自体组织工程化皮肤修复全层皮肤缺损的实验研究

目的为制成含表皮细胞与成纤维细胞的双层皮肤替代物,直接用于修复全层皮肤缺损.方法选用长枫杂交仔猪10只,酶消化法获取皮肤表皮细胞与成纤维细胞,将原代培养处于对数生长期的表皮细胞、成纤维细胞分别与30%氧化异丙烯F-127 混匀成细胞悬液后,种植聚羟基乙酸(polyglycolic acid,PGA)形成细胞-生物材料复合物,用于修复自体动物背部直径4 cm全层皮肤缺损,以单纯生物材料(PGA+氧化异丙烯)充填的创面作为对照组.修复术后1,2,4,8周取材,通过组织学和基底膜特殊染色等方法对新生组织进行评价.结果第1周新生组织即出现表皮与真皮2层结构,特殊染色观察到连续的基底膜.第2周表皮与真皮均较前增厚.修复后第8周组织工程化皮肤的形态结构均与正常皮肤相似.对照组则无皮肤形成,仅见大量肉芽组织.结论应用组织工程技术,以PGA+氧化异丙烯为表皮细胞、成纤维细胞载体构建的组织工程化皮肤可修复全层皮肤缺损.     

自体组织工程化全层皮肤缺损修复实验研究

目的 为制成含表皮细胞与成纤维细胞的双层皮肤替代物，直接用于修复全层皮肤缺损。方法 选用长枫杂交仔猪10只，酶消化法获取皮肤表皮细胞与成纤维细胞，将原代培养处于对数生长期的表皮细胞、成纤维细胞分别与30％氧化异丙烯F－127混匀成细胞悬液后，种植聚羟基乙酸（polyglycolic acid,PGA)形成细胞－生物材料复合物，用于修复自体动物背部直径4cm全层皮肤缺损，以单纯生物材料（PGA＋氧化异丙烯）充填的创面作为对照组。修复术后1，2，4，8周取材，通过组织学和基底膜特殊染色等方法对新生组织进行评价。结果 第1周新生组织即出现表皮与真皮2层结构，特殊染色观察到连续的基底膜。第2周表皮与真皮均较前增厚。修复后第8周组织工程化皮肤的形态结构均与正常皮肤相似。对照组则无皮肤形成，仅见大量肉芽组织。结论 应用组织工程技术，以PGA 氧化层丙烯为表皮细胞、成纤维细胞载体构建的组织工程化皮肤可修复全层皮肤缺损。     

角质细胞与成纤维细胞混合移植修复裸鼠全层皮肤缺损的初步报告

目的：利用组织工程原理探讨修复全层皮肤缺损的理想方式。方法：以裸鼠为动物模型,在皮肤全层缺损区域分别移植纤维蛋白胶(n=10),纤维蛋白胶角质细胞悬液（n=10）,纤维蛋白胶成纤维细胞悬液（n=10）以及纤维蛋白胶角质细胞成纤维细胞悬液（n=10）,术后每天对伤口进行大体观察,第5,7,10,14,21,35d,分别取材活检行组织学及免疫组织化学检查。结果：移植有角质细胞组（2和4组）的创面愈合快,术后10d组织学提示创面完全上皮化,抗人特异性HLA－1型抗原、抗involucrin染色和抗Ⅶ型胶原染色阳性证明新生上皮由移植的人角质细胞形成,抗involucrin染色阳性又证明角质细胞分化成熟有角质层形成,抗Laminin染色、抗Ⅶ型胶原染色阳性提示早期基底膜形成。组织学检查提示第4组新生上皮有许多类似皮钉样结构。结论：培养的角质细胞,成纤维细胞结合纤维蛋白胶移植到创面上后,可以形成复层分化良好、接近正常结构和功能的新生成肤组织。     

