNA同时表达的RESC慢病毒载体pFLRu-U6-rrshPTEN.2者均转入到大肠杆菌XL10感受态细胞,制备质粒并用酶切及测序鉴定.分别用pFLRu-U6-shPTEN、pFLRu-U6-rrshPTEN与pCMV-dR8.2ΔR和pCMV-VSV-G质粒共转染293/包装细胞,包装产生2种慢病毒,收集病毒上清,系列稀释法检测病毒悬液的滴度.结果:氨苄青霉素抗性筛选阳性克隆、酶切鉴定、U6前引物测序鉴定结果显示pFLRu-U6-shPTEN和pFLRu-U6-rrshPTEN均为阳性克隆,且2种慢病毒的滴度分别为6.6 × 105和5.6 × 105pfu/mL.结论:成功构建出人PTEN基因RNAi及其RESC慢病毒载体.有效地避免了由于脱靶效应所引起的假阳性结果对实验的干扰,为研究PTEN基因功能提供了稳定的转染细胞载体.     

NOC2L基因重组慢病毒表达载体的构建及其在293T细胞中的表达

目的构建NOC2L基因重组慢病毒并使其在293T细胞中表达。方法通过设计引物及PCR扩增获得NOC2L全基因片段,将pCDH-GFP载体分别用XbaⅠ和BamHⅠ双酶切制备线性化载体;NOC2L全基因片段和线性化载体经切胶回收后,通过同源重组反应将NOC2L全基因片段连接到线性化的pCDH-GFP载体上,构建pCDH-NOC2L-GFP慢病毒表达载体;通过菌落PCR、质粒双酶切、测序等方法对构建的NOC2L基因重组慢病毒表达载体进行鉴定,利用构建的pCDH-NOC2L-GFP包装NOC2L慢病毒并使用该慢病毒感染293T细胞。结果菌落PCR、质粒双酶切和测序结果显示成功将NOC2L基因连接到pCDH-GFP载体上,使用构建成功的pCDH-NOC2L-GFP转染293T细胞,能够成功转染及包装NOC2L基因重组慢病毒,同时包装好的NOC2L基因重组慢病毒能够成功感染293T细胞并过表达293T细胞中的NOC2L基因。结论采用本研究方法能成功构建NOC2L基因重组慢病毒表达载体。     

大鼠PEDF基因RNA干扰慢病毒载体的构建与鉴定

目的 构建针对大鼠PEDF 基因的RNA干扰（RNAi）慢病毒表达载体并进行鉴定,探讨PEDF基因对缺血心肌血管新生的影响.方法 构建PEDF基因过表达质粒,测序鉴定.针对PEDF基因不同干扰靶点构建4种RNAi 病毒载体质粒pGCsi-U6/Neo/GFP/shRNA,测序鉴定.过表达质粒和RNAi质粒共转染293T细胞后应用Western blot方法进行外源筛靶确定PEDF基因RNAi 有效靶序列.有效RNAi 病毒质粒和其他3种辅助包装原件载体质粒通过Lipofectamine 2000共转染293T细胞,培养48 h后, 收集细胞培养上清液,将其浓缩后用孔稀释法测定病毒滴度.结果 过表达质粒及4种RNAi质粒构建成功.Western blot外源筛靶显示2个靶点能有效敲减目的基因的表达.PEDF shRNA慢病毒表达载体Serpinf1-RNAi-LV经293T细胞包装成功,收集293T细胞分泌的病毒上清测定浓缩病毒悬液的滴度为2×1012Tu/L.结论 成功构建了PEDF基因的RNAi慢病毒载体,为研究PEDF基因对缺血心肌血管新生的影响打下基础.     

