氨基胍对缺血-再灌注损伤视网膜形态和功能的影响

视网膜缺血-再灌注损伤（retina ischemia reperfusion injury,RIRI）是眼科临床常见的病理过程,可导致视网膜结构和功能的严重损伤,其损伤机制复杂,治疗效果不理想,影响患者视功能的恢复。研究发现NO在RIRI中发挥着重要作用,一氧化氮合酶（nitric oxide synthase,NOS）是NO合成的限速酶,应用NOS抑制剂氨基胍（aminoguanidine,AG）对大鼠青光眼视网膜神经节细胞具有明显的保护作用,而AG对RIRI有无保护作用尚不清楚。     

姜黄素对视网膜缺血-再灌注损伤大鼠视网膜IL-1β表达的影响

目的 观察姜黄素(CUR)对视网膜缺血-再灌注损伤(RIRI)大鼠视网膜白细胞介素-1β(IL-1β)表达的影响,从Toll样受体4/半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-8(TLR4/Caspase-8)通路探讨其机制,为CUR治疗RIRI的临床应用提供科学的理论依据。方法 SPF级健康无眼疾雄性SD大鼠102只,随机分为Sham组(n=10)、RIRI组(n=35)、RIRI+TLR4抑制剂(TAK-242)组(n=11)、RIRI+CUR组(n=35)及RIRI+CUR+TAK-242组(n=11),其中,Sham组、RIRI组及RIRI+CUR组根据建模后时间不同分为建模后6 h、12 h、24 h、72 h及7 d组。采用前房高眼压灌注法建立RIRI模型为RIRI组,Sham组不做特殊处理,RIRI+TAK-242组、RIRI+CUR组、RIRI+CUR+TAK-242组分别于建模前腹腔注射相应药物。免疫组织化学染色检测建模后各时间点各组大鼠视网膜中IL-1β⁺、TLR4⁺ Caspase-8⁺细胞数;建模后12 h, We...     

低氧预适应对缺血再灌注损伤大鼠视网膜促红细胞生成素及活性Caspase-3蛋白表达的影响

目的 观察低氧预适应(hypoxic preconditioning,HPC)后视网膜缺血再灌注损伤(retinal ischemia-reperfusion injury,RIRI)大鼠视网膜促红细胞生成素(erythropoietin,EPO)蛋白及活性Caspase-3蛋白表达的动态变化,探讨HPC预防RIRI的机制,为RIRI的防治提供有效的治疗方案.方法 取健康Sprague Dawley成年大鼠随机分为正常对照组(CON组),RIRI组与HPC+缺血再灌注损伤组(HPC组,HPC后采用高眼压法制成RIRI模型),每组根据RIRI时间分为6h、12 h、24h及72 h4个亚组.采用免疫组织化学法动态观察HPC对RIRI大鼠视网膜细胞EPO蛋白、活性Caspase-3蛋白表达的影响.结果 CON组大鼠视网膜仅见极少量的EPO+细胞;RIRI后6h,HPC组EPO+细胞数开始增加;RIRI后12h,HPC组EPO+细胞数(171±21)mm-2进一步增加,显著高于RIRI组[(149±20) mm-2,P＜0.05];RIRI后24h,HPC组EPO+细胞数(287±24)mm-2达较高水平并显著高于RIRI组[(238±22)mm-2,P＜0.01];RIRI后72 h,HPC组EPO+细胞数开始下降,但仍显著高于RIRI组(P＜0.05).RIRI后6h,RIRI组活性Caspase-3+细胞数(60±5)mm-2开始增加,显著多于HPC组[(53±5)mm-2,P＜0.05];RIRI后12h,RIRI组与HPC组活性Caspase-3+细胞数进一步增加,HPC组活性Caspase-3+细胞显著少于RIRI组(P＜0.01);RIRI后24 h,RIRI组与HPC组活性Caspase-3+细胞数达较高水平,HPC组活性Caspase-3+细胞数(578±26)mm-2显著少于RIRI组[(624±25)mm-2,P ＜0.01];RIRI后72 h,HPC组与RIRI组活性Caspase-3+细胞数均开始下降,HPC组Caspase-3+细胞数仍少于RIRI组(P＜0.05).结论 HPC可促进RIRI大鼠视网膜细胞EPO蛋白的表达,减轻活性Caspase-3蛋白的表达,从而减轻细胞凋亡,具有神经保护作用.     