组织工程技术修复全层皮肤缺损的研究

目的　探讨用异体脱细胞真皮基质 (ADM )复合自体表皮角朊细胞 (AKCs)移植修复全层皮肤缺损的可行性。方法　用DispaseII/TritonX 10 0制备ADM。在猪背部两侧分别作 5cm× 5cm的全层皮肤缺损 ,用ADM覆盖创面。 7～ 10d后 ,将AKCs与Pluronic混匀涂布于一侧ADM表面 ,另一侧单纯ADM组作为对照组。术后观察愈合情况 ,比较创面收缩率 ,取材作组织学及电镜观察。结果　ADM去除了所有细胞成分 ,胶原束结构及排列均保持正常 ;ADM在创面成活 ,能诱导成纤维细胞长入和新生血管形成 ,并支持移植于其表面的AKCs生长。 4周时 ,对照组收缩至原面积的 41% ,实验组为原面积的 65 %。结论　ADM可以作为重建真皮层的诱导支架 ;ADM与AKCs复合移植可以形成新生皮肤并修复全层皮肤缺损。     

含表皮细胞和成纤维细胞的复合皮构建及移植实验

目的 探讨成纤维细胞在构建复合皮中的作用，并观察复合皮对全层皮肤缺损创面的修复效果。方法 将表皮细胞与成纤维细胞种植于无细胞真皮替代物表面，于体外培养构建复合皮，观察种植成纤维细胞对表皮细胞与无细胞真皮替代物间粘附性的影响。然后将复合皮移植于裸鼠（16只）全层皮肤缺损创面，观察存活率及新生皮肤组织结构。结果 表皮细胞种植于无细胞真皮表面可形成复合皮，当种植少量成纤维细胞修饰无细胞真皮表皮面后，表皮细胞与真皮基质粘附紧密，在移植等操作过程中，表皮细胞膜片不易脱落。复合皮移植可封闭全层皮肤缺损创面，完全存活者最高达10只（62.5%)，新生皮肤基底膜结构完整，可见层粘连蛋白、Ⅳ型胶原形成。结论 以无细胞真皮替代物为载体的复合皮可修复全层皮肤缺损创面，种植成纤维细胞可增强表皮细胞的粘附性，有利于移植存活率的提高。     

利用毛囊干细胞和成纤维细胞重建全层皮肤的研究

目的建立利用毛囊干细胞和成纤维细胞进行全层皮肤重建的实验方法.方法取美容手术切取的头皮组织,K19免疫荧光染色定位毛囊干细胞,消化、分离、体外培养,以胶原-成纤维细胞聚合物为基质,采用气-液界面对第2代毛囊干细胞立体培养14 d,建立全层皮肤培养模型,并行组织学及K1免疫荧光染色观察.结果K19免疫荧光染色定位毛囊干细胞存在于毛囊外根鞘处,与成纤维细胞联合体外气-液界面立体培养14 d,获得的皮肤类似物,可见真皮基底膜形成,表皮多层上皮有序、多角形排列,上层细胞出现角化,真皮部成纤维细胞均匀分布于胶原基质中,角质细胞形成分化特异标志物K1染色阳性.结论毛囊外根鞘处的毛囊干细胞具有高增殖能力并向表皮细胞分化,可成功利用毛囊干细胞和成纤维细胞进行皮肤重建,为临床应用奠定基础.     

利用胎儿表皮干细胞构建组织工程皮肤修复裸鼠全层皮肤缺损创面

DMEM培养基、角质形成细胞无血清培养基、重组人表皮生长因子、霍乱毒素、dispase酶（美国Gibco公司），小鼠Ⅳ型胶原、L-谷氨酰胺、纤维蛋白、牛胰岛索（美国Sigma公司）．角蛋白14单克隆抗体、角蛋白19、整合素B，（美国ADI公司），重组人成纤维细胞生长因子2（FGF2，珠海亿胜生物制药有限公司）．凝血酶（奥地利Immuno AG公司），聚乙醇酸（PGA，日本Synthecon公司，[第一段]     

毛囊干细胞表皮膜片修复裸鼠皮肤缺损的实验研究

目的开发新的组织工程表皮替代物,利用毛囊干细胞-壳聚糖明胶膜片(Chitosan-gelatin membrane,CGM)进行修复裸鼠皮肤缺损的实验研究。方法将体外扩增培养的毛囊干细胞接种于CGM,构建组织工程表皮膜片,裸鼠背部作直径1cm的全层皮肤缺损,将毛囊干细胞-CGM复合物覆盖创面。回植后1周、4周和12周分别进行组织学和免疫组织化学检测。结果毛囊干细胞在CGM上生长良好。毛囊干细胞-CGM修复裸鼠后1周切片示创面有新生上皮覆盖,表皮分化良好,而对照组残留较大未愈创面。修复后4周和12周可见对照组收缩较实验组显著。结论体外构建的毛囊干细胞-CGM可以修复裸鼠皮肤缺损。     

