大鼠全长OBRb cDNA克隆及真核表达重组体的构建

目的克隆SD大鼠全长长胞内段瘦素受体基因cDNA(OBRb cDNA)及构建其真核表达重组体,为进一步研究该基因打下基础.方法应用RT-PCR方法分段扩增全长OBRb cDNA,再将它们连接起来,并获得载有全长OBRb cDNA的阳性克隆质粒.将上述质粒中全长OBRb cDNA定向插入真核表达质粒pcDNA3中,筛选出阳性克隆.通过限制性内切酶酶切和核苷酸序列测定进行鉴定.结果重组的克隆质粒和真核表达质粒经限制性内切酶酶切后获得的片段大小均与理论值一致.结论成功地克隆了SD大鼠全长OBRb cDNA,并构建了真核表达重组体.     

瘦素、瘦素受体及其信号转导

多年来,肥胖症的分子发病机制一直不清楚,直到1994年瘦素(leptin)ob基因和1995年瘦素受体(OB-R)基因的成功克隆,才使肥胖症分子发病机制的研究进入了新的时代.现介绍ob基因、瘦素受体及其信号转导的研究情况.     

西藏小型猪Leptin及其受体胞外区片段的克隆及原核表达

目的 克隆及原核表达西藏小型猪瘦素(Leptin)成熟肽及瘦素受体胞外区片段.方法 根据西藏小型猪瘦素序列(GenBank号:GQ240885.1)和猪瘦素受体基因胞外域序列(GenBank号:AF167719.1)分别设计并合成两对引物扩增瘦素、瘦素受体基因胞外域编码区1654-2319位片段,以西藏小型猪组织总RNA为模板,经反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法获得了特异性片段.再以该两个特异性片段为模板,另外设计两对带有BanH Ⅰ和HidⅢ酶切位点的套式引物分别扩增瘦素64-504位(成熟肽编码区)和瘦素受体基因胞外域编码区1655-2314位的cDNA片段,将该两片段克隆入pMD<,18>-T载体并转化感受态细菌E.coli DH5α测序并永久保存.此两片段经酶切后克隆到表达载体pRSET A的BamH Ⅰ和HindⅢ两酶切位点之间,构建重组质粒pR-OB和pR-OBR-a并在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中表达,SDS-PAGE电泳鉴定表达产物.结果 在IPTG诱导下促使重组菌pR-OB表达了相对分子质量约18×10<'3>左右的融合蛋白;重组菌pR-OBR-a表达了相对分子质量约27×10<'3>左右的融合蛋白.结论 说明重组质粒pR-OB、pR-OBR-a在大肠杆菌BL21(DE3)中分别可表达西藏小型猪瘦素成熟肽、瘦素受体片段蛋白,为进一步研究瘦素、瘦素受体功能和应用提供了基础.     

瘦素及其受体与消化系统关系的研究进展

美国学者于1994年首先克隆出小鼠和人的肥胖基因产物-瘦素(leptin).瘦素是肥胖基因(obese gene,ob基因)的蛋白产物,主要在脂肪组织中表达,它被认为是一种饱食信号,主要是调节能量平衡和控制体重.Monteleone等[1]和Waelput等[2]发现,瘦素具有广泛的生物学效应:一是通过与下丘脑的瘦素受体结合,影响神经肽Y等多种神经内分泌激素的分泌,从而降低食欲,减轻体重;二是作用于其它组织的瘦素受体.瘦素受体存在于动物的许多组织中,OBRmRNA可在脑、心、胎盘、肝脏等多处表达.它是一个跨膜分子,包括细胞外结构、跨膜结构和细胞内结构域.有长型(ob-Rb)和短型(ob-Ra,ob-Rc,ob-Rd,ob-Re)两种亚型,其中ob-Rb被认为是起主要作用的受体.瘦素对消化、心血管、生殖、免役、骨骼、神经和其它内分泌系统等都有一定的作用.现就瘦素及其受体功能对消化系统的影响作一陈述.     