基于JAK2/STAT3通路分析姜黄素对视网膜缺血-再灌注损伤大鼠视网膜小胶质细胞极化的影响

目的　探讨姜黄素（CUR）对视网膜缺血-再灌注损伤（RIRI）大鼠视网膜小胶质细胞极化的影响,并通过JAK2/STAT3通路探讨其机制,以期为CUR的临床应用提供理论依据。方法　健康雄性成年Sprague Dawley大鼠36只,随机分为假手术（Sham）组、RIRI组与CUR组,每组各12只。RIRI组和CUR组大鼠右眼采用高眼压法建立RIRI模型,Sham组仅将针头刺入大鼠右眼前房,不升高眼压。CUR组大鼠于建模前30 min腹腔注射CUR（100 mg·kg^-1）,RIRI组和Sham组大鼠腹腔注射等剂量生理盐水。造模后24 h,采用HE染色及免疫组织化学染色法观察各组大鼠视网膜形态及视网膜神经节细胞（RGC）数变化,Iba-1/CD16、Iba-1/Arg1免疫荧光双标法检测CUR对RIRI大鼠视网膜小胶质细胞极化的影响,免疫组织化学结合Western blot检测观察CUR对RIRI大鼠RGC及JAK2/STAT3通路信号分子表达的影响。结果　HE染色及免疫组织化学染色结果显示,Sham组大鼠视网膜细胞排列整齐,神经节细胞层见大量Brn-3a⁺细胞（即RGC）;与Sham组相比,造模后24 h,RIRI组大鼠内层视网膜厚度显著增加、RGC数显著减少,而CUR组大鼠内层视网膜厚度较RIRI组显著变薄,RGC数显著多于RIRI组（均为P<0.05）。免疫荧光双标染色结果显示,RIRI组大鼠视网膜Iba-1⁺CD16⁺细胞（M1型小胶质细胞）数较Sham组显著增加,而CUR组大鼠视网膜Iba-1⁺CD16⁺细胞数显著少于RIRI组,但仍多于Sham组（均为P<0.05）;RIRI组大鼠视网膜Iba-1⁺Arg1⁺细胞（M2型胶质细胞）数较Sham组增加,而CUR组大鼠视网膜Iba-1⁺Arg1⁺细胞数显著高于RIRI组（均为P<0.05）。免疫组织化学染色结果显示,与Sham组相比,RIRI组大鼠视网膜p-JAK2⁺、p-STAT3⁺细胞数均较Sham组增多,而CUR组大鼠视网膜p-JAK2⁺、p-STAT3⁺细胞数均显著少于RIRI组（均为P<0.05）。Western blot检测结果显示,Sham组大鼠视网膜p-JAK2和p-STAT3蛋白表达水平较低;造模后24 h,RIRI组大鼠视网膜p-JAK2和p-STAT3 蛋白表达显著升高,而CUR组大鼠视网膜p-JAK2和p-STAT3蛋白表达量均较RIRI组显著下降,但仍高于Sham组（均为P<0.05）。结论　CUR可调控小胶质细胞由M1型向M2型极化,从而减轻大鼠RIRI,具有神经保护作用,其机制可能与JAK2/STAT3信号通路激活有关。     

低氧预适应对缺血再灌注损伤大鼠视网膜低氧诱导因子-1α和血红素氧合酶-1表达的影响

目的 观察低氧预适应(hypoxic preconditioning,HPC)后视网膜缺血再灌注损伤(retinal ischemia-reperfusion injury,RIRI)大鼠视网膜低氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)、血红素氧合酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)的动态变化。方法 取65只Wistar成年大鼠随机分为正常对照组5只,RIRI组30只,HPC+RIRI组30只(HPC后采用高眼压法制成RIRI模型),后两组于RIRI后6 h、12 h、24 h、36 h、3 d、7 d各处死5只鼠。采用尼氏染色观察HPC对各组大鼠视网膜的影响,免疫组织化学法动态观察HPC对RIRI大鼠视网膜HIF-1α、HO-1表达的影响。结果 尼氏染色显示正常对照组大鼠视网膜结构清晰,各层细胞排列整齐紧密;RIRI组大鼠视网膜各层高度水肿,随着时间延长,神经节细胞数量逐渐减少,分布较紊乱、稀疏;HPC+RIRI组与RIRI组比较,各层细胞水肿明显减轻,细胞排列比较规整,神经节细胞数量减少降低,分布较整齐。正常对照组大鼠视网膜组织HIF-1α、HO-1微量表达。RIRI组HIF-1α表达升高,峰值在RIRI后12 h,阳性细胞数为(120.64±5.67)个·mm-2;RIRI后6 h起HPC+RIRI组HIF-1α表达较RIRI组升高,RIRI后12 h达高峰且阳性细胞数为(158.54±4.77)个·mm-2,24 h起逐渐下降,RIRI后7 d时HPC+RIRI组HIF-1α表达仍高于RIRI组;RIRI后RIRI组HO-1表达升高,峰值在RIRI后24 h且阳性细胞数为(129.54±4.58)个·mm-2;RIRI后6 h起HPC+RIRI组HO-1表达较RIRI组升高,RIRI后12 h达高峰且阳性细胞数为(157.56±4.67)个·mm-2,RIRI后24 h仍高表达且阳性细胞数为(150.78±4.97)个·mm-2,此后逐渐下降,RIRI后7 d,HPC+RIRI组仍明显高于RIRI组。与RIRI组比较,HPC+RIRI组RIRI后各时间点HIF-1α、HO-1阳性细胞数均增多,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。结论 HPC可促进RIRI大鼠视网膜HIF-1α、HO-1蛋白的表达,减轻视网膜损伤,具有视网膜保护作用。     

