RT—PCR法与血凝抑制法鉴定流感病毒的比较

目的比较逆转录聚合酶链反应法(RT—PCR)与血凝抑制法在流感病毒鉴定中的优劣，以期建立能快速、特异地从临床标本中检测并鉴定流感病毒的新方法。方法用常规细胞培养法增殖病毒后，分别用RT—PCR反应法和常规血凝抑制法进行流感病毒鉴定。结果在13份发生细胞病理变化的标本中RT—PCR阳性标本为9份，其中甲型7份(6份甲3亚型、1份甲1亚型)，乙型2份；而用血凝抑制法鉴定阳性标本仅6份。结论RT—PCR法快速、特异、灵敏，在流感病毒鉴定中具有较大的应用价值。     

标本的处理对PCR检测结核杆菌结果的影响

目的 :应用核酸纯化法处理结核标本在 PCR中的价值。方法 :从 12例诊断为活动性肾结核的病人处 ,收集尿液标本 ,分别用核酸纯化法与常规法处理尿液标本。两种处理方法用定量 PCR与定性 PCR各重复做 3次扩增 ,分析其结果。结果 :用核酸纯化法处理的标本 ,定量 PCR检出率为 91.6 7% (11/12 ) CV(0 .3413) ,定性 PCR检出率为 83.33% (10 /12 )。用常规法处理的标本 ,定量 PCR检出率为 75 % (9/12 ) CV(0 .74 38) ,定性 PCR检出率为 5 0 %(6 /12 )。经配对 χ2检验核酸纯化法与常规法对结核杆菌 PCR检出率差异有显著性 P<0 .0 5。结论 :在结核标本的前处理时 ,必须要进行核酸纯化 ,减少标本中的抑制物 ,可提高结核杆菌 PCR的检出率 ,对结核病的诊断治疗起着非常重要的作用     

标本的处理对PCR检测结核杆菌结果的影响

目的:应用核酸纯化法处理结核标本在PCR中的价值.方法:从12例诊断为活动性肾结核的病人处,收集尿液标本,分别用核酸纯化法与常规法处理尿液标本.两种处理方法用定量PCR与定性PCR各重复做3次扩增,分析其结果.结果:用核酸纯化法处理的标本,定量PCR检出率为91.67 %(11/12)CV(0.3413),定性PCR检出率为83.33 %(10/12).用常规法处理的标本,定量PCR检出率为75 %(9/12)CV(0.7438),定性PCR检出率为50 %(6/12).经配对χ2检验核酸纯化法与常规法对结核杆菌PCR检出率差异有显著性P<0.05.结论:在结核标本的前处理时,必须要进行核酸纯化,减少标本中的抑制物,可提高结核杆菌PCR的检出率,对结核病的诊断治疗起着非常重要的作用.     

青岛地区人疱疹病毒6型毒株的分离与初步鉴定

①目的分离培养人疱疹病毒6型(HHV-6)青岛地方株并进行初步鉴定。②方法取20例青岛地区健康献血员唾液标本，接种至预激活的脐带血单个核细胞(CBMC)中进行病毒分离培养。出现典型细胞病变(CPE)的标本采用电镜观察，并提取病毒DNA，应用聚合酶链反应(PCR)扩增HHV-6基因组保守区特异性片段，然后应用限制性核酸内切酶技术进一步鉴定。③结果唾液分离培养得到1例具有典型CPE的标本，电镜观察显示细胞内存在具有疱疹病毒特征的病毒颗粒，酶切产物电泳结果显示66bp和97bp两条带，初步鉴定为HHV-6B毒株。④结论成功分离培养得到1例HHV-6青岛地方株，为进一步研究青岛地区HHV-6的流行及致病性奠定了实验基础。     

