PSF1在结肠癌组织中的表达及其对结肠癌细胞增殖的影响

目的检测PSF1在结肠癌组织中的表达,探讨RNA干扰沉默PSF1表达对人结肠癌细胞增殖的影响及其可能的机制。方法收集2004年5月至2006年12月间经病理确诊的40例结肠癌标本．采用Westerllblot检测标本中PSF1蛋白表达水平;应用脂质体法将靶向PSF1的短发夹RNA（shRNA）干扰质粒转染人结肠癌细胞株LOVO、HT．29和HCT116,Westernblot法检测PSF1蛋白表达变化．分别应用MTY法、软琼脂克隆形成实验及荧光定量PCR检测转染PSF1shRNA干扰质粒对结肠癌细胞增殖活性、锚定非依赖性生长能力及PSF2、PSF3和SLD5mRNA表达的影响。结果结肠癌组织中PSF1蛋白相对表达量为0．485±0．113,显著高于正常黏膜组织的0．056±0．014（P〈0．01）。转染PSF1sbRNA干扰质粒后,LOVO、HT-29和HCT116细胞中PSF1蛋白表达水平均显著下降（P〈0．05）,细胞增殖能力显著降低,软琼脂克隆形成率明显下降。与阴性对照组及正常生长组细胞比较,差异均有统计学意义（P〈0．05）。转染PSF1shRNA干扰质粒后．LOVO、HT-29和HCT116细胞中PSF2、PSF3和SLD5mRNA表达均明显下降（P〈0．05）。结论PSF1与结肠癌的发生发展具有一定关系。利用RNA干扰技术能有效抑制结肠癌细胞中PSF1表达。并抑制结肠癌细胞增殖。PSF1基因有望成为结肠癌靶向治疗的新靶点。     

慢病毒介导的NOB1基因沉默对人结肠癌细胞增殖及凋亡的影响

目的探讨RNA干扰技术沉默人NOB1基因对人结肠癌RKO细胞增殖和凋亡的影响。方法设计靶向NOB1基因的小干扰RNA（siRNA）,构建NOB1基因特异性的RNA干扰慢病毒载体,感染RKO细胞,并设置阴性对照组。实时定量PCR和Westemblot分别检测两组细胞NOB1mRNA及蛋白的表达情况;CellomicsArrayScanVTIHCS高内涵分析仪检测感染细胞的增殖和克隆形成能力;流式细胞术检测细胞周期及凋亡的变化：裸鼠成瘤实验检测0NOB1-siRNA对肿瘤的抑制作用。结果NOB1-shRNA慢病毒感染RKO细胞3d后．与阴性对照组比较．NOB1mRNA和蛋白的表达明显降低,克隆形成数减少,而细胞凋亡数增加（均P〈0．05）。裸鼠成瘤实验结果显示,NOB1．shRNA感染组裸鼠移植瘤体积为（405±102）mm3,小于阴性对照组的（870±165）mm3（P〈0．05）。结论通过RNA干扰方式沉默NOB1基因的表达．有望作为抑制结肠癌发展的有效手段。     

NK 4抑制结肠癌细胞增殖的机制初探

目的探讨肝细胞生长因子及其受体（HGF/c-Met）拮抗剂对结肠癌细胞的作用及其与MEK/ERK信号通路的关系,明确以HGF/c-Met为靶点治疗结肠癌的细胞内信号传导机制.方法分别将HGF及选择性c-Met拮抗剂NK-4作用于结肠癌细胞系LoVo,运用MTT法分别于0,6,12,24h检测细胞增殖状态;流式细胞仪观察两者对细胞凋亡的影响.采用Western blot检测药物作用前后c-Met,p-c-Met,MEK2和p-ERK及其靶基因产物C-myc的表达.结果NK-4组呈剂量依赖性方式抑制结肠癌细胞增殖,促进其凋亡,并使p-c-Met及MEK2/ERK通路相关蛋白表达下调,而HGF组则使其表达上调;同时处理24 h后,空白组与NK-4组（1μg/mL）中p-c-Met,MEK2,p-ERK及C-myc蛋白表达水平比值分别为2.5 8,1.89,1.67和2.21（P＜0.01）,而与HGF（50ng/mL）组相关蛋白比值为0.46,0.71,068和0.58（P＜0.01）.结论选择性HGF拮抗剂NK-4抗结肠癌可能通过阻断MEK2/ERK信号传导通路影响肿瘤细胞增殖与凋亡,以HGF/c-Met为靶点的结肠癌信号通路阻断治疗具有可行性和有效性.     