N-乙酰-5-羟色胺对视网膜缺血再灌注损伤大鼠视网膜中肿瘤坏死因子-α表达的影响

目的:观察N-乙酰-5-羟色胺（NAS）对视网膜缺血再灌注损伤（RIRI）大鼠视网膜中肿瘤坏死因子（TNF）-α蛋白表达的影响,探讨其可能机制。方法:采用随机数字表法将90只健康雄性Sprague-Dawley大鼠分为假手术组（10只）、RIRI组（40只）、NAS组（40只）。以右眼为实验眼。RIRI组、NAS组大鼠...     

EPO对视网膜缺血再灌注损伤中WTp53、CyclinD1含量变化的影响

目的 研究促红细胞生成素(erythropoietin,EPO)与视网膜缺血再灌注损伤(retinal ischemical reperfusion injury,RIRI)视网膜组织中野生型p53(wild type p53,WTp53)、CyclinDl的关系,为EPO治疗RIRI提供理论依据.方法 前房穿刺加压法制作大鼠RIRI模型,28只大鼠随机分为正常组和手术组,其中手术组大鼠左眼为RIRI组,右眼为治疗组(于再灌注开始即刻玻璃体腔内注射EPO 20 IU),手术组又按照再灌注后不同时间段分为1h、6h、12h、24h、48h、72h组.SABC免疫组织化学法检测视网膜组织中WTp53、CyclinD1的表达.结果 RIRI组视网膜在再灌注6h后可发现有WTp3、CyclinD1的表达,24h达到高峰,48h仍持续强表达,72h表达已明显下降.玻璃体腔内注射EPO后上述因子表达趋势不变,但各时间点治疗组较RIRI组表达强度明显减少(P＜0.01).结论 玻璃体腔内注射EPO可以抑制WTp53、CyclinD1表达,这可能是EPO治疗RIRI的机制之一.     