含短胞内段的SD大鼠全长瘦素受体的cDNA克隆

肥胖是现代社会的常见病 ,是胰岛素抵抗综合症的组成部分 ,它的分子发病机制多年来一直不清楚 ,1994年瘦素基因 (ＯＢ基因 )和 1995年瘦素受体基因 (ＯＢＲ基因 )的克隆成功[1,2 ] ,使肥胖症的分子发病机制研究进入了新的时代。目前已知瘦素是由脂肪细胞分泌 ,具有降低食欲、增     

人瘦素基因克隆与序列测定

【目的】构建人瘦素基因cDNA克隆 ,并进行序列分析。【方法】用逆转录聚合酶链反应扩增人瘦素基因cDNA ,获得片段 (6 40bp)连接至 pUC19载体 ,并转化大肠杆菌DH5α。以末端终止法进行序列测定。【结果】所克隆的人瘦素cDNA含全长的人瘦素基因编码区 ,仅 2 87位的腺苷酸被鸟苷酸代替 ,导致 96位编码谷氨酰胺的密码子CAA改变为编码精氨酸的CGA ,其意义尚待阐明。【结论】以逆转录聚合酶链反应方法成功地构建了人瘦素基因cDNA克隆。     

瘦素受体长胞内段mRNA表达增加对骨骼肌细胞葡萄糖氧化的影响

目的：研究原代骨骼肌细胞中瘦素受体长胞内段mRNA表达增加对葡萄糖氧化的影响。方法：RT－RCR扩增瘦素受体长胞内段cDNA，将扩增产物插入真核表达质粒，构建重组体，重组表达质粒经脂质体介导转染原代骨骼肌细胞，转染后48h加瘦素和D-[U-^14C]葡萄糖，收集^14CO2,液体闪烁检测其放射性。另经RT－PCR半定量方法检测瘦素受体长胞内段mRNA在骨骼肌细胞的表达。结果：扩增的瘦素受体长胞内段cDNA及其重组体在限制性内切酶酶切后所得各片段大小均与理论值一致。在重组表达质粒转染组，空带积分光密度比值较后两者升高（均P＜0．05）；但3组细胞间葡萄糖氧化差异无显著性。结论：成功构建含有瘦素受体长胞内段cDNA的重组真核表达质粒。单纯增加瘦素受体长胞内段mRNA表达不能改善瘦素对骨骼肌细胞的葡萄糖氧化作用。     

Leptin对瞬时转染OBRb基因的C2C12细胞系PI3K活性的影响

目的:观察瘦素(leptin)对C2C12肌小管及瞬时转染OBRb基因的C2C12肌小管PI3K活性变化的影响,探讨leptin对外周组织直接作用的可能通路及其受体调控机制。方法:用脂质体介导基因转染;用马血清诱导C2C12成肌细胞分化为肌小管;OBRb mRNA表达用RT—PCR检测;leptin受体蛋白表达用Western印迹法检测;用抗JAK-2多克隆抗体免疫沉淀相关蛋白,以L-磷脂酸肌醇为反应底物,通过对掺入PI3K的32p放射活性磷屏扫描分析,检测PI3K活性变化。结果:非转染C2C12     

瘦素、胰岛素抵抗和糖尿病

目前 ,糖尿病 (ＤＭ)已成为一种发病率高且呈逐年上升趋势的常见病 ,具有遗传异质性 ,是一种多因素、多基因性长期高血糖为主要标志的代谢紊乱综合征。糖尿病病因目前还有待于研究 ,1994年发现瘦素 ,对糖尿病的研究有了重大突破。瘦素、瘦素受体、胰岛素抵抗 (ＩＲ) ,与糖代谢异常及 2型糖尿病有密切关系。1　瘦素 (ｌｅｐｔｉｎ)瘦素于 1994年由Ｚｈａｎｇ等[1] 采用克隆技术 ,成功克隆了小鼠的肥胖基因 (ｏｂ基因 )与人类的同源序列 ,ｏｂ基因的蛋白产物ｌｅｐｔｉｎ ,被称为瘦素。瘦素是一种由 16 7个氨基酸组成的分泌型蛋白质 ,分子量为…     

肥胖基因、瘦素与肥胖

目前关于肥胖发生的分子机制尚未完全阐明 ,但已发现一些肥胖相关基因 ,其中最主要的是 Ob(obese)基因和 Ob受体 (Ob-R)基因 ,为肥胖机制的研究开辟了新的途径。瘦素 (Leptin)是 ob基因的产物 ,源于希腊语 Lep-tos,初意为“瘦的”,中文译为瘦素。 Ob-R基因的产物为leptin受体 ,     

睡眠剥夺对青春期大鼠瘦素水平的影响

目的研究睡眠剥夺对青春期大鼠瘦素水平的影响。方法健康Wister大白鼠共40只。4~5周龄。体重(102.09±8.99)g。实验组20只,雄性、雌性各10只;对照组20只,雄性、雌性各10只。采用改良多平台睡眠剥夺法建立模型,应用放射免疫法检测各组大鼠血清瘦素,所有数据均用-x±s表示,两组间差异比较采用t检验。结果72 h睡眠剥夺后,实验组大鼠血清瘦素为(0.68±0.47)pg/mL,对照组为(1.05±0.59)pg/mL,t=2.18,P<0.05,差异有统计学意义。结论睡眠剥夺使青春期大鼠瘦素水平降低,据此可以推测睡眠剥夺可能也会引起处于青春期的中小学生瘦素水平降低,进而影响中小学生青春期的发育及身体其它生理功能。因此,笔者建议,应该充分保证中小学生充足的睡眠,以免引起瘦素分泌减少,影响中小学生身体健康。     