小鼠BMPRⅠb基因慢病毒载体构建及转染神经干细胞

目的:构建携带小鼠BMPRⅠb基因的慢病毒载体,并转染神经干细胞,为研究BM-PRⅠb在BMPs调控神经干细胞分化中作用奠定基础。方法:利用RT-PCR从小鼠脑组织中获得BMPRⅠb基因,然后定向插入慢病毒表达质粒,进行双酶切及测序鉴定。将鉴定成功的重组慢病毒质粒和另外两种辅助质粒共转染包装细胞,收集、浓缩慢病毒并检测其滴度。利用获得的慢病毒载体转染NSCs,并观察目的基因表达情况。结果:RT-PCR产物经电泳及测序证实克隆成功BM-PRⅠb基因,酶切及测序鉴定成功构建重组慢病毒质粒,共转染293T细胞72h后大部分细胞表达绿色荧光,病毒滴度为5×108 TU/ml。慢病毒感染后的NSCs表达绿色荧光且BMPRⅠb mRNA表达上升。结论:成功构建BMPRⅠb基因慢病毒载体,并成功转染NSCs。     

TGFβ1基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定

目的:构建TGFβ1基因RNAi慢病毒载体.方法:根据人TCFβ1的mRNA序列选择3个靶序列并根据它们设计合成3对寡核苷酸序列.同时合成1对阴性对照寡核苷酸序列;将以上4对寡核苷酸序列退火后连人pRNA-U6/Lenti质粒,酶切和测序鉴定后,将以上质粒分别和包装质粒混合物共转染293FT细胞,包装产生病毒颗粒.各组病毒载体转染Hela细胞后,运用Real-Time PCR和ELISA检测TGFβ lmRNA和蛋白的表达水平.结果:酶切和测序证实目的寡核苷酸片段已被准确克隆到pRNA-U6/Lenti质粒;各质粒与包装质粒共转染293FT细胞后能产生高滴度的慢病毒载体颗粒;各组慢病毒载体感染Hela细胞后,有两组可以显著抑制TGFβ1mRNA水平及蛋白水平的表达,其中以第一组效果最佳.结论:成功构建了人TGFβ1基因RNAi慢病毒载体.     

凋亡蛋白抑制因子Livin shRNA慢病毒载体的构建与鉴定

目的 构建并鉴定凋亡蛋白抑制因子Livin基因短发夹状干扰RNA(shRNA)慢病毒我体,以便进一步研究Livin的功能.方法 针对已经筛选确定的Livin基因RNAi有效靶序列,合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经Hpa I和Xho I酶切后的pGCL-GFP载体[含U6启动子和绿色荧光蛋白(GFP)]连接、转化,产生pLV-shLivin慢病毒表达载体,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定.用pLV-shLivin,pHelper 1.0和pHelper 2.0 3种质粒共转染包装细胞人胚肾293T细胞,包装产生重组慢病毒,以293T细胞GFP蛋白的表达水平测定病毒滴度.结果 PCR和测序证实,成功构建Livin shRNA的慢病毒栽体LV-shLivin.包装慢病毒,浓缩病毒悬液的滴度为3×108TU/ML.结论 成功构建Livin基因sbRNA慢病毒栽体,为应用RNAi研究Livin功能奠定基础.     

慢病毒Lenti-CXCR4-siRNA载体的构建

目的构建介导CXCR4 RNA干扰的Lenti-CXCR4-siRNA慢病毒载体。方法将人工合成的CXCR4 siRNA经PCR扩增聚合后与线化的载体GV115连接,XhoI酶切及测序鉴定该表达质粒pLenti-CXCR4-siRNA,按Lenti-X Bicis-tronic Expression System操作手册构建Lenti-CXCR4-siRNA慢病毒,纯化后测定其滴度。结果凝胶电泳显示PCR扩增聚合产物大小正确(约60 bp)。表达质粒pLenti-CXCR4-siRNA可被XhoI内切酶线化。碱基测序证实碱基序列与设计序列一致。重组Lenti-CXCR4-siRNA慢病毒的包装细胞293T可见绿色荧光,纯化后测定其滴度,病毒滴度为2×109TU/ml。结论成功构建了高滴度的重组Lenti-CXCR4-siRNA慢病毒。     

