大鼠乳鼠皮肤成纤维细胞的分离和体外培养

目的建立大鼠乳鼠背部皮肤组织和尾尖部皮肤组织成纤维细胞的体外培养方法,并比较二者的区别。方法分别取大鼠乳鼠的背部和尾尖部皮肤组织,利用组织贴块法分离和培养皮肤成纤维细胞,用酶消化法进行细胞传代培养,采用梯度温度冻存细胞。倒置显微镜下观察成纤维细胞的形态,用细胞骨架波形蛋白抗体进行鉴定。结果光学显微镜下3~5 d可见细胞从组织块游出,7 d细胞数量增多,10 d可贴满培养瓶壁;且大鼠乳鼠背部和尾尖部来源的皮肤成纤维细胞波形蛋白表达均为阳性。结论大鼠乳鼠背部和尾尖部来源的皮肤成纤维细胞的生物特点无差别,均可作为皮肤成纤维细胞的取材部位。     

犬皮肤成纤维细胞的分离、培养及鉴定

目的 探索和建立适用于犬皮肤成纤维细胞的体外分离、培养及鉴定的技术方法.方法 采用组织贴块培养法和胰蛋白酶、胶原酶I联合消化法对犬皮肤成纤维细胞进行体外培养、传代.并对所培养的细胞进行倒置显微镜观察和苏木素-伊红染色,观察成纤维细胞形态,并对培养细胞行波形蛋白免疫荧光染色.结果 倒置相差显微镜下可见长梭形细胞生长,苏木素-伊红染色可见细胞呈漩涡状、平行排列,第5代细胞免疫荧光检测波形蛋白(vimentin)表达阳性.结论 建立了高效快速分离和稳定培养成纤维细胞的方法,为诱导犬心房纤维化提供了充足的种子细胞.     

兔Tenon’s囊组织原代成纤维细胞分离培养与鉴定

目的:改良和补充兔Tenon’s囊组织原代成纤维细胞的分离培养、鉴定方法,为开展抗青光眼术后滤过泡瘢痕化的药物研究提供成熟的原代成纤维细胞。方法:应用组织块培养法,无菌条件下摘取组织,机械剪碎,于含10%胎牛血清的DMEM中培养,显微镜下观察细胞形态,免疫荧光法鉴定,实时荧光定量PCR法检测细胞波形蛋白、角蛋白的mRNA水平。结果:分离培养的细胞具有成纤维细胞形态,7-10d从组织块周围大量爬出,15d铺满培养皿;免疫荧光法鉴定显示,波形蛋白表达阳性,角蛋白阴性表达;实时荧光定量PCR检测出细胞中波形蛋白mRNA水平远远高于角蛋白。结论:改良和补充了兔Tenons囊组织成纤维细胞原代培养与鉴定方法,为后续青光眼术后滤过泡抗瘢痕化的药物研究奠定基础。     

大鼠乳鼠颌下腺成纤维细胞的分离培养及鉴定

探讨大鼠乳鼠颌下腺成纤维细胞体外分离及培养的方法.采用0.125％胰酶多次消化法收集新生SD大鼠乳鼠颌下腺成纤维细胞.高内涵细胞成像法检测细胞增殖能力,免疫荧光、Western blot和RT-PCR法检测波形蛋白表达水平,CD90标记成纤维细胞、鉴定细胞纯度.最新消化分离得到的细胞呈亮球形,轮廓清晰,单个散在或聚集成团分布,90 min后即有大量细胞贴壁,其中部分细胞已开始伸展.5～6 d可形成单层细胞,传代后的细胞呈长纺锤形或多边形.波形蛋白表达呈强阳性.传代3代的细胞培养体系中成纤维细胞约占87％.含5％FBS的DMEM/F12培养基培养24 h即可检测到细胞的大量增殖.胰酶消化法是获得大鼠乳鼠颌下腺成纤维细胞的有效方法.     