性病高危人群中女性阴道口部位沙眼衣原体感染的检测

目的 :研究能否用阴道口部位标本代替宫颈标本检测沙眼衣原体 (CT)。方法 :分别用 PCR法和立明法 (Clearview)对 2 31例性病高危人群的宫颈拭子、阴道口拭子及尿液标本进行检测。结果 :以6种检测方法中任何 2种结果同时阳性为金标准 ,宫颈拭子、阴道口拭子及尿液 3种标本 PCR法的敏感性和特异性分别是 86 .8%和 99.4 8% ,84 .2 %和 10 0 % ,6 3.2 %和 99.4 8% ;立明法的敏感性和特异性分别是 81.6 %和 10 0 % ,4 7.4 %和 10 0 % ,10 .5 %和 10 0 %。结论 :对女性 CT检测可以用阴道口拭子代替其它部位标本进行 PCR检测     

贵州自然界白纹伊蚊体内登划病毒带毒情况

目的 :利用细胞、分子生物学技术对贵州省自然界白纹伊蚊体内带登革病毒 (DEN)情况进行调查。方法 :采集贵州省9个地 (州 )市共计 18个县 (区 )白纹伊蚊幼虫标本 ,饲养为成蚊 ;制备蚊悬液 ,碘化钠法提取RNA ,用登革病毒NS1基因区通用引物经逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)检测DEN核酸 ,限制性内切酶酶切鉴定阳性PCR产物并分型 ;蚊悬液接种C6 /36细胞进行病毒分离 ,制作细胞片 ,间接免疫荧光法检测DEN抗原。结果 :从独山县麻尾镇白纹伊蚊标本中分离到 1株DEN 2型病毒 ,从凯里、黄果树和镇远 3处地方株白纹伊蚊体内检测出DEN核酸 ,用抗DEN 4型单克隆抗体经间接免疫荧光(IFA)和RT PCR产物酶切分型鉴定分别为登革病毒 2型、4型。结论 :贵州省存在DEN感染的自然循环     

2009年重庆地区手足口病病毒分离鉴定

目的:对2009年2～4月重庆地区流行的手足口病(Hand-food-and-mouth disease,HFMD)病原进行分离鉴定,以调查本地区HFMD流行病原学情况.方法:采集47例手足口患儿脑脊液、疱疹液、粪便、咽拭子、肛拭子共100份标本,分别接种于人横纹肌肉瘤细胞(Human rhabdomyosarcoma,RD)中进行病毒分离培养,对出现细胞病变(Cytopathic effect,CPE)的细胞上清,分别用肠道病毒通用引物、EV71属特异性引物和柯萨奇A16属特异性引物进行RT-PCR检测,并对PCR产物进行回收克隆测序鉴定,以确定本次疫情中肠道病毒(Enteroviruses,EV)的病原,将测序结果用生物学软件Bioedit同国际代表BrCr株进行序列比对及同源性相关分析,以鉴定此毒株遗传变异情况.结果:在处理后的100份HFMD患儿临床标本的细胞培养中,有7份观察到明显的细胞病变,通过RT-PCR检测有7份呈肠道通用引物阳性,EV71特异性引物检测有3份呈阳性结果,而CAl6特异性引物检测结果均为阴性,这3份EV71阳性临床标本来自2例门诊患儿和1例临床诊断疑似病例患儿,其PCR产物测序结果也证实为EV71病毒.结论:重庆地区2～4月发生的HFMD疫情主要是由EV71型引起的.     