逆轩录病毒载体介导人类肿瘤坏死因子基因在结肠癌细胞中 …

探讨肿瘤坏死因子基因导入结肠癌细胞的方法及可行性。方法 用含ｐＬＸＳＮ／ＴＮＦ的逆转录病毒感染结肠癌细胞，用Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印染，Ｎｏｒｔｈｅｒｎ印染及Ｗｅｓｔｅｒｎ印染法检测ＴＮＦ基因在被转化的细胞株ＣｌｏｎｅＡ／ＴＮＦ中的转移，转录及表达，应用ＭＴＴ法测定该细胞分泌的ＴＮＦ活性。     

RNA干扰转录因子激活蛋白4基因表达对结肠癌细胞株SW480的影响

目的观察转录因子激活蛋白4（AP-4）基因对结肠癌细胞株SW480生物学行为的影响。方法设计合成针对AP-4基因外显子7的小分子干扰RNA（siRNA）表达质粒,用脂质体转染SW480细胞,通过RT-PCR技术、Western印迹、四甲基偶氮唑盐实验（MTT法）、流式细胞仪和Transwell体外侵袭实验等检测该siRNA对SW480细胞基因表达、细胞增殖、细胞周期及细胞凋亡能力和浸润转移能力等生物学行为的影响。结果AP-4siRNA转染SW480细胞96h后,其AP-4mRNA水平下降了58%,培养液上清AP-4蛋白浓度下降了75%（P〈0.01）。细胞增殖受到明显抑制,抑制率达61%～78%;流式细胞仪检测结果显示,AP-4siRNA组SW480细胞凋亡率为（21.70±2.51）%,显著高于阴性对照组的（2.31±0.14）%（P〈0.01）,G0-G1期细胞比例增加（P〈0.01）,G2-M期细胞减少（P〈0.05）;Transwell体外侵袭实验显示,AP-4siRNA能明显抑制SW480细胞的体外侵袭力（P〈0.01）。结论应用siRNA技术沉默AP-4基因能有效抑制SW-480细胞AP-4的表达,进而抑制细胞的生长、增殖及诱导细胞的凋亡,为以AP-4为靶向的结肠癌基因治疗提供了新的思路和手段。     

siRNA靶向抑制GHR对人结肠癌SW480细胞增殖的影响

目的利用小分子干扰RNA(siRNA)技术抑制人结肠癌SW480细胞人生长激素受体(GHR)基因的表达,观察GHR基因沉默对SW480细胞增殖的影响。方法设计特异性siRNA,构建针对人GHR真核质粒的表达载体(pcDNATM6.2-GW/EmGFP-siRNA-GHR),用电转染法转染人结肠癌SW480细胞,培养48~72 h后,用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞增殖活性;Western Blot检测GHR蛋白表达;实时荧光定量PCR(qPCR)方法检测GHRmRNA水平变化。结果转染siRNA后,与对照组相比,转染组细胞增殖速率、GHR的蛋白表达量、GHRmRNA水平均明显降低(均P<0.05)。结论构建的pcDNATM6.2-GW/EmGFP-GHRsiRNA能有效地下调SW480细胞中GHR的表达,从而抑制SW480细胞的增殖。     