组织工程皮肤修复全层皮肤缺损的实验研究

目的 探索由人表皮干细胞、成纤维细胞与纤维蛋白支架构建的组织工程皮肤修复全层皮肤缺损的可行性. 方法 将人全层皮肤采用胰蛋白酶消化法使表皮干细胞和真皮成纤维细胞分离后,分别在无血清培养基中行原代及传代培养.将体外扩增培养至第3、4代的表皮干细胞(5×104/mL)和真皮成纤维细胞(1×104/mL)共0.5 mL与纤维蛋白支架(0.5 mL)混合凝固构建组织工程皮肤.取4～5周龄雄性裸鼠45只,体重19.5～20.3 g,平均20.0 g,制备背部全层皮肤缺损模型.随机分为5组,每组9只,分别为空白对照组(C组),创面仅覆盖凡士林油纱,自然愈合;单纯支架组(F组),创面移植无细胞的纤维蛋白支架;表皮支架组(S组),创面移植含有表皮干细胞的纤维蛋白支架复合物;成纤维细胞支架组(Fb组),创面移植含有成纤维细胞的纤维蛋白支架复合物;组织工程皮肤组(T组),创面移植组织工程皮肤.术前及术后1、3、6、8周行全身及移植部位大体观察;移植后3、6、8周,取材行组织学、免疫组织化学及扫描电镜观察. 结果 细胞培养4周后,表皮干细胞培养皿内可见圆形细胞,在加有BrdU的培养液中培养6 d后可见BrdU染色阳性细胞;成纤维细胞培养皿内可见梭形细胞.构建的组织工程皮肤可见CK19免疫荧光染色阳性细胞、Nestin染色阳性细胞.移植后T组新生皮肤较其余各组生长快、瘢痕轻.术后6周,C、F、S、Fb及T组皮肤厚度分别为(0.460 ±0.049)、(0.480 ±0.055)、(0.540 ±0.043)、(0.510 ±0.032)及(0.60 ±0.047)mm,T组明显厚于其余各组,且差异有统计学意义(P＜0.05).术后3、6、8周,HE染色及扫描电镜示,T组新生表皮层数及真皮成纤维细胞、血管数量均多于其余各组,且T组真皮血管及胶原纤维排列均较其余各组整齐;术后3周,Ⅳ型胶原免疫组织化学染色显示,T组已形成连续的染色带,而其余各组均不连续;术后6周,CK14免疫组织化学染色显示,T组可见阳性细胞,其余各组均未见. 结论 用表皮干细胞、成纤维细胞及纤维蛋白支架构建的组织工程皮肤移植后能使创面迅速愈合,可望成为一种较理想的组织工程皮肤.     

表皮细胞生长因子和碱性成纤维细胞生长因子在不同发育阶段大鼠皮肤表达特征的比较性研究

目的 研究表皮细胞生长因子（EGF）和碱性成纤维细胞生长因子（bFGF)在胚胎、新生及成年三个不同发育阶段大鼠皮肤的表达特征及其可能的生物学意义。方法 取胚胎、新生和成年大鼠皮肤,经4%多聚甲醛固定、包埋与切片后,用SP免疫组织化学法研究EGF和bFGF的定位与表达特征。结果 EGF的阳性表达可见于胚胎、新生及成年三个发育阶段大鼠皮肤,主要位于表皮棘细胞,真皮成纤维细胞、毛囊上皮细胞和血管内皮细胞胞浆,bFGF在新生和成年大鼠表皮及真皮呈强阳性表达,但在胎鼠皮肤则为弱阳性乃至阴性,结论 EGF在不同发育阶段大鼠皮肤呈强阳性表达,表明其对上皮的发生、表型维持以及损伤后的修复十分重要。而大鼠胚胎皮肤bFGF低表达或缺乏的结果表明它可能是动物胚胎创伤后无瘢痕愈合的原因之一。     