UP-PCR结合RFLP对脑脊液标本中病原菌的检测

①目的　建立通用引物聚合酶链反应 (UP PCR)结合限制性酶切片段长度多态性 (RFLP)酶切图谱分析快速检测脑脊液标本中常见病原菌的方法。②方法　通过对体液标本中常见病原菌 16SrRNA基因保守区的序列分析 ,设计通用引物 ,对不同细菌的DNA进行UP PCP扩增 ,确定标本是否有细菌感染 ,然后对阳性标本的扩增产物分别用不同的限制性内切酶酶切 ,进行RFLP分析 ,进一步鉴定细菌。并与常规细菌培养鉴定法进行比较。③结果　UP PCR结合RFLP法最低可检测出 8cfu·mL-1大肠埃希菌和 2 5 0cfu·mL-1金黄色葡萄球菌 ;该法对10 2份脑脊液标本的检测中 ,其灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值分别为 92 .3%、96 .6 %、80 .0 %和 98.0 % ,较培养法好。④结论　该方法可以准确、快速地检测出脑脊液标本中感染的病原菌。     

流行性出血热病毒Vero-E6细胞病变株的分离和鉴定

从EHF患者血清中分离到8株EHF病毒,在E 6细胞中传代适应过程中,发现有5株EHF病毒分别在第4～10代出现规律的细胞病变(CPE),对其中两个CPE株(HFN-04和-19)进行了一系列特异性鉴定试验。实验结果表明:(1)病毒的CPE发展与病毒增殖动态完全一致;(2)CPE株的主要生物学和理化性状均符合EHF病毒;(3)用CPE株病毒感染细胞抗原片检测EHF患者双份血清,其恢复期血清抗体均呈4倍以上增高反应;(4)病毒的CPE可被患者血清及EHF、KHF免疫血清所中和,不能被正常兔血清和Reo病毒1—3型多价血清所中和;(5)CPE株病毒感染的E_6细胞几乎能完全吸收EHF患者血清及EHF、KHF抗血清中的特异性抗体;(6)CPE株病毒感染鼠脑悬液与EHF病毒A9株McAb25-1致敏血球呈阳性血凝反应。据此,首次证实了EHF病毒至少有部分毒株能引起E_6细胞规律性CPE。EHF病毒CPE株的发现为EHF的诊断和防治工作提供了有利条件。     

实时荧光定量PCR法在急性呼吸道传染病病原筛查中的应用

目的利用实时荧光定量PCR法筛查和鉴定某战区发热伴呼吸道症状病例的呼吸道病毒感染情况,为部队呼吸道传染病疫情的早期预警和防控提供科学依据。方法采集某战区发热伴呼吸道症状病例咽拭子标本,采用实时荧光定量PCR法对标本进行流感病毒、副流感病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒和冠状病毒5类常见呼吸道病毒及其亚型的检测和鉴定,评价该方法在呼吸道病毒检测中的应用价值。结果利用实时荧光定量PCR法在采集的488份咽拭子标本中筛查出了240份甲型流感病毒阳性标本(其中季节性流感H3亚型71份,其它分型未检出)、7份乙型流感病毒阳性标本,未检出副流感病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒和冠状病毒。结论实时荧光定量PCR法可以对呼吸道病毒进行快速、特异、准确的筛查和鉴定,科学指导部队对呼吸道传染病疫情进行早期防控和预警预测。     

突发性耳聋患者血清中人类巨细胞病毒和单纯疱疹病毒的检测

采用ＰＣＲ和ＥＬＩＳＡ方法对３０例突发性耳聋（突聋）患者血清中人类巨细胞病毒 （ＨＣＭＶ）和单纯疱疹病毒（ＨＳＶ）进行了检测。结果显示：７例（２３％）ＨＣＭＶ ＤＮＡ阳性，４例 ＨＣＭＶ抗体（ＩｇＡ或 ＩｇＭ）升高或 ＩｇＭ升高，２例 ＨＣＭＶ和 ＨＳＶ ＤＮＡ均阳性，相应抗体水平高于 正常，治疗后１月复查部分病例转阴。提示：用ＰＣＲ和ＥＬＩＳＡ方法对突聋患者病毒感染情况的检 测，对于探讨突聋的发病机制和治疗有重要意义。     

