融合蛋白hCGβ-hC3d3增强人免疫活性细胞对hCGβ抗原的免疫原性

目的:探讨分子佐剂hC3d3与hCGβ的融合蛋白hCGβ-hC3d3作用于人外周血单个核细胞(PBMC)对hCGβ抗原的免疫原性的影响.方法:对人PBMC进行细胞分离纯化,分别用1、10、100 nmol/L的hCGβ、hCGβ-hC3d3及PWM等抗原体外作用于B细胞、B T细胞、PBMC和Raji细胞8～12天,用3H-TdR掺入法了解不同抗原刺激后各组细胞增殖情况;用ELISA检测培养上清中总免疫球蛋白(Ig)水平;而ELISPOT可测定各种抗原刺激后Ig分泌细胞数量.结果:用不同浓度hCGβ、hCGβ-hC3d3及PWM作用于B细胞、B T细胞、PBMC、Raji细胞8～12天后,3H-TdR掺入法分析显示:与hCGβ处理组相比,融合蛋白hCGβ-hC3d3能使各组细胞增殖明显升高,且呈浓度依赖性;100 nmol/L hCGβ-hC3d3与前3组细胞共培养上清中总Ig的含量分别为hCGβ刺激组的4倍、10倍和10.85倍,且呈浓度依赖性.ELISPOT结果与培养上清液检测结果类似,经与hCGβ-hC3d3共培养后Ig生成细胞较hCGβ组明显增加.结论:融合蛋白hCGβ-hC3d3明显增强人免疫活性细胞抗hCGβ的免疫原性.     

分子佐剂C3d3增强hCGβ3蛋白疫苗的体液免疫效应

目的：通过分子佐剂C3d3增强hCGβ避孕疫苗的免疫原性。方法：采用分子生物学技术以phCMV1为载体分别构建分泌型、带有6个组氨酸纯化标签的真核表达载体phCMV1-6His-hCGβ-C3d3和phCMV1-6His-hCGβ，在CHO细胞中获得重组蛋白的稳定、高效表达并用镍柱和凝胶过滤层析对其进行分离、纯化。分别用hCGβ-C3d3融合蛋白、hCGβ联合C3d3和单用hCGβ对BALB／c与C57BL／6小鼠进行免疫，共免疫两次，间隔4周，ELISA测定血清中的抗体滴度，比较各组的免疫效果。结果：无论是BALB／c小鼠还是C57BL／6小鼠，hCGβ-C3d3融合蛋白诱导产生的抗hCGβ抗体的出现时间都明显早于hCGβ与C3d3联合免疫和hCGβ单独免疫组。在BALB／c小鼠，初次和再次免疫结果显示，C3d3使hCGβ的免疫原性增强了1995倍。C57BL／6小鼠所显示出的体液免疫反应强度虽不如BALB／c小鼠，但C3d3也使hCGβ的免疫原性增强了1259倍。结论：通过分子佐剂C3d3可以大幅地提高hCGβ避孕疫苗的免疫原性，在个性差异很大的不同品系小鼠，C3d3均能增强机体对hCGβ的体液免疫应答能力。     

hCGβ和hCGβ-C3d3融合蛋白在CHO细胞中的分泌性表达、鉴定与纯化

目的：构建带有6个组氨酸纯化标签的hCGβ和hCGβ-C3d3融合蛋白的分泌型真核表达质粒，在CHO细胞中获得具有生物学活性的重组蛋白的高效表达。方法：利用高效真核表达载体phCMV1，构建phCMV1-6His-hCGβ和phCMV1-6His-hCGβ-C3d3，脂质体法转染CHO细胞，G418(800μg/ml)筛选抗性克隆。放射免疫法检测抗性克隆培液中hCGβ表达量，Western blotting和Raji细胞免疫化学法鉴定hCGβ-C3d3融合蛋白。用镍柱和凝胶过滤层析纯化表达产物。结果：酶切及测序结果显示，phCMV1-6His-hCGβ及phCMV1-6His-hCGβ-C3d3构建正确。在CHO细胞中成功地获得了hCGβ和hCGβ-C3d3融合蛋白的高效表达，phCMV1载体的表达效率是pcDNA3的1．6倍。表达产物经纯化后得到了所需的hCGβ和hCGβ-C3d3融合蛋白。结论：hCGβ和hCGβ-C3d3融合蛋白在CHO细胞的高效表达为下一步比较hCGβ抗原及hCGβ-C3d3融合蛋白免疫动物的体液免疫效应和抗生育效果奠定了基础。     