氨基胍对兔缺血-再灌注损伤后视网膜形态学及一氧化氮和一氧化氮合酶表达的影响

背景临床研究表明,多种眼科疾病如青光眼、视网膜中央动脉阻塞、缺血性视神经病变等均可导致视网膜缺血-再灌注损伤（RIRI）,严重影响视功能,因而对治疗RIRI药物的研究是非常必要的。目的观察并探讨氨基胍对兔RIRI后形态学的变化,并研究其对一氧化氮（NO）及一氧化氮合酶（iNOS）在视网膜中表达的影响及其机制。方法清洁级日本大耳白兔66只,以随机数字表法分为正常组、RIRI模型组和氨基胍治疗组。用前房灌注生理盐水法升高眼压60min后恢复灌注建立兔RIRI模型,氨基胍治疗组每日在模型兔腹腔内注射氨基胍注射液80mg／kg,而RIRI模型组以同样的方法注射等量生理盐水。RIRI模型组和氨基胍治疗组分别于缺血即时、再灌注后6、24、72h各取2只兔活体行眼底彩色照相及荧光素眼底血管造影（FFA）。各组兔分别于再灌注后1、6、24、72h用空气栓塞法处死并摘除眼球以制备视网膜切片,用TUNEL法检测视网膜组织神经细胞的凋亡变化,通过硝酸还原酶法检测NO浓度,比色法检测iNOS活力。结果各时间点眼底彩色照相及FFA检查结果表明,与RIRI模型组比较,氨基胍治疗组视网膜水肿程度减轻,血管闭塞程度及比例降低,荧光素渗漏量及面积减轻并减少。TUNEL染色凋亡细胞计数检测表明,正常组兔视网膜未见TUNEL阳性细胞,而缺血-再灌注1、6、24、72h后RIRI模型组兔视网膜凋亡细胞计数均明显高于氨基胍治疗组（F分组=2762．37,P=0．00;F时间=894．24,P=0．00）。RIRI模型组和氨基胍治疗组各组内相邻时间点之间TUNEL阳性细胞的差异均有统计学意义（RIRI模型组：q=24．47、36．59、-20．37,P〈0．05;氨基胍治疗组：q=20．94、16．79、-6．92,P〈0．05）,再灌注后24h各组TUNEL阳性细胞数量达到高峰。各时间点RIRI模型组兔视网膜NO浓度明显高于氨基胍治疗组（q=3．84、4．01、8．91、3．75,P〈0．05）,各组内相邻时间点之间NO浓度的差异均有统计学意义（RIRI模型组：q=4．77、13．40、-10．29,P〈0．05;氨基胍治疗组：q=4．55、9．05、-5．08,P〈0．05）,各组24h视网膜中NO浓度达峰值。各时间点RIRI组视网膜iNOS活力均明显高于氨基胍治疗组（q=-3．74、-4．94、-6．53、-3．98,P〈0．05）;各组内相邻时间点间iNOS活力的差异均有统计学意义（RIRI模型组：q=8．43、6．71、-6．39,P〈0．05;氨基胍治疗组：q=4．16、5．08、-3．93,P〈0．05）,各组24h iNOS活力达峰值。结论氨基胍对维持RIRI后的视网膜形态和功能起保护作用,其作用机制可能为抑制iNOS的活性,减少NO的生成。     

视网膜缺血-再灌注损伤中小胶质细胞对微循环的破坏作用

目的　探讨视网膜缺血-再灌注损伤(retinal ischemia-reperfusion injury,RIRI)中小胶质细胞活化与视网膜微循环损伤的关系及作用机制。方法　160只雄性C57BL/6小鼠右眼均采用前房灌注建立RIRI模型为RIRI组，左眼不作处理为正常对照组。在损伤后24 h、48 h、72 h分别进行视网膜冰冻切片、视网膜铺片免疫荧光染色检测小胶质细胞的活化情况，检测相关缺氧因子及炎症因子的表达，与正常对照组比较，研究小胶质细胞的激活状态与微循环损伤的关系，并初步分析其作用机制。结果　视网膜微循环结构损伤观察结果显示，与正常对照组相比，RIRI后24 h组大部分血管仍呈正常形态；RIRI后48 h组，闭塞的血管数量增多；RIRI后72 h组，血管损伤明显加重。浅层毛细血管密度正常对照组，RIRI后24 h、48 h、72 h组间两两比较差异均无统计学意义（均为P>0.05）。而深层血管网毛细血管密度RIRI后72 h组与其余3组相比明显减少，差异均有统计学意义（均为P<0.05），其余3组间差异均无统计学意义（均为P>0.05）。视网膜冰冻切片检测显示，RIRI后24 h组与正常对照组各层视网膜中抗离子钙接头蛋白（ionized calcium bindingadaptor molecule-1，Iba-1）阳性细胞数差异无统计学意义（P>0.05）。RIRI后48 h组各层中Iba-1阳性细胞数与正常对照组及24 h组差异均有统计学意义（均为P<0.05）。RIRI后72 h组各层中Iba-1阳性细胞数与正常对照组、24 h组、48 h组差异均有统计学意义（均为P<0.05）。视网膜铺片结果显示，RIRI后48 h组和72 h组活化的小胶质细胞数明显增加，与正常对照组和RIRI后24 h组在两个层次毛细血管中差异均有统计学意义（均为P<0.05），而72 h组小胶质细胞的活化达到高峰值，与其余组差异均有统计学意义（均为P<0.05）。RT-PCR检测结果显示:血管内皮生长因子和缺氧诱导因子-1α的缺血缺氧因子，肿瘤坏死因子-α和白细胞介素-1β的炎症因子在正常对照组与RIRI后24 h组、48 h组、72 h组，组间比较差异均有统计学意义（均为P<0.05）。结论　激活的小胶质细胞在RIRI中发挥了对微循环的破坏作用，损伤早期抑制小胶质细胞的活化可能成为此类疾病治疗的新思路。     