RSK2通过调控人皮肤成纤维细胞的增殖与迁移促进皮肤创面修复

目的：探究RSK2对皮肤创面修复的影响及其可能机制。方法：采用Western blot与免疫荧光染色实验检测皮肤创伤组织中RSK2的表达差异。通过人原代真皮成纤维细胞（HDF）划痕实验、CCK-8增殖实验及Western blot实验,在细胞水平探究RSK2抑制剂Bix 02565对HDF的作用。通过HE染色、Masson染色与免疫荧光染色,在体内水平观察RSK2抑制剂对皮肤创面修复的影响。结果：Western blot及免疫荧光实验结果显示皮肤创伤并不影响皮肤成纤维细胞中RSK2总蛋白的表达,而在体外水平上利用Bix 02565抑制RSK2的活性可显著抑制成纤维细胞的增殖与迁移,抑制G1/S-特异性周期蛋白-D1（Cyclin D1）与纤维粘连蛋白（Fibronectin）的表达,在动物水平RSK2抑制剂可抑制成纤维细胞的增殖细胞核抗原（PCNA）与胶原纤维生成,抑制血小板-内皮细胞黏附分子（CD31）的表达,阻滞血管的新生,延缓小鼠皮肤创面修复速率。结论：RSK2可通过促进成纤维细胞的增殖与迁移、血管新生,进而促进皮肤创面修复。     

甲床细胞体外培养的实验研究

目的探讨甲床上皮细胞及成纤维细胞体外培养的可行性。方法取20周以上引产胎儿的甲床,采用组织块培养法进行原代培养获得甲床上皮细胞和成纤维细胞,观察细胞形态,进行HE染色,免疫组织化学染色对细胞进行鉴定,甲床上皮细胞检测皮肤型角蛋白17,成纤维细胞检测波形蛋白。结果甲床上皮细胞培养2～3 d从组织块中游出,并在组织块周围形成生长晕,13 d左右细胞生长密度可达瓶底的70%～80%,扁圆形细胞,呈铺路石样排列。70%以上特异性角蛋白17抗体染色阳性,证明培养的细胞为甲床上皮细胞;甲床成纤维细胞培养3 d观察可见组织块周围有许多生长的细胞,细胞呈现圆或长梭形、等成纤维细胞的特征,胞体丰富,胞质均匀,细胞核清晰可见,11 d左右细胞生长密度可达瓶底的70%～80%。培养甲床成纤维细胞抗波形蛋白抗体染色阳性,说明培养的细胞为成纤维细胞。结论通过组织块法成功培养出甲床上皮细胞及成纤维细胞,为组织工程甲床的深入研究奠定了基础。     

猕猴肺成纤维细胞的不同分离培养方法及鉴定比较

目的 比较不同方法提取猕猴肺成纤维细胞的效率及对细胞相关功能的影响,为获得类似人肺成纤维细胞提供有效方法。方法 采用两种猕猴肺成纤维细胞的提取方法,组织块黏附法和胶原酶联合消化+组织黏附法。倒置显微镜观察细胞形态,免疫荧光鉴定猕猴肺成纤维细胞,CCK-8检测细胞活力,流式细胞仪检测肺成纤维细胞标志物α-SMA的表达,凋亡试剂盒检测细胞凋亡,Western blot检测细胞α-SMA蛋白水平表达。结果 组织黏附法贴壁的组织块72 h后可见小而亮的细胞爬出,4～5 d后细胞小范围爬出,呈长梭形;7 d后可见细胞大范围爬出,形成单层细胞,传代后细胞均呈长梭形。用胶原酶联合消化+组织黏附法处理后24 h即可见小而亮的细胞从组织块中爬出,48 h后可见细胞大范围爬出,细胞呈长梭形;4～5 d后可形成单层细胞,传代后的细胞均呈长梭形,用免疫荧光鉴定均表达α-SMA。实验结果显示胶原酶联合消化+组织黏附法提取的肺成纤维细胞的活力明显高于组织黏附法所得细胞活力。TGF-β1刺激肺成纤维细胞后,胶原酶联合消化+组织黏附法提取的细胞增殖更快,α-SMA蛋白表达更高。结论 两种方法均能体外分离出猕猴肺成纤维...     

钒化钠对小鼠成纤维细胞NIH3T3细胞株Cyclin D1表达的影响

目的：研究钒化钠对小鼠成纤维细胞NIH3T3细胞株细胞周期蛋白（Cyclin）D1表达的影响,探讨钒化钠在细胞生长中的作用机制。方法：以体外培养小鼠成纤维细胞NIH3T3细胞株为研究对象,给予0、0．1、1．0、5．0、10．0、100．0、200．0μmol／L钒化钠,培养4小时后,用Western blot技术检测小鼠成纤维细胞NIH3T3细胞株Cyclin D1表达情况。结果：5．0、10．0μmol／L钒化钠组培养4小时后,Cyclin D1蛋白表达均增高;100．0、200．0μmol／L钒化钠组培养4小时后,Cyclin D1蛋白表达均降低。结论：钒化钠可通过上调和下调Cyclin D1的蛋白表达的双重作用,来影响细胞的生长。     