分子佐剂C3d增强hCGβ基因免疫体液免疫效应

目的：该实验室前期工作已成功构建真核表达质粒pcDNA3-hCGβ、pcDNA3-hCGβ-C3d3且证明其能在真核表达系统中有效表达。通过动物DNA免疫，以期证实分子佐剂C3d增强免疫避孕疫苗免疫原性。方法：抽提与纯化pcDNA3、pcDNA3-hCGβ、pcDNA3-hCGβ-C3d3质粒，进行动物DNA免疫。免疫剂量分别为5、10、20pmol，共免疫2次，每次间隔3周。末次免疫后6周采血，用间接ELISA分析实验动物外周血抗hCGβ抗体效价。结果：C3d分子佐剂能明显提高抗hCGβ抗体滴度；且其作用呈剂量依赖性。结论：分子佐剂确实能增强hCGβ免疫原性；此结果将有助于免疫避孕疫苗的技术进步及实际应用。     

hCGβ-C3d3基因免疫BALB/c小鼠选择性促进B细胞克隆扩增

评价分子佐剂C3d在基因免疫中选择性促进抗原特异性B细胞增殖作用。分别用质粒pCMV4-hCG-βC3d3和pCMV4-hCGβ免疫BALB/c小鼠,免疫剂量为50 pmol。间隔3周相同剂量加强免疫1次。加强免疫后第1周及第2周,MTT法分析各组小鼠脾脏B细胞和T细胞增殖;ELISPOT法分析两免疫组小鼠脾脏hCGβ抗原特异性IgG分泌细胞。结果显示在加强免疫后第1周及第2周,hCG-βC3d3免疫组B细胞增殖能力显著高于hCGβ免疫组及正常对照组;而各组间T细胞增殖状况未见明显差异。hCG-βC3d3免疫组较hCGβ免疫组小鼠脾细胞分泌IgG的量和分泌hCGβ抗体的细胞数量均明显增加。结果表明分子佐剂C3d对于B细胞具有选择性克隆扩增作用。     

乙型肝炎e抗原、s抗原对Toll样受体及共刺激分子表达的调控和影响

目的：探讨乙型肝炎e抗原、s抗原（HBeAg、HBsAg）对健康人外周血单个核细胞（PBMC）Toll样受体（TLRs）和共刺激分子表达的影响。方法：分别用HBeAg、HBsAg、空质粒以及卵清蛋白（OVA）作为无关蛋白刺激健康人外周血单个核细胞（PBMC）,采用流式细胞技术检测各刺激组CD14＋细胞TLR2、TLR4、CD86、PD-L1的表达水平。结果：健康人PBMC经HBeAg或HBsAg刺激后,CD14＋细胞表面TLR2、TLR4的表达明显低于未刺激组（P〈0.05）,CD14＋细胞PD-L1的表达则明显增高（P〈0.05）;HBeAg刺激后同时可见CD14＋细胞表面共刺激分子CD86的表达水平明显降低（P〈0.02）。结论 HBeAg和HBsAg通过上调单核细胞表面PD-L1的表达,下调CD14＋单个核细胞表面TLR2、TLR4和共刺激分子CD86的表达,削弱机体固有免疫系统的应答能力,降低启动特异性免疫的活化信号,从而导致免疫清除逃避。因此,HBeAg和HBsAg可能是促进HBV感染慢性化的重要因素。     