ABCE1特异性siRNA慢病毒载体的构建与鉴定

目的构建并鉴定ABCE1基因短发夹状干扰RNA（shRNA）慢病毒载体,以便进一步研究ABCE1的功能。方法针对已经筛选确定的ABCE1基因RNAi有效靶序列,合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经BamHⅠ和HindⅢ酶切后的pRNAT-U6.1/GFP载体连接、转化,产生pLV-sh-ABCE1慢病毒表达载体,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定。用pLV-sh-ABCE1、pHelper 1.0和pHelper 2.0 3种质粒共转染包装细胞人胚肾293T细胞,包装产生重组慢病毒,以293T细胞GFP蛋白的表达水平测定病毒滴度。结果PCR和测序证实,成功构建ABCE1shRNA的慢病毒载体pLV-sh-ABCE1。包装慢病毒,浓缩病毒悬液的滴度为2×108TU/ML。结论成功构建ABCE1基因shRNA慢病毒载体,为应用RNAi研究ABCE1功能奠定基础。     

人THAP11慢病毒载体的构建及表达研究

目的 构建人死亡相关蛋白11(THAP11)基因的慢病毒载体,并建立其慢病毒表达系统.方法 PCR方法获得人THAP11基因,限制性内切酶酶切和基因重组构建慢病毒载体质粒pBPLV-THAP11-myc,并通过转染HEK293细胞观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达以及Western blot检测其表达.在脂质体介导下将重组质粒与包装质粒pLP1和pLP2、包膜质粒pLP/VSVG共转染293FT细胞包装产生慢病毒.结果 构建的质粒经PCR,酶切及测序鉴定正确;该质粒与包装质粒共转染293FT细胞获取的5.5×106TU/ml慢病毒滴度.结论 成功构建了人THAP11基因慢病毒载体质粒THAP11-myc-pBPLV,并建立了其慢病毒表达系统,为后续的应用研究奠定了基础.     

靶向大鼠HIF-1α的RNAi慢病毒载体的构建及鉴定

目的构建靶向HIF-1α的RNAi慢病毒载体,为进一步观察其对难治性癫痫大鼠模型脑内HIF 1α基因过度表达的干扰作用奠定基础。方法根据GenBank报道的大鼠HIF-1α基因序列,选择4个靶序列,设计并合成4对含编码短发夹RNA(shRNA)序列的寡核苷酸,双链退火后,插入经限制性内切酶Age I和EcoR I处理所得的线性化慢病毒载体pGCSIL-GFP(表达绿色荧光蛋白,GFP)的U6启动子下游,合成4种重组病毒pGCSIL-GFP-shRNA1,2,3,4,经酶切和测序鉴定构建正确后,分别与Lipofectamine 2000共转染293T细胞包装,收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液浓缩后得到高滴度的慢病毒液,孔稀释法测定病毒滴度。采用同样方法构建阴性对照重组慢病毒。结果酶切和测序分析证实成功构建了靶向大鼠HIF-1α的慢病毒表达载体4对,滴度为(5～7)×108 TU/ml。结论本实验成功构建了针对大鼠HIF-1α基因的RNAi慢病毒载体,为实现在细胞和动物模型以慢病毒为载体的HIF-1α靶向治疗提供了良好的实验基础。     

VEGF干扰慢病毒载体的构建及其在MHCC97L细胞中的表达

目的构建VEGF基因RNA干扰（RNAi）慢病毒载体并实现其在人肝癌细胞MHCC97L中表达。方法根据人VEGF基因序列,设计并合成包含靶序列的互补DNA链,连接线性化的plenti6.3-MIR载体,构建miRNA慢病毒载体质粒,并转化至感受态细胞DH5α,进行测序验证。在脂质体介导下转染293T细胞,包装生产慢病毒,测定其滴度。慢病毒载体转染人肝癌细胞MHCC97L,用Real-time PCR检测RNAi组（MHCC97-200）、阴性对照组（MHCC97-NEGA）和空白对照组（MHCC97-空白）中VEGF的表达情况,确定其干扰VEGF表达的有效性。结果测序证实慢VEGF基因RNAi病毒载体质粒构建成功。慢病毒载体经293T细胞包装成功,测定病毒的滴度为3.23×109TU/mL。慢病毒载体转染人肝癌细胞MHCC97L 48 h后,VEGF基因在mRNA水平抑制了72.2%。结论 VEGF基因RNAi慢病毒载体构建成功,并实现在人肝癌细胞MHCC97L中的表达。     