腺病毒41型致缺乏腺病毒E_1区的A_(549)细胞产生病变的实验研究

首次报道了腺病毒41型TaK株致缺乏腺病毒E1基因功能的A(549)细胞产生细胞病变。该病变与病毒感染的稀释度存在量一效关系。核酸杂交示1:10与1:20稀释度组病毒核酸含量相近，但明显高于1:50组。免疫荧光技术分析显示各稀释度组病毒蛋白表达起始时相均在病毒感染后的2～3d。     

甲硝唑有效冲洗阑尾切口预防感染的研究

目的:探讨甲硝唑液的有效冲洗在预防阑尾切口感染时的临床疗效。方法:收集607例阑尾切除患者的临床资料予以回顾性分析。结果:单纯性阑尾炎208例,化脓性阑尾炎399例,穿孔合并腹膜炎者58例,阑尾周围脓肿23例;切口感染8例,感染率为1.3%。行脓液细菌培养,其中1例脓液有恶臭,细菌培养阴性,其余细菌培养均为大肠杆菌感染。结论:有效的甲硝唑冲洗切口,及早清除了感染源,有利于抗菌素发挥作用,局部抗炎明显预防了切口感染的机会。     

Epstein-Barr病毒与肝炎病毒在肝细胞癌发生中的作用

目的EBV作为肿瘤相关病毒已获公认,为探讨EBV与HCC的关系及与肝炎病毒有无协同作用,进行本研究.方法采用PCP、RT-PCR及免疫组化方法检测石蜡包埋HCC标本中EBV、HBV、HCV和HDV.结果PCR测HBVDNA(X基因和(或)S基因)阳性率为56.4%(44例/78例),EBVDNA(BaimH I W和(或)LMP1)阳性率为28.2%(22例/78例).RT-PCR测HCV RNA阳性率为5.6%(1例/18例),HDVRNA阳性率为0(0例/18例).免疫组化测EBVLMP1多定位于肿瘤细胞中.结论EBV在HCC组织中有较高的检出率,值得注意;HBV对HCC发生起重要作用,与EBV无明显关系;本地区HCV发病率不高,但其与EBV在HCC发生中有无协同作用值得进一步研究.HDV与HCC无明显关系.     

PCR微板杂交检测生殖器疱疹病毒感染

以 PCR扩增生殖器疱疹病毒 DNA,然后用特异性 DNA探针微孔板检测疱疹病毒扩增产物 ,同时用普通 PCR检测同样的标本。结果 4 3例病例组中 ,PCR微板杂交 35 (83% )例阳性 ,8例 (17% )阴性 ;普通 PCR37(86 % )例阳性 ,6 (14 % )例阴性 ,二者无显著性差异 ;对照组 PCR微板杂交 19例 2例阳性 ,17例阴性。同时 ,普通 PCR则有 5例阳性 ,14例阴性。PCR微板杂交具有快速、灵敏度高、特异性强、抗污染能力强的优点 ,适用于检测可疑 HSV感染 ,具有临床使用价值     

生殖器疱疹实验诊断方法的临床应用探讨

目的 探讨生殖器疱疹实验诊断方法的临床应用价值.方法 采用细胞培养法对82例临床诊断为典型生殖器疱疹的患者进行人类单纯疱疹病毒(HSV)分离培养,并同时进行聚合酶链反应(PCR)检查.结果 两种方法的HSV检出率分别为58.5%和92.6%;培养法作为金标准特异性高,对早期典型水疱检出率高达89.7%;PCR与培养法相比敏感性高,尤其对糜烂或溃疡标本阳性检出率明显高于培养法.结论 培养法适于早期检测,用于生殖器疱疹诊断特异性高;PCR操作具有简便、快速及敏感性高等特点,可用于不同皮损的检测.     