人工真皮成纤维细胞的分离培养与鉴定

目的:建立人工真皮成纤维细胞分离培养及鉴定方法.方法:取出生24 h内的Wistar大白鼠背部皮肤,分别用组织块法及酶消化法分离纯化、传代培养,用免疫组织化学方法进行鉴定.结果:用组织块法和酶消化法培养的成纤维细胞呈梭形,属纤维型细胞,免疫组织化学染色95%以上细胞中间丝波形蛋白呈棕色颗粒或棕色着染(阳性);结蛋白抗体和第Ⅷ因子相关抗原均无棕色颗粒或棕色着染(阴性),表明所培养的细胞为比较纯净的成纤维细胞.结论:该培养方法可提供较纯净的足够量的成纤维细胞.     

乳小鼠心肌成纤维细胞和心肌细胞的分离培养及荧光鉴定

目的探讨和建立适用于乳小鼠心肌成纤维细胞和心肌细胞体外分离、培养及鉴定的技术方法。方法乳小鼠心脏剪成组织块,用Ⅱ型胶原酶加胰蛋白酶联合消化法分离细胞,再通过差速贴壁分离法分别收集、培养乳小鼠心肌成纤维细胞和心肌细胞。光学显微镜下分别观察成纤维细胞和心肌细胞的基本形态特征的变化,并对2种细胞行苏木素-伊红(HE)染色,用第2代心肌成纤维细胞行波形蛋白免疫荧光鉴定,而原代心肌细胞行α-横纹肌肌动蛋白、心肌肌钙蛋白和心肌肌球蛋白重链免疫荧光鉴定。结果差速贴壁分离法心肌成纤维细胞原代培养90 min基本贴壁,贴壁较早,培养第3～5代细胞生长良好,72 h心肌成纤维细胞波形蛋白免疫荧光鉴定纯度高达97%;而心肌细胞贴壁较晚,24 h贴壁后部分心肌细胞出现自发性搏动现象,48 h后细胞逐渐展开,72 h后逐渐形成细胞簇并出现同步搏动,心肌肌球蛋白重链、心肌横纹肌肌动蛋白、心肌肌钙蛋白免疫荧光鉴定心肌细胞纯度分别为95%、93%、95%。结论差速贴壁分离法结合免疫荧光鉴定可分离乳小鼠心肌成纤维细胞和心肌细胞,此方法成熟、稳定、有效,为研究心脏疾病的基础与临床研究提供了理想的实验模型。     

优化贴壁法人皮肤成纤维细胞的原代培养

目的:优化贴壁法原代培养人皮肤成纤维细胞的条件,建立稳定?经济?高效可行的人皮肤成纤维细胞培养方法?方法:采用包皮环切术后皮肤组织,剪成均匀组织块后贴壁,皮肤边缘长出薄层致密细胞团后胰酶消化?传代,并对所培养的细胞进行形态学观察及细胞免疫荧光鉴定?此方法与酶消化法相对照?结果:优化贴壁法成功率100%,取得组织后2 d沿皮肤边缘均开始生长高密度类圆形细胞层,在1周内可获得高质量?高数量的细胞,传代贴壁后经镜下形态观察及细胞免疫荧光染色确定为皮肤成纤维细胞?结论:较之酶消化法,优化贴壁法细胞存活率高,活性及纯度好?该方法可稳定?经济地获得足够数量的细胞?     

急性肺损伤患者诱导性多能干细胞系的建立

目的利用急性肺损伤患者皮肤成纤维细胞构建诱导性多能干细胞（induced pluripotent stem cells, iPSCs）系。方法采用
慢病毒介导逆转录的方法,将含有Oct4、Sox2、Klf4和Nanog四个因子的混合慢病毒转染人皮肤成纤维细胞,诱导出胚胎干细胞
样克隆。根据人胚胎干细胞的特性,利用AP染色、实时荧光定量PCR（RT-PCR）技术、免疫荧光、畸胎瘤形成实验对获得的iPS
细胞进行鉴定。结果获得的iPS细胞镜下观察呈典型的ES样克隆状生长,圆形或椭圆形,与饲养层细胞分界清楚;AP染色阳
性,RT-PCR及免疫荧光检测iPS细胞高表达人胚胎干细胞标志性基因及蛋白,移植到免疫缺陷鼠体内能够形成向三胚层分化的
畸胎瘤。结论成功建立了急性肺损伤患者iPS细胞系,可为急性肺损伤的发病机制研究和临床药物筛选提供良好的细胞模型。
     