单位毛囊移植在毛发缺损修复中的应用

目的:探讨使用单位毛囊移植修复毛发缺损的方法及效果.方法:取枕部的优势供区毛发按需要将其分割为含有1～4根毛发的毛囊单位,存于4℃的冰盐水中待用;受区使用局部肿胀麻醉加神经阻滞麻醉,然后用18～21号gauge注射器针头按不同受区毛发分布的角度及方向进行刺孔,在显微镊子配合下以插秧的方法将备好的毛囊单位植入受区,弹力绷带加压包扎固定.结果:2005 ～2010年,笔者使用单位毛囊移植修复各种毛发缺损患者11例,术后随访6个月～1年,毛发成活良好,修复后的毛发外观自然,供区瘢痕不明显.结论:单位毛囊移植在毛发缺损修复后毛发的外观接近自然毛发分布特征,供区瘢痕不明显,是修复毛发缺损的一种好方法.     

小鼠皮肤表皮和真皮细胞共移植诱导毛囊再生实验研究

目的探讨绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)标记的C57小鼠皮肤表皮和真皮细胞共移植诱导裸鼠毛囊重建的实验研究。方法取C57-GFP新生及成年小鼠分离表皮与真皮,分别制备成年小鼠原代真皮-表皮混合细胞(按1∶1比例混合)、成年小鼠原代真皮细胞、新生小鼠第3代真皮细胞,荧光显微镜观察细胞激发绿色荧光情况,免疫细胞化学检测培养的新生小鼠第3代真皮细胞毛囊干细胞标志。取Balb/c裸鼠,分别将成年小鼠原代真皮-表皮混合细胞(A组)、成年小鼠原代真皮细胞(B组)、新生小鼠第3代真皮细胞(C组)及生理盐水(D组)移植至裸鼠皮下,术后4、5、6周行大体观察,6周时取移植部位皮肤行GFP免疫组织化学染色观察各组毛囊形成情况。结果荧光显微镜观察示,分离、培养的C57-GFP新生及成年小鼠表皮及真皮细胞均能激发绿色荧光;免疫细胞化学检测培养的第3代真皮细胞中毛囊干细胞标志,显示波形蛋白、α-平滑肌肌动蛋白强阳性,表明细胞多为真皮鞘细胞;部分细胞表达毛乳头细胞标志CD133、多能聚糖及毛囊隆突部标志角蛋白15。裸鼠皮下移植实验:大体观察示A组可见接种部位皮下呈灰黑色,但未见毛发穿出皮肤表面;B、C、D组裸鼠皮肤均无着色。免疫组织化学染色示,A组形成新的、完整的毛囊结构或参与形成毛囊;B组GFP阳性细胞多表达于毛囊真皮鞘、外根鞘;C组GFP阳性细胞主要分布于毛囊真皮鞘、外根鞘、毛乳头,在汗腺中也有表达;D组GFP染色呈阴性。结论小鼠皮肤的表皮和真皮细胞在裸鼠体内相互作用可形成完整的毛囊结构,而仅移植新鲜分离或培养的真皮细胞则主要参与毛囊形成,无法形成完整的毛囊结构。     

成纤维细胞与皮肤替代物的研究与应用

现代观点认为，皮肤创面修复是一复杂而有序的病理过程，是细胞之间、细胞与细胞外基质(ECM)及细胞因子间相互影响和协同作用的结果，涉及炎症反应，细胞迁移、增殖和分化，血管、神经形成及ECM的合成和重塑。成纤维细胞是参与修复过程的主要细胞，在一定程度上决定创面修复的时     

自体表皮细胞悬液在修复皮肤组织缺损创面中的作用研究

目的:探讨自体表皮细胞悬液在修复皮肤组织缺损创面的作用。方法:在20只大鼠身上分别取邮票大小自体全厚皮片进行消化,分离成单个表皮细胞的悬液;经传代培养后,使用自体表皮细胞悬液分别对20只大鼠背部表皮皮肤缺损创面进行覆盖移植,术后观察移植物成活率和植皮区收缩率,同时取移植物进行组织学观察;并与对照组20只自体愈合创面进行相互比较。结果:表皮细胞悬液移植后1周渐融合成片,伤口愈合;经6周后,伤口平整,轻度瘢痕愈合。而对照组在6周时伤口不平整,呈瘢痕愈合,色素沉着明显。结论:在表皮缺损创面上应用体外培养的自体表皮细胞悬液移植修复可达到重构皮肤的目的。     