瘦素与高血压心肌肥厚

目的:探讨瘦素和高血压心肌肥厚的关系。方法:阅读国内外有关文献并进行综述。结果:研究表明瘦素和瘦素受体与高血压心肌肥厚的发病机制有密切关系。结论:瘦素和瘦素受体在高血压心肌肥厚的发生发展中起着重要的作用,瘦素受体及其相关的信号通路将可能成为改善心血管疾病患者功能的新药物靶标。     

脓毒症小鼠肝脏功能的改变及Leptin保护作用的研究

目的:研究脓毒症对肝功能及相关酶活性的影响,探讨Leptin在急性炎症反应中的作用.方法:建立小鼠盲肠结扎致脓毒症模型,设立假手术组、脓毒症组、Leptin保护组(腹腔内注射0.1 mg/kg Leptin)和消炎痛(吲哚美辛)保护组(腹腔内注射2 mg/kg 消炎痛).于脓毒症后6 h和12 h,采用放射免疫法测量肝组织匀浆液中Leptin水平,采用96孔分光光度法检测血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)及髓过氧化物酶(MPO)、谷胱甘肽-S转移酶(GST)、黄嘌呤氧化酶(XOD)、超氧化物歧化酶(SOD)等4种与自由基合成、解毒和嘌呤生成代谢相关的酶的水平,同时以H-E染色法观察肝组织病理学改变.结果:与假手术组相比,脓毒症组伤后12 h血清ALT明显上升(P<0.05),6 h时无显著改变.Leptin保护组在12 h时可见ALT显著低于脓毒症组水平(P<0.05),消炎痛保护组在6 h和12 h时有ALT下降,但无显著差异.Leptin保护组和消炎痛保护组肝组织内MPO活性没有显著变化,但GST和SOD活性明显降低(P<0.01,P<0.05),同时XOD活性明显增加(P<0.05).另外,脓毒症组肝内Leptin有下降趋势,Leptin保护组肝内Leptin水平有所恢复,而消炎痛保护组肝内Leptin水平也有所恢复,但在12 h时与脓毒症组有显著差异(P<0.05).结论:Leptin对脓毒症造成的肝功能损害有明显保护效应,其保护作用可能涉及肝细胞代谢过程中氧化-还原反应、氧自由基形成和解毒功能的调节.     

瘦素与儿童肥胖研究进展

瘦素(leptin)是一种主要由脂肪组织产生的蛋白激素,直接作用于下丘脑,参与能量平衡的调节,在机体肥胖的产生过程中起着重要作用.体内存在多种瘦素蛋白受体亚型,其中可溶性的瘦素受体(sOb-R)可调节瘦素水平,具有很高的检测价值.相关研究显示,瘦素很有可能成为判断儿童肥胖风险的标记物,瘦素水平还可被用来评估肥胖儿童对运动干预的应答性.     

检测血清Leptin浓度变化对NASH的临床意义

目的探讨血清瘦素(Leptin)浓度变化对非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的诊断及预后判断的临床应用价值。方法采用放射免疫法检测Leptin。结果NASH组瘦素浓度(13.320±5.323ng/ml)显著高于非酒精性脂肪性肝病(NASFL)组(8.0684±2.320ng/ml,p<0.05)和正常对照(NC)组(3.533±1.686ng/ml,p<0.05),NASFL组瘦素浓度显著高于NC组(p<0.05)。结论当Leptin≥10.35ng/ml时,提示非酒精性脂肪性肝炎的诊断,患者愈后不良。     