碱性成纤维细胞生长因子对视网膜缺血再灌注 损伤中凋亡相关基因表达的影响

目的探讨碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）对视网膜缺血再灌注损伤（RIRI）中凋亡相关基因表达的影响。方法将28只Wistar大鼠随机分为正常组、缺血组和治疗组，其中后两组又按照不同再灌注时间分为再灌注后1、6、12、24、48、72 h 6个时间段。建立RIRI动物模型，以bFGF(治疗组)或平衡盐溶液（缺血组）玻璃体腔注射，通过免疫组织化学链酶卵白素 生物素复合体法检测不同时段视网膜组织中野生型（WT）p53、c-fos、c-jun基因的表达变化。结果缺血组视网膜再灌注后6 h可发现有WTp53、c-fos和c-jun蛋白的表达，24 h达到高峰，48 h仍持续强表达，72 h表达已明显下降。bFGF治疗组各观察指标变化规律基本与缺血组相似，但表达量相对明显减弱。二组比较，在再灌注6～48 h各时段差异有统计学意义（P＜0.05）。结论RIRI能引起WTp53、c-fos、c-jun基因在视网膜神经节细胞层与内核层表达的增高；WTp53、c-fos、c-jun基因可能通过在与RIRI的细胞凋亡中起作用而参与了RIRI的发生机制；bFGF可以抑制RIRI时WTp53、c-fos、c-jun基因在视网膜表达的增高,从而对RIRI起治疗作用。(中华眼底病杂志,2005,21:310-313)     

视网膜缺血-再灌注损伤干预治疗新进展

视网膜缺血-再灌注损伤(RIRI)是眼科常见的病理生理损伤性眼病,常发生于视网膜动静脉阻塞、糖尿病视网膜病变、急性闭角型青光眼等与缺血相关的眼病.表现为缺血性患眼在血液再灌注后,细胞功能发生代谢性障碍,视网膜组织结构损伤,视功能下降.缺血-再灌注损伤是由多种因素共同作用的结果,目前公认的假说主要包括氧自由基的损伤、细胞内的钙超载、白细胞介素介导作用和细胞凋亡等.但目前对于RIRI的保护及治疗研究有限,本文就国内外有关RIRI的干预治疗新进展综述如下.     

雌二醇对视网膜缺血-再灌注损伤后基质细胞衍生因子-1表达的影响

目的 通过观察视网膜缺血-再灌注损伤后基质细胞衍生因子-1(stromal cell-derived factor-1,SDF-1)的表达情况,以及雌二醇对SDF-1的表达及调控作用,研究雌二醇对大鼠视网膜缺血-再灌注损伤的保护作用机制.方法 通过升高大鼠眼压的方法建立视网膜缺血-再灌注损伤模型,应用RT-PCR和Western blot方法检测视网膜缺血-再灌注损伤后各时间点(6h、12h、24 h)视网膜SDF-1表达情况;腹腔注射雌二醇后观察雌二醇对视网膜缺血-再灌注损伤后SDF-1表达的影响;并且应用雌激素受体拮抗剂ICI 182-780研究雌激素受体对雌二醇诱导视网膜缺血-再灌注损伤后的SDF-1的影响.结果 SDF-1 mRNA和蛋白在缺血-再灌注6h组、缺血-再灌注12h组和缺血-再灌注24 h组表达均增加,与正常对照组比较差异均有统计学意义(均为P＜0.05),并且在缺血-再灌注12h组SDF-1表达达高峰.雌二醇预处理对视网膜缺血-再灌注具有一定的保护作用;缺血-再灌注+雌二醇组SDF-1 mRNA和蛋白表达增加,与缺血-再灌注对照组及缺血-再灌注+溶剂对照组比较差异均有统计学意义(均为P ＜0.05).与缺血-再灌注+雌二醇组相比较,缺血-再灌注+雌二醇+ICI182-780组SDF-1 mRNA和蛋白表达明显降低,差异均有统计学意义(均为P＜0.05).结论 雌二醇对视网膜缺血-再灌注损伤的保护作用是通过雌激素受体介导的SDF-1 mRNA和蛋白表达增强实现的.     