靶向β-catenin的shRNA抑制结肠癌细胞增殖的体外实验研究

目的探讨靶向β-catenin的shRNA对结肠癌细胞Colo205的WNT通路的阻断和该基因沉默效应对结肠癌细胞在体外的生长抑制作用。方法构建靶向β-catenin的shRNA载体质粒和阴性对照载体.然后分别转染人结肠癌细胞Colo205。用RT-PCR和Western印迹法检测β-catenin的mRNA和蛋白的表达情况,细胞免疫荧光染色法检测β-catenin蛋白的表达。噻唑蓝实验评价转染后各组细胞的体外增殖情况。软琼脂集落形成实验检测各组细胞的非锚着依赖性生长的能力。结果成功构建了靶向β-catenin的shRNA和阴性对照质粒载体。特异性靶向β-catenin的shRNA能够明显下调β-catenin mRNA,并抑制β-catenin蛋白的表达,其抑制率分别为47.89％和45.26％（P〈0.05）。转染了特异性shRNA的实验组（CAT组）细胞增殖在转染后呈现随时间延长而进行性抑制的现象。在转染后72h,CAT组的细胞存活率为48.5％。与空白对照组的91.3％相比明显降低（P〈0.05）。在软琼脂里CAT组的细胞克隆数目（9个）明显少于空白对照组（46个）和阴性对照组（43个）（P〈0.05）。结论靶向β-catenin的特异性shRNA对结肠癌Colo205细胞具有沉默β-catenin基因表达从而阻断WNT信号通路的作用,并且能够有效地在体外抑制结肠癌细胞的增殖。     

上调miRNA-34a表达对人结肠癌细胞体外生长的影响

目的:探讨上调miRNA-34a表达对人结肠癌细胞株体外生长的影响。方法:分别用人工合成的miRNA-34a模拟物与阴性对照序列转染人结肠癌HT-29细胞,培养一定时间后,用MTT法检测细胞增殖情况;流式细胞技术检测细胞的凋亡;q RT-PCR、Western blot法检测SIRT1的m RNA和蛋白的表达。结果:与转染阴性序列的HT-29细胞比较,转染miRNA-34a模拟物的HT-29细胞48 h后增殖能力明显降低;72 h后细胞凋亡率明显增加,miRNA-34a靶基因SIRT1的m RNA与蛋白表达均明显降低,差异均有统计学意义(均P0.05)。结论:miRNA-34a可能通过调节其靶基因SIRT1的表达影响结肠癌细胞的生物学行为,上调miRNA-34a的表达能抑制结肠癌细胞的生长。     

CDX2基因干扰对人结肠癌细胞在裸鼠体内生长的影响

目的:探讨CDX2基因表达对结肠癌细胞生长的影响。方法:将体外转染CDX2-shRNA慢病毒、空慢病毒载体及无转染的人结肠癌细胞系SW480和HT29接种到裸鼠皮下,制备皮下移植瘤模型,观察各组移植瘤的生长情况,28d后处死裸鼠,剥取移植瘤称重,并分别用免疫组化、Westernblot检测各组移植瘤组织Ki-67与CDX2的表达。结果:与各自空白对照组(无转染的SW480或HT29细胞移植)比较,两个干扰组(转染CDX2-shRNA慢病毒的SW480或HT29细胞移植)移植瘤生长速度均明显加快、移植瘤质量明显增加(SW480:679.11mgvs.379.36mg;HT29:715.78mgvs.427.07mg),瘤组织Ki-67蛋白表达水平明显升高、CDX2蛋白表达明显下调(均P0.05)。两个阴性对照组(转染空慢病毒载体的SW480或HT29细胞移植)的各指标与各自空白对照组间均无明显差异(均P0.05)。结论:抑制CDX2基因的表达能促进人结肠癌细胞的裸鼠体内的生长,故CDX2可能是一种重要的抑癌基因。     