hCGβ-03d3基因免疫BALB／c小鼠选择性促进B细胞克隆扩增

评价分子佐剂C3d在基因免疫中选择性促进抗原特异性B细胞增殖作用。分别用质粒pCMV4-hcGβ-C3d3和pCMV4-hOGβ免疫BALB／c小鼠，免疫剂量为50pmol。间隔3周相同剂量加强免疫1次。加强免疫后第1周及第2周，MTT法分析各组小鼠脾脏B细胞和T细胞增殖；ELISPOT法分析两免疫组小鼠脾脏hcGβ抗原特异性IgG分泌细胞。结果显示在加强免疫后第1周及第2周，hCGβ-C3d3免疫组B细胞增殖能力显著高于hCGβ免疫组及正常对照组；而各组间T细胞增殖状况未见明显差异。hcGβ-C3d3免疫组较hCGβ免疫组小鼠脾细胞分泌IgG的量和分泌hCGβ抗体的细胞数量均明显增加。结果表明分子佐剂C3d对于B细胞具有选择性克隆扩增作用。     

补肾宁心方对鼠成骨细胞协同刺激分子表达的升调节作用

目的：探讨补肾宁心方药物血清对成骨细胞（OB）及CD4^＋T细胞协同刺激分子表达的调控作用。方法：颅骨酶解法培养OB，体外模拟雌激素撤退；MACS法分离CD4^＋T；将OB或CD4^＋T分别予以20％对照鼠血清、E2及20％中药血清培养并以LPS刺激，流式细胞术分析OB表面CD80、CD86以及CD4^＋T细胞表面CD28、CTLA-4的表达。结果：E2及中药血清组OB表面CD80、CD86的表达显著增加（P〈0．01）；CsA可降低对照鼠血清组及中药血清组OB表面CD80、CD86的表达（P〈0．01）；各组CD4^＋T细胞CD28和CTLA4的表达无显著改变（P〉0．05）。结论：补肾宁心方可上调OB协同刺激分子CD80、CD86表达；该作用可被CsA阻滞；而对T细胞CD28／CTLA-4表达无显著影响，其免疫学意义有待进一步研究：     

钙动员诱导人外周血单核细胞分化为树突状细胞的信号转导

目的初步探讨钙离子载体（CI）在体外迅速诱导人外周血单核细胞（PBMC）分化为树突状细胞（DC）的信号转导途径。方法分离健康献血者的PBMC,在体外用人重组粒／巨噬细胞集落刺激因子（rhGM-CSF）和CI培养40h或rhGM-CSF和TNF-α培养5d,部分PBMC用环胞菌素A（CsA）预处理30min后,再加入CI或TNF-α;相差显微镜下观察细胞的形态;流式细胞仪检测细胞表面CD14、CD80、CD86、CD83、HLS-DR等分子的表达;MTT比色法检测其对同种异体T淋巴细胞的刺激增殖作用;凝胶电泳迁移率变动分析（EMSA）检测不同方法培养的细胞其核转录因子-κB（NF-κB）的活化水平。结果健康献血者的PBMC经rhGM-CSF与CI培养40h或rhGM-CSF与TNF-α培养5d,均可获得DC的典型形态和表面分子的表达,包括CD14表达下调,CD80、CD86及HLA-DR等分子表达的上调,以及较强刺激同种异体T淋巴细胞增殖的作用;其中CI诱导的DC其CD80、CD86、CD83、HLA-DR等分子的上调更明显,刺激T淋巴细胞的增殖能力更强。经TNF-α及CI所诱导分化的DC均具有较好的NF-κB活性。但经CI诱导的DC,其形态、表面标志物、对T淋巴细胞的刺激增殖能力及NF-κB的活性,均受到CsA的抑制;而TNF-α所诱导的DC却不受CsA的影响。结论CI比TNF-α更迅速、更高效地诱导PBMC向DC分化的原因,是信号转导途径的不同,但不论上游信号转导途径有何不同,两者最终都通过激活NF-κB诱导细胞的分化。     