骨髓间充质干细胞移植对缺血-再灌注损伤视网膜中Fas／FasL及caspases-3表达的影响

背景视网膜缺血-再灌注损伤（RIRI）严重影响视力,其损伤机制是视网膜细胞的凋亡,治疗效果不佳。研究证实骨髓间充质干细胞（BMSCs）视网膜下移植后可显著减轻RIRI,而BMSCs视网膜移植所产生的神经保护机制是否与其抑制凋亡作用有关目前尚不清楚。目的观察BMSCs视网膜下移植对RIRI大鼠视网膜中凋亡相关因子Fas／FasL和caspases-3蛋白表达的影响,探讨BMSCs移植治疗RIRI的神经保护机制。方法无菌条件下分离SD大鼠的股骨和胫骨骨髓,离心收集细胞后用DMEM低糖培养液制成骨髓细胞悬液,体外培养大鼠BMSCs,并以1×10^6～2×10^6个／ml的细胞密度和1：2进行传代。64只清洁级健康成年SD大鼠按随机数字表法随机分为正常对照组、模型对照组、BMSCs移植组及PBS对照组,每组16只。用视神经线栓法制备大鼠视网膜RIRI模型,BMSCs移植组大鼠于造模后24h视网膜下注入5×10^4个活BMSCs,PBS对照组以同样的方式注入PBS。用颈椎脱臼法处死大鼠,制备16μm厚视网膜切片。采用免疫组织化学法动态观察BMSCs移植后6、24、48、72h各组大鼠视网膜中Fas、FasL及caspase-3蛋白表达的变化。结果BMSCs视网膜下移植后72h,荧光显微镜观察可见视网膜下Hoechst33324阳性细胞。BMSCs视网膜下移植后6、24、48、72h,正常对照组大鼠视网膜仅见微量Fas、FasL和caspase3的阳性表达;BMSCs视网膜下移植后各时间点,模型对照组与BMSCs移植组大鼠视网膜均可见Fas、FasL、caspase-3阳性表达细胞,免疫组织化学染色强度和细胞数量值均明显高于正常对照组,差异均有统计学意义（均P〈0．01）。随着BMSCs移植时间的延长,各组大鼠视网膜中Fas、FasL及caspase-3阳性细胞数均逐渐下降,各时间点BMSCs移植组大鼠视网膜中Fas、FasL、caspase-3的阳性表达值均明显低于模型对照组和PBS对照组大鼠,差异均有统计学意义（P〈0．05）,但各时间点模型对照组与PBS对照组间大鼠视网膜中Fas、FasL、caspase-3阳性细胞数变化的差异均无统计学意义（均P〉0．05）。结论视网膜下移植BMSCs可下调RIRI大鼠视网膜中凋亡相关蛋白Fas、FasL及caspase-3的表达,从而减轻RIRI大鼠视网膜神经节细胞的凋亡。     

JAK-STAT信号通路的激活对视网膜缺血-再灌注损伤的促进作用

背景 视网膜缺血-再灌注损伤(RIRI)是眼科临床上常见的多种视网膜血管性疾病共同的病理损伤过程,发病机制复杂.研究表明视网膜细胞凋亡和神经纤维变性是RIRI最终的共同通路.Janus激酶信号转导子与转录激活子(JAK-STAT)信号通路是近年来新发现的一条信号转导途径,参与多种病理生理过程,但该通路与RIRI病理过程的关系尚不明确. 目的 探讨JAK-STAT信号通路在大鼠RIRI过程中被激活的时程及其意义. 方法 采用随机数字表法将40只正常清洁级成年SD大鼠随机分为RIRI 6 h、12h、24 h和48 h组,大鼠的一侧眼采用前房生理盐水灌注法升高眼压以建立RIRI模型,正常对侧眼作为正常对照组.大鼠眼压升高至110 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)并能持续60 min视为造模成功.分别于造模后6、12、24和48 h处死大鼠并摘除大鼠眼球,采用免疫组织化学法检测各组大鼠视网膜中STAT3和JAK2蛋白的表达强度并定位;采用实时荧光定量PCR法检测大鼠视网膜中STAT3 mRNA和JAK2 mRNA相对表达量的动态变化,并与正常对照组检测结果进行比较.结果 免疫组织化学检测显示,JAK2和STAT3蛋白主要表达于视网膜内核层和视网膜神经节细胞(RGCs)层,正常对照组大鼠视网膜中JAK2和STAT3蛋白均呈弱阳性表达,呈黄色染色,RIRI模型大鼠视网膜中JAK2和STAT3蛋白表达均明显增强,呈棕黄色染色.各组间大鼠视网膜中JAK2和STAT3蛋白表达强度的总体比较差异均有统计学意义(F=88.735、96.625,均P＜0.01),RIRI后各时间点组大鼠视网膜中JAK2和STAT3蛋白表达强度均明显高于正常对照组,RIRI 12 h组大鼠视网膜中JAK2和STAT3蛋白表达强度达峰值,均明显高于正常对照组,差异均有统计学意义(JAK2:t=4.308、5.559、5.315、4.726,均P＜0.01;STAT3:=5.047、7.843、6.281、4.887,均P＜0.01).RIRI模型眼视网膜内层增厚、组织疏松,可见细胞空泡样变性及RGCs数量减少.实时荧光定量PCR显示,各组间大鼠视网膜中JAK2 mRNA和STAT3 mRNA总体比较差异均有统计学意义(F=111.239、129.539,均P＜0.01),RIRI 6、12、24和48 h组大鼠视网膜中JAK2 mRNA和STAT3 mRNA相对表达量较正常对照组均明显增加,差异均有统计意义(JAK2mRNA:t=3.504、5.102、4.679、4.213,均P＜0.01;STAT3 mRNA:t=6.541、8.787、5.693、5.898,均P＜0.01).结论 RIRI模型鼠视网膜形态发生病理改变,RGCs数量减少,同时大鼠视网膜中JAK2和STAT3表达上调,RIRI大鼠视网膜中JAK2和STAT3的表达变化与视网膜形态损伤趋势一致,提示JAK-STAT通路参与RIRI的病理损伤过程.     

