腹腔镜微囊化猪胰岛小网膜腔内异种移植的临床研究

目的 探讨腹腔镜技术应用于海藻酸钠－聚赖氨酸－海藻酸钠（APA）微囊包裹猪胰岛小网膜腔内异种移植术的可行性。方法 采用腹腔镜技术对5例6人次I型糖尿病病人进行了APA微囊新生猪胰岛小网膜腔内异种移植治疗，观察病人移植前后空腹血糖，C肽和胰岛素用量变化。结果 全部病例均未出现手术并发症。术后受体C肽较术前升高3－23倍，胰岛素用量明显减少，其中1例完全停用胰岛素，成为胰岛素不依赖者达31个月。结论 腹腔镜技术用于临床微囊化新生猪胰岛小网膜腔移植术治疗I型糖尿病安全可行，有较高的临床应用价值。     

腹腔镜微囊化猪胰岛小网膜腔内异种移植的临床研究

近年来 ,以腹腔镜为代表的内镜技术因其微创、直观、安全等长处而得到迅速发展 ,应用领域不断扩大。我们在前期海藻酸钠 聚赖氨酸 海藻酸钠 (ＡＰＡ)微囊猪胰岛体外研究及动物实验取得良好效果的基础上[1,2 ] ,结合腹腔镜微创技术 ,进行ＡＰＡ微囊新生猪胰岛小网膜腔异种移植治疗Ｉ型糖尿病患者 5例 6人次 ,报告如下。一、资料与方法1.患者一般资料 :按ＷＨＯ诊断标准确诊的Ｉ型糖尿病患者 5例 6人次 ,男 3例 ,女 2例 ;年龄 15～ 44岁。病程 2～12年。均有糖尿病酮症酸中毒病史。胰岛素用量为 46～6 6Ｕ/ｄ。2 .ＡＰＡ微囊化新生猪胰岛制备…     

微囊包膜猪胰岛异种移植的实验与临床研究

目的 探讨微囊化新生猪胰岛作为临床异种胰岛移植供体来源治疗Ⅰ型糖尿病的可能性。方法 利用微囊技术包膜新生猪胰岛细胞后体外培养，比较微囊化及未微囊化新生猪胰岛细胞的胰岛素分泌能力和胰岛素刺激释放试验。采用腹腔镜技术，对３例Ⅰ型糖尿病患者进行微囊新生猪胰岛异种移植治疗，观察移植前后空腹血糖、Ｃ肽和胰岛素用量的变化。结果 微囊与未微囊化新生猪胰岛在体外培养中各项检测指标差异无显著意义，两者均具有良好的生物活性。临床移植术后，２例受体的Ｃ肽峰值较移植前分别升高１１及２３倍，其中１例胰岛素用量减少６３％，１例完全停用胰岛素，成为胰岛素不依赖者。此２例的移植胰岛在受体内保持有功能存活已达８０ｄ。结论 海藻酸钠－聚赖氨酸－海藻酸钠微囊化新生猪胰岛生物活性良好，能在人体内功能存活并产生疗效，将可能是临床上异种胰岛移植的一个较好     

微囊化新生猪胰岛样细胞团异种移植

本实验研究新生猪与大鼠产的异种移植。结果显示，新生猪胰岛样细胞团可纠正糖尿病大鼠的高血糖状态；海灌酸钠－多聚赖氨酸微囊能有效保护移植物的存活，平均存活时间为４个月。而微囊作为一种新型防排斥手段，将应用于广泛的领域。     

猪胰岛在糖尿病大鼠不同部位异种移植的实验研究

研究了猪胰岛在糖尿病大鼠脑室，胸腺，肾包膜下，门静脉等具有“免疫学特穗”的部位异种移植的效果。结果显示，在不使用免疫抑制剂的情况下，猪胰岛在这四个部位均能纠正大鼠的高血糖状态，并能维持正常血糖一段时间，其中脑组的移植物平均功能存活时间较胸腺组，肾包膜下组，门静脉组明显延长。     

微囊化胰岛细胞异种移植治疗小鼠糖尿病

我们进行空囊移植及胰岛、微囊化胰岛的异种移植 ,以期寻找影响胰岛存活的原因 ,现将结果报道如下。一、材料和方法1 .糖尿病小鼠的制备 :链脲菌素溶于枸橼酸钠溶液中 ( ｐＨ4.5)制成浓度1 0 ｇ/Ｌ溶液 ,2 2 0ｍｇ/ｋｇ体重小鼠腹腔注入。非空腹血糖连续 2次超过 3.5ｇ/Ｌ则定为已患糖尿病。剪尾以便携式血糖仪测定尾静脉血糖。2 .胰岛细胞的分离和纯化 :胰岛细胞的分离见文献 [1 ]。胰岛细胞纯化 :Ｆｉｃｏｌｌ离心。消化沉淀物和 2 5%Ｆｉｃｏｌｌ溶液混匀 ,其上依次加入 2 3.0 %、2 0 .5%、1 1 .0 %Ｆｉｃｏｌｌ各 2ｍｌ,80 0 ｇ离心 1 5…     