自体静脉移植修复周围神经缺损实验研究

40只家兔静脉移植修复1．0、1．5和2．0cm神经缺损、1／2－9个月HE、弹力纤维，髓鞘和神经元染色及电镜观察，再生神经纤维在静脉内生长良好，并长入远端神经。15只兔双侧股直肌支分别用静脉移植和神经原位移植，分为1．0cm缺损2月、4月、1．5cm4月观察组，经肌电图，神经传导速度、肌力和胆碱酯酶染色比对，除2月组肌力神经移植优于静脉移植外，其余均无显著差异。     

胎鼠表皮干细胞的分离培养及毛囊再生研究

目的：分离培养胎鼠的表皮干细胞及毛囊乳头层细胞，通过动物模型观察两者复合移植后，上皮形成及毛囊的再生情况。方法：采用IV型胶原分离培养胎鼠表皮干细胞，检测β1整合素及角蛋白15的表达水平，测定其细胞周期及克隆形成率（以角质细胞为对照）；分离培养毛囊乳头层细胞，并接种在纤维蛋白胶中，与表皮干细胞膜片复合形成全层皮肤等同物，移植在裸鼠全层皮肤缺损创面作为实验组，同时将胎鼠成纤维细胞替代乳头层细胞作为对照组，8－10周后观察创面及囊的组织学变化。结果：胎鼠表皮干细胞表达高水平的β1整合素及角蛋白15；细胞周期分析显示，G1期细胞百分率为94．9％，S期为3．5％，提示为慢循环细胞周期；角质细胞的G1期细胞有百分率为74．1％，S期为17．5％；表皮干细胞的克隆形成率为15．3％，明显高于对照组的6．7％；裸鼠创面愈合后8－10周，实验组可见新生毛囊形成，对照组未见到此现象。结论：能初步实现对胎鼠表皮干细胞的体外分离培养；在毛囊乳头层细胞的诱导下，胎鼠表皮干细胞可参与形成新的毛囊结构。     

肩胛骨皮瓣移植修复第一跖骨伴皮肤缺损

目的：探讨足跖骨伴皮肤缺损的良好修复方法,恢复足部功能。方法：应用吻合血管的肩胛骨皮瓣移植,一期修复创伤后跖骨伴皮肤缺损6例。结果：6例骨皮瓣完全成活,术后2－4个月X线显示骨端骨痂生长,足部行走自如,肩部功能无影响。结论：肩胛骨皮瓣的血管走行恒定、口径,铁切取和吻合,移植后骨皮瓣血供良好,成活率高,抗感染力强,为修复跖骨伴皮肤缺损的良好方法。     

大鼠毛囊细胞构建组织工程全层皮肤

目的:以大鼠毛囊细胞为种子细胞培养组织工程皮肤。方法:分离培养新生SD大鼠毛囊外根鞘细胞和真皮鞘细胞,以这两种细胞为种子细胞构建全层组织工程全层皮肤。结果:成功构建了具有表皮层和真皮层的组织工程皮肤。结论:毛囊细胞可以用作种子细胞来构建组织工程全层皮肤。     

老化皮肤成纤维细胞的研究进展

成纤维细胞是皮肤真皮中最主要的细胞成分,在合成分泌纤维和细胞外基质中扮演着重要的角色,在组织创伤修复中发挥着重要的作用。随着年龄的增长,皮肤老化突显,可以表现为皮肤干燥粗糙,皱纹增多、加深,皮肤松弛,弹性下降等。这些临床表现都与成纤维细胞数量减少、合成功能下降或异常有关。因此,在皮肤老化的研究中,人们越来越关注成纤维细胞的结构和功能的改变及其对皮肤老化产生的影响。本文就其研究进展综述如下。