雌激素对人正常皮肤成纤维细胞的影响

目的:探讨雌激素对人正常皮肤成纤维细胞的影响,为进一步探讨雌激素抗皮肤衰老的机制和开发抗衰老护肤品提供新思路。方法:采集正常成人皮肤标本,分离培养真皮成纤维细胞;以流式细胞术检测17β-E2作用前后成纤维细胞内活性氧(ROS)水平的改变,以及检测丙二醛(MDA)含量和三种抗氧化酶(SOD,GSH-px,Cat)的活性。结果:①雌激素浓度为1×10-6-1×10-10mol/L(生理浓度至药理浓度范围之内)时,可促进人皮肤成纤维细胞的增殖;②雌激素浓度为1×10-7-1×10-10mol/L时,可以减少人正常皮肤成纤维细胞内MDA的生成,加速三种抗氧化酶的产生;③1×10-6-1×10-10mol/L雌激素作用于人皮肤成纤维细胞后,可以降低细胞内活性氧(ROS)的产生。结论:雌激素在一定浓度时具有改善人正常皮肤成纤维细胞生物学特性的作用,且药物浓度与对人皮肤成纤维细胞的作用密切相关。     

碱性成纤维细胞生长因子在不同发育阶段大鼠和小鼠皮肤的表达特征及其意义

目的 研究碱性成纤维细胞生长因子（bFGF)蛋白,基因以及因子受体在大鼠和小鼠不同发育阶段表皮和真皮的表达特征及其可能的生物学意义。方法 取胚胎期、新生,青年和成年大小鼠皮肤,部分经超低温冷冻后用于逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测,部分经4%多聚甲醛固定,包埋与切片后用SP免疫组织化学,原位杂交以及RT-PCR方法确定bFGF蛋白,基因以及因子受体的定位与表达特征。结果 bFGF蛋白的阳性表达可见于新生,青年以及成年3个发育阶段大鼠皮肤,主要位于表皮细胞,真皮成纤维细胞,毛囊上皮细胞和血管内皮细胞胞浆,但在胚肥大 鼠皮肤bFGF的表达为阴性,bFGF受体与bFGF基因在以上4个不同发育阶段大鼠表皮与真皮均有表达,其表达量随动物的生长而有所增加,bFGF蛋白,基因以及受体在小鼠4种不同发育阶段的表皮与真皮均有表达,其定位与表达特征与bFGF在青年期大鼠皮肤一致。结论 bFGF蛋白及其相应受体在不同发育阶段大小鼠皮肤的强阳性表达,表明它们以自分泌方式对上皮的生长、发育、表型维持以及损伤后的修复十分重要。而大鼠胚胎皮肤bFGF低表达或无表达的结果表明它可能是动物胚胎创伤后无瘢痕愈合的原因之一。其深层次的机制需要进一步研究。     

胚胎垂体移植的实验性研究

目的 :探讨移植的胚胎垂体组织的成活以及理想的移植部位的选择。方法 :将体外培养的人胎垂体组织细胞移植于雌性裸鼠的正中隆起、肾包膜下、项部皮下和臂大肌。用放免分析法定期测定裸鼠血中垂体激素含量。结果 :各移植组裸鼠血中垂体激素含量均显著性升高 ,但各移植组之间无显著差异。移植后 15d激素含量达高峰 ,随后逐渐降低 ,2 5d后趋于稳定。结论 :培养后的人胎垂体组织细胞能在裸鼠体内存活 ,并具有分泌功能 ;项部皮下是比较理想的移植部位。     

DNA重新甲基化酶3b在成年及新生小鼠部分组织中的选择性？…

目的 探讨哺乳动物ＤＮＡ重新甲基转移酶３ｂ（Ｄｎｍｔ３ｂ）在新生及成年小鼠多种组织中的选择性剪接表达。方法 采用ＲＴ－ＰＣＲ结合毛细管电泳分析新生及成年小鼠主要器官中Ｄｎｍｔ３ｂ的选择性剪接表达产物,并通过计算机分析Ｄｎｍｔ３ｂ外显子１０和外显子２１、２２选择性剪接对该基因功能可能产生的影响。结果 成年小鼠肝组织中大部分Ｄｎｈｍｔ３ｂ转录本保留外显子１０,而其它组织的大部分转录本中此序列被剪切掉。     