微囊化猪胰岛的免疫原性研究

目的 经过体外实验,明确微囊化新生猪胰岛样细胞团（ＩＣＣ）的免疫原性。方法 通过胰岛－淋巴细胞混合培养（ＭＬＩＣ）后的淋巴细胞转化试验。以游离的新生猪ＩＣＣ和空微囊为对照,比较微囊ＩＣＣ组与对照组的淋巴细胞转化值。结果 微囊ＩＣＣ组淋巴细胞转化值显著低于游离ＩＣＣ组（Ｐ〈０．０５）,但明显高于空囊组（Ｐ〈０．０５）。结论 微囊包裹后的新生猪ＩＣＣ的免疫原性比游离的新生猪ＩＣＣ的免疫原性显著降低。提     

人预存天然抗体与猪胰腺细胞的异种反应性研究

目的 分析人预存天然抗体与猪各种胰腺细胞的异种反应性及其同种型。方法 将患者和正常人血清预先加热灭活并按1：2、1：4、1：8、1：16、1：32倍比稀释,分别同猪胰腺冰冻切片于37℃下孵育30min,冲洗后组织进一步用免疫荧光标记的羊抗人IgG和IgG抗体于37℃下孵育30min。采用间接免疫荧光染色法检测人预存天然抗体与猪胰腺细胞的反应性。结果 55．6％的患者和55．0％的正常人体内均存在着抗猪内分泌细胞的天然抗体,但患者血清中强阳性的百分率更高。100％的患者和95．0％的对照血清都可同一种或多种胰腺细胞反应。预存天然抗体的同种型包括IgG和IgM两种。结论 鉴于预存抗体同猪胰腺细胞的强阳性反应,移植前行配型试验和移植物预处理对移植的胰岛素细胞的存活是必要的。     

微囊化新生猪胰岛异种移植治疗糖尿病大鼠的实验研究

目的 观察微囊化新生猪胰岛异种移植对糖尿病大鼠的治疗效果及其对糖尿病并发症的预防作用。方法 糖尿病大鼠随机分为3组：①海藻酸钠-聚赖氨酸-海藻酸钠(APA)微囊包膜胰岛移植组；②未微囊包膜胰岛移植组，两组均接受胰岛腹腔移植；③未移植组。定期监测移植后血糖，白内障发生情况。并进行肾脏组织病理学检查，比较各组结果。结果 微囊化胰岛移植逆转了糖尿病大鼠的高血糖状态，最长达235天，明显长于未微囊胰岛移植组。有效的早期微囊胰岛移植的大鼠未出现糖尿病性白内障及肾小球基底膜改变，而未移植组及未微囊化胰岛移植组大鼠2～3个月后均出现白内障及肾小球基底膜改变。结论 APA微囊能有效保护移植物的体内存活，微囊化新生猪胰岛移植对大鼠糖尿病及其并发症有较好的治疗及顶防作用。     

猪胰岛异种移植的研究进展

糖尿病是严重威胁人类健康的疾病,而胰岛移植可以通过调节内源性胰岛素的分泌,治疗1型糖尿病。由于人源胰腺供体不足,无法满足大批量胰岛细胞移植需求。猪胰岛素与人胰岛素仅差1个氨基酸,在糖尿病患者身上使用已有较长历史,而且猪可以进行基因修饰,减少移植后免疫排斥反应,因此目前猪胰岛作为异种胰岛移植来源进入临床试验阶段。本文将就猪-非人灵长类移植的发展史,猪胰岛异种移植中存在的问题、解决方案和研究进展,及猪胰岛异种移植前景和展望做一综述。     

新生猪胰岛细胞的HLA-G1基因转染

目的探讨HLA-G1基因转染新生猪胰岛细胞的可行性,检测其表达和功能状况。方法体外分离纯化新生猪胰岛细胞,脂质体载体转染HLA-G1基因。免疫荧光法检测HLA-G1基因在胰岛细胞上的表达状况;51Cr释放实验分析其对人NK细胞细胞毒的抑制作用。结果新生猪胰岛细胞HLA-G1基因表达率大约为50%,体外转染24-48 h达高峰;混合淋巴细胞培养(胰岛细胞 NK细胞)后,空质粒转染组的胰岛细胞溶解率为71.57%,而转染组胰岛细胞溶解率为53.5%。结论利用脂质体Genejammer转染体外培养的新生猪胰岛细胞,可以获得靶基因的瞬时高效表达; HLA-G1基因转染可以有效抑制NK细胞对异种胰岛的细胞毒作用。     