Ku80基因RNAi逆转录病毒载体的构建及稳定转染人肾癌786-O细胞株的建立

目的 构建并鉴定逆转录病毒介导的Ku80基因RNA干扰表达体系,并建立稳定、高效、长久低表达Ku80的人肾癌786-O细胞株.方法 针对Ku80基因,设计并合成3对特异性RNA干扰靶序列,退火形成双链DNA,与BglⅡ和Hind Ⅲ双酶切后的pSUPERretro-puro载体连接,构建pSUPERretro-puro-siKu80干扰表达载体,并对重组载体进行测序鉴定.筛选出基因沉默效应最强的干扰序列后使用磷酸钙法共转染293FT细胞,产生的病毒颗粒随后感染786-O细胞,经嘌呤霉素筛选得到阳性克隆.用RT-PCR检测Ku80基因mRNA表达,Western blot测定转染后786-O细胞中Ku80蛋白的表达量,以鉴定稳定细胞株.结果 测序结果证实目的 片断正确插入pSUPERretro-puro表达载体中,成功构建了pSUPERretro-puro-siKu80干扰表达载体,稳定转染干扰表达载体的786-O细胞Ku80基因的表达显著降低.结论 成功构建了抑制Ku80基因表达的逆转录病毒载体,并获得Ku基因稳定干扰的人肾癌786-O细胞株,为下一步利用小干扰RNA技术研究肾癌的基因治疗奠定了基础.     

PARP1特异性siRNA对前列腺癌PC3细胞增殖的影响及其机制研究

目的 研究多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶1(PARP1)特异性小分子干扰RNA(siRNA)对雄激素非依赖性前列腺癌PC3细胞株增殖的影响并初步探讨其作用机制. 方法 设计合成3条PARP1特异性siRNA序列,进行脂质体转染后,通过RT-PCR、蛋白质印迹法检测其对PARP1的干扰效果,筛选出最佳干扰效果的2条siRNA序列;通过单溶液细胞增殖检测法检测干扰PC3细胞内源性PARP1表达对细胞增殖的影响,并检测细胞内Akt及其下游GSK3β活化水平的变化. 结果 与空白对照组相比,转染阴性对照序列对PARP1的mRNA和蛋白表达水平无明显影响,而转染RNA干扰序列1706、2003和2907均可以明显干扰PARP1的表达,其中mRNA抑制率分别为(52.07±4.65)％、(44.38 ±9.15)％和(22.05 ±6.65)％,蛋白抑制率分别为(86.86±4.94)％、(83.30±7.18)％和(63.05 ± 10.19)％.RNA干扰序列1706和2003对PC3细胞的增殖抑制率分别为(38.93 ±3.87)％和(34.93±1.21)％,并可以下调细胞内Akt、GSK3β的磷酸化水平. 结论 PARP1特异性siRNA可以明显干扰PC3细胞内源性PARP1的表达并抑制细胞增殖,该抑制作用与Akt的活化抑制以及其下游GSK3β的激活有关.     

干扰磷脂爬行酶1基因表达对结直肠癌细胞增殖和粘附的影响

目的 探讨PLSCR1在结直肠癌细胞增殖和粘附过程中的作用.方法 常规培养3株结直肠癌细胞,采用免疫细胞染色和免疫印迹法筛选PLSCR1高表达的细胞株.设计三条RNA干扰片段及一条阴性对照片段,稳定转染高表达PLSCR1的结直肠癌细胞株,采用实时荧光定量PCR和免疫印迹法验证干扰结果,筛选出对PLSCR1蛋白抑制率最高的干扰片段,通过MTT方法来评估转染后结直肠癌细胞增殖能力的变化,采用细胞粘附实验来评估转染后结直肠癌细胞粘附能力的变化.结果 免疫细胞染色提示LoVo细胞株高表达PLSCR1,与免疫印迹法结果相一致;转染siRNA-390后,LoVo细胞株PLSCR1的mRNA抑制效果最为明显,抑制率为88.4％,免疫印迹法检测进一步验证siRNA-390片段抑制PLSCR1蛋白表达最为显著.MTT法、纤连蛋白,粘附和层连蛋白检测显示,siRNA-390干扰下调PLSCR1的表达后,细胞生长变缓,粘附能力下降.结论 干扰PLSCR1能显著抑制肿瘤的增殖和粘附能力,提示PLSCR1可能在结直肠癌浸润和转移中具有一定作用.     