心肌成纤维细胞成为基因靶细胞的可行性研究

目的探索心肌成纤维细胞成为基因靶细胞的可行性。方法采用改良的差速贴壁法培养乳鼠心肌成纤维细胞并加以鉴定；利用携带新霉素抗性基因（neo’）的假型逆转录病毒载体（VSV-G／MuLV）转导培养的乳鼠心肌成纤维细胞。用G418筛选法观察基因转导效果。结果成功建立高纯度心肌成纤维细胞培养模型；转基因后的心肌成纤维细胞经（3418筛选后2周置右见大量克隆形成。结论假型病毒载体成功介导neo＇基因转导入心肌成纤维细胞。表明心肌成纤维细胞有望成为心血管疾病基因治疗的靶细胞。     

原代人牙周膜成纤维细胞的培养及培养方法的改进

目的：探讨如何提高人牙周膜成纤维细胞原代培养的成功率。方法：组织来源于11～15岁青少年因正畸而拔除的前磨牙，刮取牙根中1／3的牙周膜组织，组织贴壁培养法进行培养采用冠根分离控制取材中的污染，首次传代前进行细胞分散的方法来提高传代的成功率，并对培养细胞的形态及超微结构进行了观察。结果：经免疫组化染色证实所培养的细胞为牙周膜成纤维细胞，通过冠根分离法可有效的控制组织污染，首次传代前进行细胞分散可提高细胞传代成功率，从而使细胞培养成功率提高。结论：获得人牙周膜成纤维细胞，培养成功率在15％～20％。     

N-甲基-D-天冬氨酸对豚鼠耳蜗内电位的影响

目的：观察N－甲基－D－天冬氨酸（NMDA）对耳蜗电位的影响,探讨NMDA对耳蜗的神经毒性作用。方法;用圆窗电极测试耳蜗的基础复合动作电位（CAP）和微音器电位（CM）后,在5只豚鼠的圆窗上涂抹Hanks液,并保留20min作为对照,然后再涂沫NMDA,也保留20min。结果：NMDA升高所有频率的纯音诱发的CAP阈值,阈移在13－27dB;显降低CAPN1波幅,波幅被抑制达50％－75％,显延长CAP的潜伏期（P＜0．05）,NMDA对所有频率纯音诱发的CM均无影响。结论：NMDA对耳蜗具有神经毒性作用,NMDA受体参与了介导谷氨酸的兴奋毒性作用。     

阻断转化生长因子-β信号转导抑制伤口瘢痕的实验研究

目的　探讨用基因治疗手段阻断伤口内细胞转化生长因子 β(TGF β)的信号转导来抑制瘢痕形成的可行性。方法　用含TGF β截短型受体 (tTGF βRII)基因的重组腺病毒 (10 0空斑形成单位 /细胞 ,pfu/细胞 )感染正常人皮肤成纤维细胞 ,Northern印迹观察tTGF βRII表达对TGF β1基因表达的调控。将 β 半乳糖苷酶 (β gal)重组腺病毒 (1× 10 9pfu)和tTGF βRII重组腺病毒 (1× 10 9pfu)分别注入新生 10天的Sprague Dawley (SD)大鼠背部皮肤的左右侧 ,并在注射部位作线型切口 ,通过组织学检测和免疫组化观察tTGF βRII表达对抑制伤口瘢痕的作用和减少伤口炎症反应及TGF β1合成的作用。在tTGF βRII转基因小鼠和对照小鼠作同样线性切口来进一步证实tTGF βRII对抑制瘢痕的作用。结果　tTGF βRII在细胞内的过度表达显著抑制TGF β1的基因表达。腺病毒介导的皮肤基因转染在注射后 2～ 3天基因表达达高峰 ,5～ 7天逐渐下降。术后 2周 ,组织学检测发现tTGF βRII转基因小鼠伤口内相对瘢痕面积和对照小鼠伤口内相对瘢痕面积分别为 136 96 9 8± 6 6 339和 4 74 6 4 1 6±2 2 7396 ,转基因鼠瘢痕面积约为对照鼠的 2 9% (P <0 0 5 )。术后 2周 ,大鼠tTGF βRII基因治疗后伤口的相对瘢痕面积和对照伤口相对瘢痕面积