肿瘤抗原活化T细胞体外模型的建立及其免疫效应研究

目的建立体外肿瘤抗原活化T细胞模型，研究活化后T细胞的功能特点与分化方向。方法将肝癌BEL-7402细胞与健康人外周血单个核细胞（PBMC）和协同刺激分子抗CD3、CD28单抗共培养（初次刺激组），或与经肝癌细胞刺激的PBMC共培养（再次刺激组），共培养时间分别为24、48、72h。另设靶细胞对照组和PBMC对照组。各组实验均设6孔。以流式细胞仪分析PBMC经肝癌细胞刺激后CD45RO＋T细胞比例变化；MTT法检测活化T细胞对肝癌细胞的杀伤率；双抗体夹心ELISA法检测活化T细胞IFN-γ，和IL-4分泌水平；流式细胞仪分析T细胞表面Fas配体表达和T细胞受体（TCR）Vβ亚家族表达水平，并比较初次刺激组与再次刺激组T细胞免疫效应的差异。结果健康人PBMC在肿瘤抗原和协同刺激分子作用下，CD45RO＋T细胞比例逐渐上升，共培养72h时为（16．1±0．9）％，明显高于PBMC对照组[（2．4±0．3）％，P〈0．05]。活化T细胞对肝癌细胞的杀伤率随共培养时间的延长而增大[24h为（28．4±6．7）％、48h为（60．4±6．2）％、72h为（78．0±9．3）％]；IFN-γ，分泌水平升高，共培养48h时为（932±117）ng／L，明显高于PBMC对照组[（157±30）ng／L，P〈0．05]：T细胞表面FasL表达增加至（8．1±1．8）％，明显高于PBMC对照组[（0．5±0．2）％，P〈0．01]；肿瘤抗原刺激后，TCRVβ的表达水平与PBMC对照组相比有所增加。再次刺激组CD45RO＋T细胞比例、对肝癌细胞的杀伤率、IFN-γ分泌水平及FasL表达水平均明显高于初次刺激组。结论成功建立了体外肿瘤抗原活化T细胞模型。活化T细胞具有明显的免疫效应，并向Th1和Tc1方向分化；再次接触相同抗原时，其免疫效应更为迅速、强烈，表现出一定的记忆特性。     

C3d3-hCGβ融合蛋白免疫BALB/c小鼠增强抗hCG-β TH2型体液免疫效应

目的 通过分子佐剂C3d3增强hCGβ避孕疫苗的免疫原性并实现免疫效应向TH2型体液免疫偏倚。方法 在CHO细胞中表达、纯化hCGβ、C3d3和hCGβ-C3d3融合蛋白。分别用hCGβ-C3d3融合蛋白、单用hCGβ、hCGβ联合C3d3和hCGβ加用弗氏完全佐剂免疫BALB／c小鼠，共免疫2次，间隔4周。ELISA测定血清中抗hCGβ抗体滴度。末次免疫后3周处死小鼠制备单个脾细胞悬液，体外用hCG刺激培养48h，ELISA检测上清中TH1型(IFN-γ、IL-2)和TH2型(IL-Ⅱ，4、IL-10)细胞因子分泌水平。结果 C3d3使hCGβ的免疫原性增强了1995倍，C3d3的佐剂能力是弗氏完全佐剂的10倍(初次免疫)-32倍(再次免疫)。借助C3d3分子佐剂，hCGβ-C3d3融合蛋白可产生很明显的TH2型体液免疫优势效应。结论 分子佐剂C3d3可以大幅增强hCGβ避孕疫苗的免疫原性，使免疫效应向TH2型体液免疫偏倚。     

协同刺激分子CD28在结核杆菌抗原体外激活人外周血γδT细胞中的作用

目的 :为了探讨CD2 8协同刺激分子在结核杆菌 (Mtb)低分子多肽抗原体外激活人外周血γδ T细胞中的作用。方法 :采用激发型抗CD2 8单抗模拟第二信号 ,Mtb低分子多肽抗原作为刺激原 ,对纯化的人外周血T细胞进行体外刺激和培养 ;用流式细胞仪检测γδ T细胞上CD2 8分子的表达、γδ T细胞的增殖效应及活化的γδ T细胞上CD6 9分子的表达。结果 :人外周血γδ T细胞中有 5 0 %左右表达CD2 8分子 ;抗CD2 8单抗协同Mtb抗原可刺激γδ T细胞的活化和增殖 ;但抗CD2 8单抗或Mtb抗原单独刺激则无作用。活化的γδ T细胞表面表达CD6 9分子。结论 :Mtb抗原在选择性活化人外周血γδ T细胞时需要第二信号的参与 ;CD2 8在Mtb抗原激活γδ T细胞时可提供协同刺激信号 ;CD6 9可作为γδ T细胞的早期活化标志。     