携强绿色荧光蛋白重组慢病毒的构建及其在原代培养SD大鼠皮层神经细胞中的表达

目的：构建携带强绿色荧光蛋白的重组慢病毒（Lent/EGFP）,感染原代培养SD大鼠皮层神经细胞,观察其感染能力及报告基因的表达水平。方法：采用PCR方法克隆EGFP cDNA;将EGFP基因片段亚克隆到慢病毒穿梭质粒多克隆位点内;用4质粒共转染系统在293ET细胞中包装出携带EGFP基因的重组慢病毒Lent/EGFP;重组病毒感染NIH 3T3细胞,FACS检测重组病毒滴度;Lent/EGFP感染体外培养的原代SD大鼠皮层神经细胞,共聚焦荧光纤维镜观察原代神经细胞内绿色荧光蛋白的表达情况。结果：基因测序证明克隆的EGFP cDNA与GenBank提供的序列完全一致;琼脂糖凝胶电泳结果证实EGFP正确插入pLenti6/V5TOPO;FACS检测病毒滴度为2×10⁶;在体外分离培养的原代SD大鼠皮层神经细胞中,重组病毒感染72 h后可见较强的绿色荧光蛋白表达。结论：采用改良的4质粒共转染方法成功构建了携EGFP的重组慢病毒载体;Lent/EGFP对非分裂的神经细胞具有较强的感染能力,且携带的EGFP基因可以在神经细胞内有效表达。     

MMP-9基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定

目的构建小鼠基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)RNA干扰(RNA interference,RNAi)慢病毒载体。方法针对小鼠MMP-9基因序列,利用公用网站按照RNAi序列设计原则,设计RNAi靶点序列,并合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经HpaⅠ和XhoⅠ酶切后的pGCL-GFP载体连接产生短发卡RNA慢病毒载体,用插入鉴定引物进行PCR鉴定阳性克隆并测序,应用Western blot在293T细胞中鉴定MMP-9表达的下调作用。结果PCR鉴定和DNA测序结果显示合成的含MMP-9 shRNA慢病毒载体寡核苷酸链插入正确;构建的MMP-9RNAi慢病毒载体能够抑制MMP-9的表达。结论应用基因工程技术,成功构建了小鼠MMP-9基因RNAi慢病毒载体,为应用于在体基因治疗创造了条件。     

转录因子E2F-1基因RNA干扰慢病毒载体的构建与鉴定

目的：构建细胞周期相关转录因子E2F-1RNA干扰（RNAi）慢病毒表达载体。方法：选取E2F-1基因的19nt特异性序列,设计针对E2F-1的shRNA序列,应用基因重组技术克隆到pLentiLox3.7（pLL3.7）慢病毒表达载体中,XbaI和NotI进行双酶切和DNA测序鉴定重组克隆,在脂质体的介导下将慢病毒的混合包装载体质粒和包含E2F-1基因RNAi的重组慢病毒载体共转染293FT细胞,包装成病毒48h后,收集病毒颗粒,孔稀释法测定病毒滴度。结果：双酶切证实shRNA正确插入慢病毒载体,DNA测序证实插入的序列正确;293FT细胞包装E2F-1基因RNAi的重组慢病毒载体成功;收集的细胞培养上清液中,病毒的滴度为5×10^7TU/mL。结论：成功构建人E2F-1基因RNAi慢病毒载体,为研究E2F-1对于胃癌生长的影响提供了稳定的转染细胞载体。     