一种培养鉴定风疹病毒的简便试验方法的建立

目的建立使风疹病毒(RV)在Vero细胞(非洲绿猴肾传代细胞株)上产生的细胞病变效应(CPE)易于观察的简便试验方法,以利于病毒的分离、培养与鉴定.方法在RV接种Vero细胞4天后,用不同pH值(4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、7.0)的融合营养液处理细胞,继续按常规条件培养1天后,在倒置显微镜下观察RV引起的特征性CPE-多核巨细胞,染色后计数多核巨细胞的形成率.同时检测在不同条件(融合时间、病毒接种初始滴度)下,多核巨细胞形成率的变化.结果感染RV的Vero细胞经过酸性融合营养液的处理,可出现RV特征性CPE-多核巨细胞.发现在37℃、pH 5.0的酸性融合营养液处理染毒细胞10 min后,继续培养1天,出现的细胞病变形态最典型,染色后计数发现多核巨细胞的形成率最高,为14.7%(P<0.01).融合处理的时间对多核巨细胞的形成率没有影响.随着病毒接种初始滴度的降低,多核巨细胞的形成率也相应降低.结论此方法简单、易行,使RV在Vero细胞上产生的细胞病变清晰易观察.     

肝炎患者TTV感染情况及部分基因序列分析的研究

目的 :新发现的DNA病毒 (transfusiontransmittedvirus简称TTV)被认为是一种新的肝炎病毒。为了研究肝炎患者中TTV的感染情况 ,对 10 8例肝炎患者 (ALT >2 0 0IU/L)进行了TTVDNA的检测。方法 :利用巢式PCR方法扩增TTV基因 ,并对两例TTV分离株的部分基因进行克隆和序列分析。结果 :10 8中有 2 4例TTVDNA阳性 ,阳性率为 2 2 2 % ;在非甲～非庚型肝炎中TTV的阳性率为 3 4 6% ( 9/ 2 6) ;甲型肝炎病例中TTVDNA的阳性率为 9 1%( 1/ 11) ;乙型肝炎病例为 2 3 2 % ( 13 / 5 6) ;丙型肝炎病例 7 1% ( 1/ 14 )。两个TTV分离株 (TTVHN 1AF15 15 3 2 ,TTVHN 2AF15 1683 )的核酸序列与GenBank资料中TTV对应序列的核酸同源性高于 90 %。结论 :TTV病毒可能是非甲～非庚型肝炎的重要致病因子 ,并且能够与甲、乙、丙型肝炎病毒发生重叠感染     

蓝舌病毒HbC株体外增殖和基因组特征

利用Ｖｅｒｏ细胞研究了蓝舌病毒ＨｂＣ株在单层细胞上的增殖特点。证实了：按１ＰＦＵ的感染复数接种该病毒于Ｖｅｒｏ细胞，１６ｈ后即可出现ＣＰＥ；２２ｈＣＰＥ达９５％以上，并在电镜下可见到胞浆中聚集着大量的不同发育阶段的病毒颗粒和典型的晶格状排列的成熟病毒粒子；２４ｈ后细胞出现破碎和大片脱落。结合我室特点，用改良热酚法提取病毒全基因组作凝胶电泳分析，揭示了ＨｂＣ株基因组图谱基本复合已报道的国际标准蓝舌病毒株基因组图谱特征。但是，ＨｂＣ株有两个编码非主要结构多肽的基因Ｍ４和Ｓ１０似与标准株有较明显的差异，故推测ＨｂＣ株可能是一个新的基因型蓝舌病毒。     

用微量板中和试验细胞病变自动定量读数法检测血清中柯萨奇B组病毒抗体

本文报道用微量板中和试验以结晶紫染色固定细胞后在微量酶标自动读数仪上按细胞染色深浅所得不同光密度,自动将细胞病变定量读数记录,检测40例急性病毒性心肌炎患者早期及恢复期血清中柯萨奇B组病毒中和抗体,并与微量板中和试验在倒置显微镜下观察结果相比较。二法总符合率为96.8％,但前法有正确、敏感、重复性强、省时、省视力,能快速阅读结果,又有客观记录可资备查等优点。