MAPKs通路在Leptin促人乳腺癌细胞系增殖中的机制研究

目的:探讨MAPKs信号转导通路在瘦素(Leptin)促人乳腺癌细胞MCF-7增殖中的作用机制。方法:用MTT比色法观察不同浓度瘦素促MCF-7细胞的增殖效应,以及用JNK、ERK特异性抑制剂(SP600125,PD98059)阻断MAPKs信号通路对瘦素促MCF-7细胞增殖效应的影响;Westem blot检测瘦素干预不同时间对p-JNK、JNK、p-ERK、ERK蛋白表达水平的影响;RT-PCR检测在瘦素作用下以及MAPKs信号通路阻断情况下对MCF-7细胞表达瘦素受体(Ob-R)mRNA水平的影响。结果:50 ng/ml瘦素促人乳腺癌细胞MCF-7增殖效应最强,该浓度瘦素可使MAPKs信号通路中的靶蛋白发生磷酸化激活;50 ng/ml瘦素作用于MCF-7细胞30 s后p-ERK蛋白表达即显著增加,3 min后p-JNK蛋白表达亦显著增加;分别用SP600125和PD98059阻断JNK、ERK信号通路可显著抑制瘦素促MCF-7细胞的增殖效应.亦可抑制瘦素作用下MCF-7细胞Ob-R mRNA表达水平的增加。结论:瘦素促人乳腺癌细胞MCF-7增殖效应可能与激活MAPKs信号通路有关,亦调控MCF-7细胞中瘦素受体的表达,在肿瘤细胞周围形成瘦素自分泌环,促进乳腺癌的发生发展。     

瘦素在女性不孕症发病机制中的作用

瘦素 (leptin)是近年发现的Ⅰ型细胞因子 ,参与调节体内的能量平衡、脂肪贮存等生理作用 ,并参与代谢、生殖、造血等功能。瘦素可能在脂肪组织和生殖系统间起关键性的桥梁作用 ,其过多或不足所致不孕均和一系列与营养状态相关的疾病有关 ,其在下丘脑 垂体 卵巢轴 (HPG)及其他各个层面参与了女性不孕症的发病机制     

女性单纯性肥胖患者血浆瘦素与相关内分泌激素的变化及意义

目的 探讨女性单纯性肥胖患者血浆瘦素水平、与肥胖相关内分泌激素的变化以及对肥胖的影响。方法 肥胖前期者48例，肥胖者40例，对照组42例。用放射免疫法测定血浆瘦素、胰岛素、皮质醇和醛固酮。结果 肥胖前期组和肥胖组血浆瘦素、胰岛素、皮质醇、醛固酮水平分别明显高于对照组（P＜0.01），各变量值之间呈密切相关，与体重指数（BMI）呈直线相关，随BMI升高而升高。结论 随着BMI升谪，机体对瘦素抵抗，使患者血浆瘦素水平明显升高，并出现高胰岛素血症；瘦素长期持续高水平，通过下丘脑瘦素受体提高了下丘脑－垂体－肾上腺轴（HPA）的敏感性，使皮质醇、醛固酮水平明显高于正常，可能是肥胖患者发生糖尿病、高血压、肾病的原因之一。     

瘦素的表达分布及对脓毒症后内环境紊乱恢复的作用

目的研究瘦素(Leptin)的表达分布,以及脓毒症对其蛋白和mRNA水平的影响。方法采集正常大鼠下丘脑、肺、肝、脾、胃、十二指肠、肾、附睾脂肪垫、睾丸等重要脏器标本,以RT-PCR法检测Leptin mRNA表达的组织分布。建立大鼠盲肠结扎穿孔(CLP)致脓毒症模型,设立假手术、CLP模型和CLP 脂肪乳、CLP 雌二醇、CLP 胰岛素组等干预能量代谢和神经-内分泌功能的实验组,采用放射免疫分析法检测损伤后12h各组血清Leptin浓度,并采用RT-PCR法检测损伤后下丘脑、脂肪及肺内Leptin mRNA表达的变化。结果正常大鼠上述9种重要脏器内均有Leptin mRNA表达。与损伤后假手术组血清Leptin相比,其他4组与之差异无统计学意义。与损伤后假手术组脏器组织Leptin mRNA表达水平相比,CLP模型组在下丘脑、脂肪和肺内的表达水平显著降低,其他3组则有不同程度的变化。脂肪乳对Leptin mRNA表达的影响具有中枢诱导而外周抑制的双向模式。结论Leptin广泛表达于机体多种重要脏器,它可能作为一种保护因子促进脓毒症后内环境紊乱的恢复。     

瘦素对早孕绒毛滋养细胞分泌CXCR4及MMP9的影响

目的 研究瘦素对早孕绒毛滋养细胞分泌趋化因子受体4(CXCR4)及金属基质蛋白酶-9 (MMP9) 的调节作用.方法 分离、培养早孕期绒毛滋养细胞,添加不同浓度的瘦素,培养24h后,RT-PCR法检测滋养细胞中CXCR4及MMP9 mRNA表达水平.结果 添加了瘦素的滋养细胞表达CXCR4及MMP9 mRNA的量较空白对照组极显著增加(P＜0.01).结论 瘦素能增强滋养细胞分泌CXCR4及MMP9的能力.瘦素可能在孕早期参与了胎盘形成等病理生理过程.