胰岛FasL基因转染对大鼠胰岛移植的影响

目的 探究胰岛细胞FasL基因转染对同种大鼠胰岛移植的影响。方法 通过磷酸钙沉淀法构建含目的基因FasL的重组腺病毒AdV-FasL,感染胰岛细胞后移植于糖尿病受者大鼠,通过RT-PCR和免疫组织化学检测移植物FasL表达,观察移植物存活情况及基因转染胰岛细胞凋亡情况。结果 单纯移植胰岛组平均存活期为（6.3±0.56）d,FasL基因转染组并未出现排斥延迟,反而排斥加速,存活期缩短至（3.4±0.24）d。FasL转染的胰岛细胞在移植后24h见FasL表达,在 48 h表达增强,AdV-5感染组及未转染组未见FasL表达。TUNEL标记见移植后FasL转染胰岛细胞凋亡。结论 尽管表达FasL的睾丸细胞与胰岛共移植可诱导活化的淋巴细胞凋亡,使胰岛移植物获得免疫豁免、存活期延长,但通过FasL基因转染使胰岛细胞直接表达FasL,引起胰岛细胞凋亡和粒细胞浸润,导致排斥加速。     

成人胰腺干细胞转分化为胰岛的研究

目的：通过对成人胰腺干细胞转分化为胰岛过程的研究以便更深入了解及改进胰腺干细胞分离、培养、鉴定方法。方法：成人胰腺组织经胶原酶消化后,用密度梯度离心法将胰腺外分泌细胞、导管上皮细胞和胰岛分离、纯化,导管上皮细胞即具有转分化潜能的干细胞,在体外先后以CMRL1066和无血清DMEM／F12培养液共培养27d,在培养的不同时间点取样本于光镜和电镜下观察细胞形态学变化及干细胞特异性转录基因PDX－1,CK－19蛋白等单抗的免疫组化染色,并测定培养液中的淀粉酶和胰岛素含量。结果：上述方法可获得大量以往在胰岛分离时丢弃的胰腺导管上皮细胞。经体外一定条件的培养后,第1天即可见PDX－1,CK－19阳性细胞,胰腺导管上皮细胞迅速分裂增殖并转变为有分化能力的干细胞继而转分化为三维结构的胰岛细胞。培养27d后,平均每克胰腺组织可生成760个胰岛。结论：成人胰腺的导管上皮具有干细胞潜能并可在体外转分化为大量具有内分泌功能的胰岛,用此方法获得大量的胰岛可能为克服胰岛移植的供体短缺提供一条新的途径。     

成人胰岛大容量分离技术的改进及胰岛功能检测

目的 通过对人胰岛分离技术的改进以获得大量高活力胰岛并检测其功能,为利用同种异体胰岛移植治疗1型和部分2型糖尿病提供理论依据和技术基础。方法 采用改良的自动分离技术连续分离28例人胰岛,然后用连续性密度样度离心法纯化胰岛。胰岛收获量以国际标准的胰岛当量(islet equivalent,IEQ)表示。胰岛功能的测定分别为体外测定胰岛的胰岛素／DNA比率;静止葡萄糖刺激试验(SGS)及将胰岛移植至糖尿病裸小鼠的体内胰岛功能鉴定并随后进行腹腔糖耐量试验,连续测定移植鼠血糖水平及其体内C肽浓度。结果 28例成人胰腺分离的胰岛收获量为5000～1030000IEQ／胰腺,平均为291635IEQ／胰腺,前13例平均每个胰腺收获49123IEQ,平均每克组织收获846IEQ。平均纯度为87％,随着技术的改进后15例的分离结果则分别为：平均每个胰腺501813IEQ,平均每克组织7003IEQ,平均纯度89％。体外胰岛素刺激试验结果表明分离纯化后的人胰岛有正常功能,将12次分离得到的胰岛分别移植至34只糖尿病裸鼠肾包膜下,其中29只糖尿病裸鼠于12h内血糖恢复正常且糖耐量试验接近正常鼠,血中C肽水平亦接近正常鼠。结论 采用改进的人胰岛分离方法,可以获得大量高活力的具有正常功能的胰岛,为同种异体胰岛移植用于临床奠定了必要的实验基础。     

糖尿病小鼠胰腺干细胞转分化为胰岛样细胞

目的 观察链脲佐菌素所致糖尿病小鼠胰腺干细胞是否能转分化为胰岛样细胞.方法 以链脲佐菌素建立糖尿病小鼠模型,分离培养其胰腺导管上皮细胞,经体外扩增及诱导培养后,以细胞免疫化学方法检测PDX1表达,行STZ染色和葡萄糖刺激的胰岛素释放试验鉴定其功能.结果 糖尿病小鼠胰腺干细胞经体外培养和诱导分化后,PDX1阳性,并形成胰岛样细胞团;胰岛样细胞对高糖刺激(15.0 mmol/L)的胰岛素释放较低糖(5.6 mmol/L)时增加了1.4倍(37.2±11.2比25.9±7.6,t =2.830,P＜0.05),DTZ染色阳性.结论 链脲佐菌素所致糖尿病小鼠胰腺干细胞在体外培养条件下可转分化为胰岛素分泌细胞.     