hCGβ-C3d融合蛋白在CHO细胞中的表达

为了提高hCGβ的免疫原性 ,构建含新型分子佐剂C3d的hCGβ真核细胞表达质粒pcDNA3 hCGβ C3d3,使其转染稳定表达系统中国仓鼠卵细胞 (CHO )后 ,检测融合蛋白分泌情况。CHO细胞转染了pcDNA3 hCGβ C3d3质粒后 ,经 4 8h培养 ,1 0× 10 6个CHO细胞可分泌 6 6 0ng的重组融合hCGβ C3d3蛋白。细胞免疫化学技术分析显示 ,表达产物既有hCGβ的组分也有C3d的成分。经SDS PAGE及免疫印迹试验发现CHO细胞培养上清液中含有三组蛋白成分 ,其相对分子质量分别为12 0 0 0 0、90 0 0 0和 6 5 0 0 0。利用新型分子佐剂C3d与hCGβ的连接 ,构建了pcDNA3 hCGβ C3d3真核细胞表达质粒 ,为提高hCGβDNA免疫避孕疫苗的免疫原性及抗生育作用奠定了基础     

TCRVβ8.4 基因转染人PBMC对肝癌细胞杀伤活性的研究

目的：探讨转染hTCRVβ8.4基因后健康人PBMC的免疫学特性及其对起源于乙肝病毒的肝癌细胞株BEL-7402杀伤活性的改变。方法：将hTCRVβ8.4基因克隆至真核表达载体pcDNA3．1(-)上，并转染健康人PBMC，流式细胞术检测转染后PBMC中TCRVβ8.4蛋白表达，乳酸脱氢酶释放活性法检测重组质粒转染后PBMC对癌细胞BEL-7402的杀伤活性。结果：TCRVβ8.4在基因转染后淋巴细胞中表达显著增高；与BEL-7402共培养后，基因转染组CD3^ TCRVβ8.4T细胞增殖明显高于对照组；BEL-7402刺激后免疫细胞活化，表达CD122的细胞数量增多，表达CD19(B细胞活化的标志)的B细胞增加；重组质粒转染后，PBMC对肝癌细胞BEL-7402杀伤活性增强；透射电镜观察发现，重组质粒转染的PBMC使BEL-7402凋亡。结论：hTCRVβ8.4基因修饰可显著增强淋巴细胞在超抗原BEL-7402刺激下的增殖及免疫细胞活化，基因修饰后T淋巴细胞杀伤活性明显增强。     

钙离子载体在诱导人外周血单核细胞分化为树突状细胞中的作用

目的研究钙离子载体(CI)能否诱导人外周血单核细胞(PBMC)分化为树突状细胞(DC)，并初步探讨其信号转导途径。方法分离健康献血者的PBMC，在体外用CI(A23187)或人重组粒细胞／巨噬细胞集落刺激因子(rhGM—CSF)和CI培养40h，或rhGM-CSF和白细胞介素4(IL-4)培养7d，部分PBMC预先用W-7或CsA或K35926处理30min后，再加入上述细胞因子或CI。相差显微镜下观察细胞形态，流式细胞仪检测细胞表面CD14、CD80、CD86、CD83等分子的表达，MTT比色法检测其对同种异体混合T淋巴细胞的刺激增殖作用。结果健康献血者的PBMC经CI培养40h，或rhGM—CSF与CI培养40h，或rhGM-CSF与IL-4培养7d，均可获得DC的典型形态和表面分子的表达，包括CD14表达下调、共刺激分子(CD80、CD86)表达上调，以及较强刺激同种异体混合T淋巴细胞增殖的作用；CI诱导的DC其CD14分子的下调及CD83分子的上调更明显，刺激混合T淋巴细胞的增殖能力更强；rhGM-CSF可协同CI诱导PBMC向DC的分化。经rhGM—CSF及CI处理的PBMC，其形态、表面标志物及对T细胞的刺激增殖能力，均受到W-7或CsA或KT5926不同程度的抑制；而rhGM-CSF及IL-4所诱导的PBMC其形态、表面分子的表达以及刺激T细胞增殖的作用却不受上述抑制剂的影响。结论CI可快速诱导PBMC向DC分化，其分化过程可能受控于Ca^2 /钙调蛋白及其下游的多个细胞信号转导途径的调节。     