人乳头瘤病毒16型E6E7癌基因对结肠癌细胞周期和增殖的影响

目的检测和分析人乳头瘤病毒(HPV)16型E6E7癌基因对结肠癌细胞增殖状况和细胞周期的影响。方法运用含有HPV16 E6E7癌基因的重组腺伴随病毒(rAAV—E6E7)感染HCT116和SW480结肠癌细胞株,应用流式细胞术检测感染效率,Western blot法检测HPV16 E6癌蛋白的表达。MTT法和流式细胞技术分别检测感染前后结肠癌细胞的增殖状况和细胞周期。结果rAAV—E6E7感染结肠癌细胞后24h开始可以检测到HPV16 E6癌蛋白的表达,未感染的细胞不表达HPV16 E6蛋白。rAAV—E6E7感染后,HCT116细胞群体倍增时间缩短为对照组的68．42％,OD540值升高47.48％,G0／G1期细胞比例下降,S期细胞比例增高。SW480细胞群体倍增时间缩短为对照组的77.06％、OD540值升高47.18％。结论高危型HPV的E6E7癌基因能够促进结肠细胞的增殖、干扰其细胞周期,有可能在结直肠癌的发生、发展过程中发挥作用。     

咖啡酸苯乙酯对大肠癌细胞增殖和凋亡的影响

目的探讨咖啡酸苯乙酯(caffeic acid phenethyl ester,CAPE)对培养的大肠癌SW480细胞增殖、细胞周期和细胞凋亡的影响。方法不同浓度CAPE处理培养的大肠癌SW480细胞后,采用MTT法检测细胞的增殖活性,流式细胞仪检测细胞周期分布和细胞凋亡率,TUNEL染色观察凋亡细胞。结果CAPE对SW480细胞的生长具有明显的抑制作用,其作用表现为剂量依赖性和时间依赖性。流式细胞仪检测发现2.5、5.0、10mg/L的CAPE对SW480处理24h后,G0/G1期细胞比例上升,S期细胞比例下降,细胞凋亡率上升,呈剂量依赖性。TUNEL染色也发现CAPE作用后凋亡细胞数量增加。结论CAPE对大肠癌SW480细胞株具有明显的增殖抑制作用,其作用机制与阻滞细胞周期G期和诱导细胞凋亡有关。     

Stat3显性负性基因调控人结肠癌细胞增殖与凋亡的分子机制

目的 探讨转染Stat3（转录信号传导子和激活子3）显性负性基因Stat3β质粒阻断人结肠癌细胞系SW480细胞的Stat3信号传导通路对人结肠癌细胞增殖和凋亡的影响及可能的机制.方法 应用阳离子脂质体向人结肠癌细胞系SW480细胞中转染携带Stat3β基因的质粒,四唑盐法检测细胞增殖能力,流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡,反转录聚合酶链反应检测Stat3靶基因cyclinD1、bcl-xL mRNA表达情况.数据统计分析采用独立样本t检验.结果 转染Stat3β质粒36 h后,SW480细胞的增殖受到显著抑制（t=5.216,P=0.006）;G0/G1期的细胞比例由40.37%上升至67.25%,S期细胞由44.68%下降至31.23%;发生早期凋亡的细胞比例由5.34%上升至24.42%;同时cyclin D1、bcl-xLmRNA表达水平较对照组显著下降（t=5.228,P=0.010;t=3.517,P=0.025）.结论 转染携带Stat3β基因的质粒可以通过下调Stat3靶基因的表达抑制人结肠癌细胞的增殖,促进凋亡,为以Stat3为靶点的结肠癌基因治疗提供了实验基础.     

奥曲肽对人结肠癌细胞生长增殖抑制作用的研究

目的研究不同浓度的生长抑素类似物奥曲肽对人结肠癌SW480细胞生长增殖的抑制作用。方法体外培养人结肠癌SW480细胞,MTT比色法测定不同浓度奥曲肽抑制SW480细胞增殖作用,以效价强度最高者为最佳抑制浓度;平皿集落形成法测定奥曲肽抑制体外培养SW480细胞的锚定依赖性生长作用。结果不同浓度奥曲肽对SW480细胞增殖活性具有不同程度的抑制作用,在1×10^-10～1×10^-8mol/L浓度范围内呈剂量依赖性,其中1×10^-8mol/L为最佳抑制浓度;奥曲肽对SW480细胞锚定依赖性生长具有明显的抑制作用,并呈浓度依赖性。结论奥曲肽能抑制体外培养的人结肠癌SW480细胞生长增殖,并在一定范围内呈浓度与时间依赖性。