微囊化人胎胰岛功能的体外观察

目的 :观察微囊的通透性及对微囊化胰岛分泌功能的影响。方法 :将用胶原酶消化获得的胰岛细胞分为 2份 ,1份微囊包膜 ,1份未予包膜作为对照 ,培养 7天 ,比较两组培养液中胰岛素含量并分别用2 .7mmol·L-1、16 .6mmol·L-1浓度的葡萄糖及 16 .6mmol·L-1的葡萄糖加 10mmol·L-1茶碱刺激胰岛B细胞 ,观察其胰岛素分泌功能。结果 :两组在培养液中胰岛素含量及葡萄糖、茶碱刺激的胰岛B细胞胰岛素分泌方面无显著性差异 (P >0 .0 5 )。结论 :该微囊具有良好的通透性 ,微囊化胰岛的活性和分泌功能未受成囊过程的影响     

未成熟树突状细胞诱导协调性异种胰岛移植耐受的研究

目的　研究未成熟树突状细胞 (DC)在协调性异种胰岛移植中的免疫耐受诱导作用。方法　分别应用 2 0 μg/L粒细胞集落刺激因子 (GM CSF)和 5 0 0 μg/LGM CSF 2 0 0 μg/L白细胞介素4 (IL 4) ,从BALB/c受鼠骨髓培养未成熟DC及成熟DC ,然后负载Wistar大鼠的主要组织相容性复合物 (MHC)抗原。将两种DC回输至糖尿病小鼠体内 ,7d后分别将Wistar大鼠和SD大鼠胰岛移植于糖尿病小鼠左肾包膜下 ,监测移植物存活情况 ,检测T细胞增殖反应 ,并进行病理切片检查。结果　负载MHC抗原成熟DC预处理的BALB/c小鼠体内胰岛迅速被排斥 ,负载MHC抗原未成熟DC预处理的BALB/c小鼠胰岛存活时间明显延长 (P <0 .0 1 ) ,但以SD大鼠作为供者的胰岛移植物迅速被排斥。耐受鼠的脾细胞对Wistar大鼠脾细胞的增殖反应微弱 ,而排斥鼠脾细胞则出现明显增殖反应。结论　未成熟DC预处理受者可诱导T细胞无能 ,并有效延长异种胰岛移植后的存活时间。     

采用改良的胰腺三管插管法分离成人胰岛的实验研究

目的 探讨胰腺插管方式对成人胰岛分离及纯化的影响.方法 共对17例成人胰腺进行了胰岛的分离和纯化.采用改进的腹部器官联合快速切取技术获取胰腺,分别采用标准法(3例)、单管法(11例)和三管法(3例)对胰腺进行灌注.标准法是将胰腺从胰颈处完全切断,沿主胰管分别向胰头和胰尾插管,主胰管人十二指肠处予以结扎.单管法为采用加长插管自主胰管插入,直至胰尾.三管法是在胰颈背侧切开胰腺至主胰管,经主胰管分别向胰头和胰尾方向插管,在主胰管进入十二指肠处插第3根插管.采用胶原酶LibarseHI消化,Ficoll连续密度梯度离心法纯化.双硫腙染色,鉴定胰岛的纯度,并计算胰岛当量(IEQ).丫啶橙/溴乙啶荧光染色,计数活细胞百分率.体外葡萄糖刺激试验鉴定胰岛功能.结果 标准法的灌注量平均为0.71 ml/g胰腺,单管法的灌注量平均为0.96 ml/g胰腺,三管法的灌注量平均为1.24 ml/g胰腺,明显多于前两种方法(P＜0.05).标准法的胰岛收获量平均为1914 IEQ/g胰腺,单管法为2270 IEQ/g胰腺,三管法为2514 IEQ/g胰腺,单管法和三管法明显高于标准法(P＜0.05);其胰岛纯度/活性分别为74 ％/79.3％、75.6 ％/79.4％和78.3 ％/84.0％,三者间的差异无统计学意义.标准法所获得的胰岛胰岛素释放指数平均为3.46,单管法为4.74,三管法为5.27,单管法和三管法明显高于标准法(P＜0.05).结论不同的插管灌注方式对成人的胰岛分离有一定影响,三管法有利于提高胰腺灌注量,增加胰岛的收获量.