藏红花素对视网膜缺血再灌注损伤小鼠视网膜神经节细胞的保护作用及其机制研究

目的　研究藏红花素对视网膜缺血再灌注损伤（RIRI）小鼠视网膜神经节细胞（RGC）的保护作用及其机制。方法　将144只C57BL/6小鼠随机分为3组:假手术组、模型组、藏红花素治疗组。模型组和藏红花素治疗组小鼠建立RIRI模型,藏红花素治疗组小鼠造模前30 min腹腔注射50 mg·kg^-1藏红花素。RIRI后14 d,视网膜铺片染色比较各组小鼠RGC密度差异。RIRI后24 h,HE染色比较各组小鼠视网膜内层厚度差异。于RIRI后不同时间点（0 h、3 h、6 h、9 h、12 h、15 h）取各组小鼠视网膜组织,通过多重基因定量分析系统检测NLRP3、ASC、Caspase-1、白细胞介素-1β（IL-1β） mRNA的表达变化。RIRI后6 h和12 h取各组小鼠视网膜组织,Western blot检测NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β蛋白的表达,ELISA检测IL-1β蛋白的含量,并对比分析。结果　小鼠RIRI后14 d,视网膜铺片染色结果显示,藏红花素治疗组较模型组小鼠RGC密度增加约18.5%（P<0.05）。RIRI后24 h,HE染色结果显示,藏红花素治疗组小鼠视网膜内层厚度较模型组显著降低（P<0.01）。多重定量分析系统检测结果显示,RIRI后6 h、9 h及12 h,藏红花素治疗组小鼠视网膜组织中Caspase-1以及IL-1β mRNA表达较模型组均显著降低（均为P<0.05)。Western blot检测结果显示,藏红花素治疗组小鼠视网膜组织中Caspase-1以及IL-1β蛋白表达较模型组均显著降低（均为P<0.05)。RIRI后6 h、12 h,模型组小鼠视网膜组织中NLRP3、ASC mRNA和蛋白表达与假手术组相比无显著变化（均为P>0.05)。ELISA检测结果进一步证实,RIRI后6 h和12 h,藏红花素治疗组小鼠视网膜组织中IL-1β蛋白含量较模型组均显著降低（均为P<0.05)。结论　藏红花素通过抑制Caspase-1和IL-1β表达保护RIRI小鼠RGC。     