分子佐剂C3d3增强hCGβ蛋白疫苗的体液免疫效应

目的:通过分子佐剂C3d3增强hCGβ避孕疫苗的免疫原性。方法:采用分子生物学技术以phCMV1为载体分别构建分泌型、带有6个组氨酸纯化标签的真核表达载体phCMV16HishCGβC3d3和phCMV16HishCGβ,在CHO细胞中获得重组蛋白的稳定、高效表达并用镍柱和凝胶过滤层析对其进行分离、纯化。分别用hCGβC3d3融合蛋白、hCGβ联合C3d3和单用hCGβ对BALBc与C57BL6小鼠进行免疫,共免疫两次,间隔4周,ELISA测定血清中的抗体滴度,比较各组的免疫效果。结果:无论是BALBc小鼠还是C57BL6小鼠,hCGβC3d3融合蛋白诱导产生的抗hCGβ抗体的出现时间都明显早于hCGβ与C3d3联合免疫和hCGβ单独免疫组。在BALBc小鼠,初次和再次免疫结果显示,C3d3使hCGβ的免疫原性增强了1995倍。C57BL6小鼠所显示出的体液免疫反应强度虽不如BALBc小鼠,但C3d3也使hCGβ的免疫原性增强了1259倍。结论:通过分子佐剂C3d3可以大幅地提高hCGβ避孕疫苗的免疫原性,在个性差异很大的不同品系小鼠,C3d3均能增强机体对hCGβ的体液免疫应答能力。     

结核杆菌低分子多肽抗原再次刺激其活化的T细胞对诱导γδT细胞CD69分子再次表达的影响

目的 观察结核杆菌低分子多肽抗原（Mtb-Ag）再刺激Mtb-Ag活化的T细胞（Mtb-AT细胞）诱导γδT细胞CD69分子的再表达的情况.方法 分离获取健康人外周血单个核细胞（PBMC）,用Mtb-Ag刺激PBMC,采用直接免疫荧光染色法通过CD3PE/CD69FITC、γδPE/CD69FITC细胞双染检测γδT细胞0、6、12、24、48和72 h CD69分子的表达情况.PBMC经Mtb-Ag刺激活化扩增培养至10 d后再次加入Mtb-Ag,经培养0、6、12、24、48和72 h后收集细胞,再次检测CD69分子的表达情况.结果 培养0、6、12、24、48和72 h后,Mtb-Ag初次刺激γδT细胞后CD69分子的表达分别为0.91％、15.1％、35.2％、75.2％、59.4％和50％.再次刺激培养0、6、12、24、48和72 h后,γδT细胞CD69分子的表达分别为1.7％、72.3％、73.5％、50.3％、45.6％、41.7％.结论Mtb-Ag初次刺激γδT细胞表达CD69分子约在24 h达高峰,随后快速下降;Mtb-Ag再次刺激Mtb-AT细胞诱导γδT细胞CD69分子的再表达,6h时CD69分子达高峰,可维持到12 h.这为寻求γδT细胞迅速活化、CD69分子的迅速表达奠定了方法学基础.     