携带EGFP与rtTA双基因的逆转录病毒载体的构建及其在PA317细胞中的表达

目的 构建表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)、rtTA双基因的重组逆转录病毒载体pLXSN-EGFP-rtTA,并在PA317细胞中表达.方法 以质粒pEGFP-C1为模板进行PCR反应获得EGFP基因片段,定向插入逆转录病毒载体pLXSN,筛选出正确的重组逆转录病毒载体pLXSN-EGFP.PCR方法从pTet-on质粒中扩增出rtTA基因,酶切纯化后克隆于逆转 录病毒载体pLXSN-EGFP中,限制性内切酶酶切分析及PCR鉴定筛选出正确的重组载体pLXSN-EGFP-rtTA,脂质体介导转染PA317细胞,PCR方法检测PA317细胞内EGFP、rtTA基因,RT-PCR方法检测PA317细胞内rtTA基因的mRNA表达,荧光显微镜观察EGFP基因的表达情况.以NIH3T3细胞为靶细胞测定重组逆转录病毒滴度.结果 成功构建了表达EGFP、rtTA双基因的重组逆转录病毒载体,转染PA317细胞后,RT-PCR方法可检测到rtTA基因的mRNA表达,荧光显微镜下可观察到EGFP基因表达所产生的绿色荧光,说明连接有EGFP和rtTA双基因的逆转录病毒载体在PA317细胞中可正常表达,转染pLXSN-EGFP-rtTA载体的PA317细胞可产生4.8x 104 CFU/ml病毒滴度的重组病毒.结论 成功构建表达EGFP、rtTA双基因的重组逆转录病毒载体,该载体可在PA317细胞内正常表达,获得较高滴度的病毒上清.     

人Runx3基因重组慢病毒载体的构建与鉴定

目的构建人Runx3基因重组慢病毒载体。方法 PCR扩增Runx3基因,应用In-Fusion技术将Runx3基因PCR扩增产物交换进入线性化慢病毒载体pGC-FU以构建重组慢病毒质粒pGC-FU-Runx3,并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。对长出的阳性克隆进行PCR鉴定,并进行测序和比对分析。将构建成功的重组慢病毒质粒pGC-FU-Runx3与包装质粒pHelper 1.0、包膜质粒pHelper 2.0共转染293T细胞进行病毒包装。荧光显微镜下观察重组慢病毒质粒pGC-FU-Runx3转染293T细胞后细胞内绿色荧光表达情况。Western blot检测Runx3与EGFP融合蛋白表达情况。实时定量PCR测定病毒滴度。结果重组慢病毒质粒pGC-FU-Runx3经测序和比对分析证实目的基因序列正确。三质粒共转染293T细胞后荧光显微镜下观察细胞内可见明显的绿色荧光。Western blot证实Runx3与EGFP融合蛋白在293T细胞内稳定表达。浓缩病毒后测定滴度为2.0×108TU/ml。结论成功构建携带人Runx3基因的重组慢病毒载体pGC-FU-Runx3,为进一步研究Runx3过表达对慢性乙型肝炎患者外周血Th细胞分化的影响奠定基础。     

鼠VEGF红色荧光慢病毒载体的构建及其在293T细胞中的表达

目的 构建含鼠血管内皮细胞生长因子(mVEGF)红色荧光慢病毒载体,鉴定其在293T细胞中的表达.方法 构建含mVEGF和红色荧光蛋白(DsRed)基因双顺反子重组慢病毒质粒;采用脂染法将慢病毒系统三质粒共转染293T细胞,转染后24 h和48 h荧光显微镜下观察DsRed表达,收集48 h 和72 h病毒上清并感染靶细胞239T,荧光显微镜下观察DsRed表达情况,并行Western blot分析培养上清和胞浆内mVEGF表达.结果 成功构建慢病毒表达质粒pTK208-mVEGF-IRES-DsRed,重组慢病毒滴度达5×106 PFU/ mL,并获得蛋白DsRed和mVEGF的表达.结论 含mVEGF红色荧光慢病毒质粒成功介导mVEGF蛋白的表达,该载体有望为研究VEGF的病理生理学机制及基因靶向治疗提供有效的工具.