不同N-乙酰-5-羟色胺(NAS)给药途径对大鼠视网膜缺血-再灌注损伤的影响

目的探讨腹腔与尾静脉注射N-乙酰-5-羟色胺(N-acetylserotonin,NAS)两种给药途径对大鼠视网膜缺血-再灌注损伤(retinal ischemia-reperfusion injury,RIRI)组织病理学、活性半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)蛋白表达及细胞凋亡的影响。方法健康无眼疾成年Sprague-Dawley雄性大鼠54只,采用随机数字表法分为正常对照组(n=6)、RIRI腹腔组(n=12)、RIRI静脉组(n=12)、NAS腹腔组(n=12)和NAS静脉组(n=12),后四组采用升高眼压法建立大鼠RIRI模型。NAS腹腔组、NAS静脉组于建模前30 min分别经腹腔、尾静脉注射NAS(10 mg·kg^-1),RIRI腹腔组、RIRI静脉组于造模前30 min分别经腹腔、尾静脉注射同等剂量的生理盐水。RIRI后24 h,采用免疫组织化学染色检测各组大鼠视网膜中活性Caspase-3的表达,TUNEL染色检测各组视网膜细胞凋亡情况;RIRI后7 d,HE染色观察各组视网膜组织病理学变化。结果HE染色结果示,正常对照组大鼠视网膜各层细胞排列整齐、规则;RIRI后7 d,RIRI腹腔组与RIRI静脉组大鼠视网膜细胞排列稀疏、紊乱,形态不规则,视网膜内层厚度变薄;NAS腹腔组视网膜细胞形态较规则,排列较规整;NAS静脉组视网膜各层形态及细胞排列均趋于正常。NAS静脉组视网膜内层厚度(91.67±1.43)μm显著高于NAS腹腔组(87.80±1.33)μm、RIRI腹腔组(82.37±1.09)μm和RIRI静脉组(82.81±0.90)μm,差异均具有统计学意义(均为P<0.05);且NAS静脉组视网膜神经节细胞数(616.90±79.51)个·mm^-2显著高于NAS腹腔组(529.25±92.05)个·mm^-2、RIRI静脉组(434.42±87.17)个·mm^-2、RIRI腹腔组(390.72±72.12)个·mm^-2,差异均具有统计学意义(均为P<0.05)。免疫组织化学染色结果发现,RIRI后24 h,NAS静脉组活性Caspase-3阳性细胞数(145.01±22.54)个·mm^-2少于NAS腹腔组(221.34±30.84)个·mm^-2,差异具有统计学意义(P<0.05),二者活性Caspase-3阳性细胞数均显著少于RIRI静脉组(380.54±41.25)个·mm^-2和RIRI腹腔组(387.79±26.72)个·mm^-2,差异均具有统计学意义(均为P<0.05)。TUNEL染色结果示,RIRI后24 h,NAS静脉组TUNEL染色阳性细胞数(1468.03±128.40)个·mm^-2少于NAS腹腔组(1968.96±254.98)个·mm^-2,差异具有统计学意义(P<0.05),二者TUNEL染色阳性细胞数均显著少于RIRI静脉组(2122.77±165.76)个·mm^-2和RIRI腹腔组(2140.53±177.96)个·mm^-2,差异均具有统计学意义(均为P<0.05)。结论腹腔及静脉注射NAS治疗均可减少视网膜细胞凋亡,从而减轻RIRI大鼠视网膜损伤,且静脉注射给药的疗效优于腹腔给药。     

急性视网膜缺血再灌注损伤后大鼠视网膜副凋亡和自噬的发生

目的　探讨大鼠急性视网膜缺血再灌注损伤（retinal ischemia-reperfusion injury,RIRI）后不同时间点视网膜中副凋亡及自噬的发生。方法　将30只健康成年SD雄性大鼠随机分为RIRI组及正常对照组。利用高眼压前房灌注法建立SD大鼠急性RIRI动物模型。正常对照组不做任何处理。急性RIRI后1 d、3 d、7 d、28 d各时间点取各组大鼠的视网膜组织,利用透射电子显微镜（transmission electron microscopy,TEM）检测视网膜神经节细胞（retinal ganglion cells,RGCs）副凋亡及自噬的发生;利用免疫荧光染色法检测视网膜微管相关蛋白1轻链3（microtubule associated protein 1 light chain 3,LC3）的表达。结果　急性RIRI后1 d持续至28 d,TEM可见RGCs细胞质空泡数量较正常对照组增高。急性RIRI后1 d持续至28 d,TEM可见RGCs细胞质中自噬体数量增加。正常对照组RGCs的细胞质中自噬体每50 μm²平均为0.79个,急性RIRI后7 d自噬体的平均数量达到高峰,每50 μm²平均为2.29个,与正常对照组相比差异具有统计学意义（P<0.05）。免疫荧光法检测发现,与正常对照组相比,急性RIRI后1 d开始,RGCs的细胞质中LC3表达增加,并在整个实验期间持续高表达,正常对照组RGCs层的LC3阳性细胞百分比为15.90%,急性RIRI后1 d、28 d时LC3阳性细胞百分比分别为46.95%和52.30%,与正常对照组相比差异均具有统计学意义（均为P<0.05）。结论　急性RIRI后RGCs涉及副凋亡和自噬的激活,各种类型的程序性细胞死亡可作为单一细胞死亡的形式或多种细胞死亡形式共存,参与急性RIRI视网膜损伤。