小鼠可溶性CD83对树突状细胞表达共刺激分子和共刺激活性的影响

目的：研究可溶性小鼠CD83（mCD83）对树突状细胞（DC）表达共刺激分子及共刺激活性的影响。方法：克隆mCD83基因，构建mCD83胞外功能区与人IgG1αFc段融合基因的真核表达载体pmCD83-hIg，并在COS-7细胞中表达可溶性mCD83-hIg融合蛋白。采用ELISA、Western blot和RT-PCR技术检测mCD83-hIg融合基因在COS-7细胞中的表达。用mCD83-hIg处理小鼠DC细胞系（DC2．4）采用流式细胞术检测DC细胞周期、细胞凋亡和共刺激分子CD80、CD86的表达影响；采用混合白细胞培养试验，检测mCD83-hIg对DC2．4刺激同种异基因T细胞增殖及产生IL-2和IFN-γ的影响。结果：酶切和序列测定鉴定显示构建的真核表达载体完全正确；mCD83-hIg对DC2．4细胞周期和细胞凋亡无影响，但可下调DC2．4表面共刺激分子CD80和CD86的表达；mCD83-hIg处理过的DC2．4刺激同种异基因T细胞增殖及产生IL-2和IFN-γ的能力显著下降。结论：mCD83-hIg可抑制DC表达共刺激分子并下调DC共刺激活性，从而抑制同种异基因T细胞增殖和产生细胞因子。     

hCGβ与鼠补体片段C3d的连接及其在真核细胞中的表达

目的:构建含新型分子佐剂C3d的hCGβ真核细胞表达质粒,以提高hCGβ的免疫原性。方法:用pcr方法在hCGβ cDNA3’端引入BamHI位点,然后利用酶切位点的互补性,与C3d3　cDNA连接,构建了pBS-hCGβ-C3d3质粒,最后插入真核细胞表达质粒pcDNA3的CMV启动子下游,以产生pcDNA3-hCGβ-C3d3。将此融合质粒转染瞬时表达系统 COS-7细胞表达相应产物。其无血清培养上清液用免疫亲和层析法纯化重组蛋白。Raji细胞免疫细胞化学技术鉴定表达产物准确性。结果:真核细胞瞬时表达系统 COS-7细胞经转染了pcDNA3-hCGβ-C3d3质粒后,可分泌hCGβ重组蛋白。1.0×105个 COS-7细胞转染了pcDNA3-hCGβ-C3d3质粒,经72h培养后,可产生152ng的hCGβ重组蛋白,且表达量随时间延长而增高。在有血清培养基中的分泌量明显高于无血清培养基。同时,用Raji细胞免疫细胞化学分析表达产物显示,纯化的表达产物既有C3d结合受体活性,亦有hCGβ抗原性。结论:利用新型分子佐剂C3d与hCGβ的连接,构建了pc-DNA3-hCGβ-C3d3真核细胞表达质粒,为提高hCGDNA免疫避孕疫苗的免疫原性及抗生育作用奠定了基础。     

甲基-β-环糊精对T细胞膜分子CD69和GM1表达的影响

目的：探讨甲基-β-环糊精（Methyl-β-eyclodextfin，MβCD）去除细胞膜胆固醇诱导人外周血T细胞CD69和单唾液酸四己糖神经节苷脂（GangliosideGMl，GMl）的表达及机理。方法：用高浓度MβCD（10mmol／L）处理PBMC，或预先加阻断剂PD98059或／和LY294002，用流式细胞术检测T细胞GMl及CD69的表达；免疫印迹法检测MβCD诱导的CD3^＋T细胞中ZAP-70的磷酸化。结果：MβCD（10mmol／L）处理PBMC30分钟，GMl在T细胞上即有高水平表达（〉90％），CD69于处理后2小时高水平表达（〉80％）；预先加入PD98059或LY294002均能够大部分阻断MβCD诱导的T细胞CIM9表达，部分阻断GMl表达，联合应用两种抑制剂也不能完全阻断GMl的表达；MβCD能够促进CD3^＋T细胞中ZAP-70分子的酪氨酸磷酸化。结论：MβCD能够促进T细胞GMl及CD69的表达；且这两种分子的表达可能与信号分子ZAP-70、MEK／ERK及PBK有关。